劉 飛，王 凡，李聰歌，馬雅雯，朱榮帥，黃瓊波

(洛陽(yáng)師范學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471934)

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)于1959年引進(jìn)國(guó)內(nèi)，因其刺少肉多、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適應(yīng)性較廣、生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益好等眾多優(yōu)點(diǎn)，其養(yǎng)殖規(guī)模迅猛發(fā)展，現(xiàn)已成為我國(guó)重要的冷水性經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。近年來(lái)，隨著人民生活水平和對(duì)優(yōu)質(zhì)魚(yú)肉蛋白需求的日益提高，鱒魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量在2017年已達(dá)到4.146萬(wàn)噸[1]，但仍存在很大的需求缺口。為應(yīng)對(duì)大規(guī)模高密度養(yǎng)殖很可能帶來(lái)的病害頻發(fā)問(wèn)題，開(kāi)發(fā)綠色安全的魚(yú)類保健飼料成為有效的重要途徑。中草藥具有高效、低毒、低殘留等優(yōu)點(diǎn)，作為飼料添加劑在水產(chǎn)動(dòng)物病害防治中具有廣闊的應(yīng)用前景[2-3]。

紅棗又名大棗，其味甘香甜，風(fēng)味獨(dú)特，不僅富含維生素C和多種礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還含有大棗多糖、大棗皂苷、環(huán)磷酸腺苷、蘆丁等多種生物活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化等多樣化功效[4-6]，是藥食兼用的佳品。近些年來(lái)，關(guān)于紅棗提升機(jī)體免疫能力的研究報(bào)道較多，有研究表明大棗多糖能夠刺激哺乳動(dòng)物機(jī)體免疫器官，促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖分化，提高機(jī)體的特異性及其非特異性免疫效應(yīng)[7-10]；而關(guān)于紅棗直接應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖動(dòng)物飼料以增強(qiáng)其機(jī)體免疫力的研究報(bào)道很少見(jiàn)[11]。本試驗(yàn)以虹鱒為試驗(yàn)對(duì)象，研究紅棗提取物飼料添加對(duì)虹鱒幼魚(yú)血清生化指標(biāo)和頭腎免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響，以探討紅棗提取物作為魚(yú)類飼料促免疫功能添加劑的可能性，從而為虹鱒健康綠色飼料研發(fā)和紅棗的應(yīng)用領(lǐng)域拓展提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用虹鱒幼魚(yú)購(gòu)自四川省眉山市東坡區(qū)天貴水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，體形正常，無(wú)病無(wú)畸形。暫養(yǎng)于冷水魚(yú)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)的飼養(yǎng)缸(直徑1 m×高1 m)中備用。參考紅棗在其他動(dòng)物飼料中的適宜添加量[11]，同時(shí)考慮虹鱒的食性及其飼料適口性，選用紅棗20∶1提取物作為試驗(yàn)飼料添加劑，其購(gòu)自陜西森弗天然制品有限公司。

1.2 飼料制作

設(shè)計(jì)以魚(yú)粉和豆粕為蛋白源，豆油和魚(yú)油為脂肪源的虹鱒基礎(chǔ)飼料配方(見(jiàn)表1)，分別添加0%、0.25%、0.5%、1%紅棗提取物配置成4種試驗(yàn)飼料，其中0%為對(duì)照組飼料。飼料原料按比例稱重、粉碎、混勻、加水后使用ZL-600顆粒機(jī)制得顆粒飼料，經(jīng)24 h風(fēng)干后裝入密封袋中，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 虹鱒基礎(chǔ)飼料配方Tab.1 Formula of rainbow trout basic feed

注：飼料原料購(gòu)自中糧飼料(新沂)有限公司，預(yù)混料包括虹鱒所需的維生素和礦物質(zhì)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

暫養(yǎng)14 d后，試驗(yàn)分組前停食24 h，選取大小基本一致(體長(zhǎng)7.2～8.4 cm)、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的虹鱒幼魚(yú)隨機(jī)分成4組，分別投喂添加0%(對(duì)照組)、0.25%、0.50%、1.00%紅棗提取物的4種試驗(yàn)飼料，試驗(yàn)養(yǎng)殖期為56 d，每組設(shè)置3個(gè)平行缸，每缸30尾。每天分3次按體重2%～5%進(jìn)行定時(shí)定點(diǎn)飽食投喂。全天使用氧氣泵增氧和水體循環(huán)過(guò)濾、每天及時(shí)清理殘餌殘?jiān)?、清洗濾材和適量換水，以保持溶氧充足和水質(zhì)良好。飼養(yǎng)期間水溫為11～15 ℃，pH 7.0±0.2，DO>8 mg/L。

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束，停食24 h后，每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)取18尾，測(cè)量體長(zhǎng)、體重，魚(yú)體酒精棉消毒后，尾靜脈采集血液于離心管中，室溫放置1 h，4 ℃過(guò)夜后，3 500 r/min離心15 min，制取血清，每三尾魚(yú)為一個(gè)混合樣(共6個(gè)樣品)保存?zhèn)溆?。同時(shí)試驗(yàn)魚(yú)取血后在冰上進(jìn)行解剖，取頭腎放入無(wú)RNA酶離心管中。所取樣品置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血清生化指標(biāo)的測(cè)定

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、溶菌酶(LZM)活性、酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)活性、以及尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、總蛋白(TP)、補(bǔ)體4(C4)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和白介素6(IL-6)含量等血清指標(biāo)均按照相應(yīng)試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。超氧化物歧化酶(SOD)采用WST-8法進(jìn)行測(cè)定，其試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

1.5 頭腎免疫相關(guān)基因表達(dá)測(cè)定

從-80 ℃冰箱中隨機(jī)選取5個(gè)先前保存?zhèn)溆玫暮琪V頭腎組織，采用總RNA 極速提取試劑盒(上海飛捷生物技術(shù)有限公司)提取RNA。采用東洋紡生物科技有限公司試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄后得到的各樣本的cDNA、目的基因和內(nèi)參基因(EF1 alpha)的上下游引物[12-13](見(jiàn)表2，華大基因合成)，按照Bestar SYBR Green qPCR MasterMix(德國(guó)DBI公司)說(shuō)明書步驟制備20 μL的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，然后放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)伯樂(lè))中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 cycles；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，55～98 ℃(10 s/cycle，0.5 ℃/cycle)。熒光定量PCR結(jié)束之后提取各基因的Cq值，并用2-ΔΔt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)結(jié)果。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab.2 Gene primers used for real-time PCR

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用EXCEL2016進(jìn)行整理，采用SPSS 13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，各指標(biāo)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用LSD法來(lái)分析各濃度處理組與對(duì)照組之間的差異顯著性，P<0.05為存在顯著差異，P<0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅棗提取物對(duì)虹鱒肝腎功能的影響

各試驗(yàn)組GPT和GOT活性、BUN和CREA含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。從表中可看出，除0.25%紅棗提取物組的GOT活性相對(duì)于對(duì)照組有增加外，其他所有三個(gè)濃度的紅棗提取物添加組在這4個(gè)指標(biāo)上均相對(duì)于對(duì)照組呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。其中，與對(duì)照組相比，CREA含量和BUN含量三個(gè)濃度組均出現(xiàn)極顯著下降；GPT活性在0.50%和1.00%紅棗提取物組極顯著下降；GOT活性也在0.50%和1.00%紅棗提取物組出現(xiàn)一定程度的下降，但無(wú)顯著差異。

表3 紅棗提取物對(duì)虹鱒肝腎功能血清指標(biāo)的影響Tab.3 Effects of jujube extracts on liver and kidney function indexes in serum of O.mykiss

注：*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，下同。

2.2 紅棗提取物對(duì)虹鱒血清免疫指標(biāo)的影響

各試驗(yàn)組虹鱒血清中與免疫相關(guān)的8個(gè)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。從表中可以看出，與對(duì)照組相比，ACP和AKP活性在三個(gè)添加紅棗提取物試驗(yàn)組基本均有下降趨勢(shì)(僅0.25%紅棗提取物組ACP略有上升)，但均無(wú)顯著差異。而其他的6個(gè)指標(biāo)在三個(gè)添加紅棗提取物試驗(yàn)組幾乎均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)(除IL-6含量在1.00%紅棗提取物組略有下降外)，并且TP含量在0.25%紅棗提取物組出現(xiàn)顯著增加；LZM活性均顯著高于對(duì)照組；SOD活性在0.50%紅棗提取物組極顯著增加；C4含量在0.25%和0.5%紅棗提取物組均極顯著增加；IL-6含量在0.25%紅棗提取物組顯著增加；TNF-α含量在0.25%和0.5%紅棗提取物組也極顯著增加。

2.3 紅棗提取物對(duì)虹鱒頭腎免疫相關(guān)基因表達(dá)定量分析

SOD、CAT、C3、Factor H、IL-1β和LZM等基因在不同紅棗提取物濃度試驗(yàn)組的表達(dá)情況如下(圖1)。與對(duì)照組相比，SOD、CAT、C3、Factor H、IL-1β和LSZ等基因表達(dá)量除CAT和LZM基因在0.25%紅棗提取物組略有下調(diào)外，其他都呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。所得數(shù)據(jù)在進(jìn)行單因素方差分析后，多重比較結(jié)果表明：與對(duì)照組(0%紅棗提取物組)相比，SOD、IL-1β和C3基因在0.50%和1.00%紅棗提取物組均為顯著或極顯著上調(diào)；Factor H基因在0.50%紅棗提取物組呈顯著上調(diào)；其他試驗(yàn)組各基因表達(dá)量雖也有一定上調(diào)趨勢(shì)，但均不顯著。總體而言，在這六個(gè)基因中，僅CAT和LZM基因未在紅棗提取物添加組出現(xiàn)顯著性上調(diào)。

*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

3.1 紅棗提取物添加對(duì)虹鱒幼魚(yú)血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)水平能夠多角度地反映機(jī)體的健康和營(yíng)養(yǎng)狀況。作為肝腎功能的重要血清指標(biāo)，BUN和CREA含量能反相關(guān)地反映機(jī)體腎臟腎小球的濾過(guò)功能，而GPT和GOT活性能正相關(guān)地反映肝臟受損害的程度。本研究中，除0.25%紅棗提取物組的GOT活性相對(duì)于對(duì)照組有增加外，其他所有三個(gè)濃度的紅棗提取物添加組在這4個(gè)指標(biāo)上均相對(duì)于對(duì)照組呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且大多數(shù)組的多個(gè)指標(biāo)均有極顯著下降(詳見(jiàn)表3)，這說(shuō)明紅棗提取物添加不僅能較大程度地提高機(jī)體腎功能，而且對(duì)肝臟有一定的保護(hù)作用，這對(duì)于屬于肉食性魚(yú)類的虹鱒保持健康狀況極為重要。董立軍等[14]研究表明紅棗濃縮汁能顯著減低血清中的BUN含量；馮鑫歡等[15]的組織學(xué)研究也表明紅棗水提物能有效保護(hù)糖尿病小鼠肝臟和腎臟，以減少損傷，這些均與本研究結(jié)果基本一致，均說(shuō)明紅棗攝入能保護(hù)或改善動(dòng)物體的肝腎組織及其功能。

血清蛋白具有維持滲透壓和pH、運(yùn)輸、調(diào)節(jié)生理作用、免疫作用以及營(yíng)養(yǎng)作用等多種生理功能，因此血清TP含量能間接反映機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)和免疫水平[16]。 AKP和ACP是機(jī)體維持正常生長(zhǎng)和健康所必需的酶，其變化能夠在一定程度上反映吞噬細(xì)胞非特異性免疫能力的強(qiáng)弱[17]。本研究中血清ACP和AKP活性在紅棗提取物各組均與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，表明紅棗提取物添加不能顯著影響其吞噬細(xì)胞非特異性免疫能力。而紅棗提取物組的TP含量在三個(gè)紅棗提取物組均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，且相對(duì)于對(duì)照組TP含量在0.25%組顯著增加。這說(shuō)明一定量的紅棗提取物能通過(guò)增加血清TP含量提高機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)和免疫水平。

3.2 紅棗提取物添加對(duì)虹鱒幼魚(yú)非特異性免疫能力的影響

LZM能專一性水解微生物細(xì)胞壁肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，從而溶解細(xì)菌和抑制微生物生長(zhǎng)，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，血清中LZM活性三個(gè)紅棗提取物組均顯著提高，且頭腎其基因表達(dá)也在較高紅棗提取物添加量的兩個(gè)組呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，這說(shuō)明紅棗提取物添加能明顯增強(qiáng)LZM活性從而提高機(jī)體免疫力。常江等[19]的研究也表明紅棗注射液能使小鼠溶菌酶含量增加，這與本研究結(jié)果具有一致性。而作為生物抗氧化防御系統(tǒng)重要關(guān)鍵酶的SOD和CAT，前者是天然存在的超氧自由基清除因子，將其歧化為過(guò)氧化氫；而后者能催化過(guò)氧化氫分解為水和氧氣，從而最終避免細(xì)胞遭受氧化損傷。本研究結(jié)果中相對(duì)于對(duì)照組，0.50%組血清SOD活性極顯著增加，0.50%和1.00%組頭腎SOD基因表達(dá)極顯著上調(diào),CAT基因表達(dá)也呈上調(diào)趨勢(shì)，這說(shuō)明紅棗提取物添加能強(qiáng)化虹鱒機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)功能。有研究表明，適宜的棗粉添加飼料能顯著提高蛋雞血清總抗氧化能力[10]；紅棗水提物能提高糖尿病小鼠肝臟的SOD活性及其抗氧化能力[9]；以西洋參提取物和紅棗提取物為原料制成復(fù)方制劑對(duì)小鼠連續(xù)灌胃能顯著提高其組織的SOD和CAT活性[20]。這些研究結(jié)果都說(shuō)明紅棗提取物添加能提高動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力，從而增強(qiáng)其非特異性免疫能力。

魚(yú)類補(bǔ)體系統(tǒng)是機(jī)體內(nèi)最為復(fù)雜的限制性蛋白溶解系統(tǒng)，直接參與機(jī)體免疫防御，不論是在先天性免疫，還是獲得性免疫過(guò)程中都有著重要的作用。C3是補(bǔ)體系統(tǒng)的最關(guān)鍵成分，處于補(bǔ)體經(jīng)典、凝集素和旁路三條激活途徑的匯聚點(diǎn)上；C4參與經(jīng)典激活途徑，而Factor H是補(bǔ)體激活家族的調(diào)節(jié)劑的成員[21-23]。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，頭腎C3基因和Factor H基因的表達(dá)量，以及血清C4含量在三個(gè)紅棗提取物添加組均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，且在0.50%組均呈現(xiàn)顯著增加，而當(dāng)添加濃度提高到1.00%時(shí)三個(gè)指標(biāo)均有所回落。這說(shuō)明紅棗提取物添加能通過(guò)提高虹鱒體內(nèi)補(bǔ)體水平來(lái)增強(qiáng)機(jī)體免疫力。

細(xì)胞因子中的促炎性細(xì)胞因子是一類主要由免疫系統(tǒng)細(xì)胞生成的具有許多強(qiáng)大生物學(xué)效應(yīng)的內(nèi)源性多肽，可介導(dǎo)多種免疫反應(yīng)，主要包括TNF-α、IL-1β和IL-6等[24-25]。在本試驗(yàn)中相對(duì)于對(duì)照組,血清TNF-α含量在0.25%和0.50%組顯著增加，IL-6含量在0.25%組顯著增加，頭腎IL-1β基因在0.50%和1.00%組呈極顯著上調(diào)，這些說(shuō)明紅棗提取物添加能激活虹鱒機(jī)體的免疫體系，增強(qiáng)其免疫能力。張慶[26]報(bào)道大棗中性多糖能夠促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分泌IL-1和TNF-α；姬玉潔[27]研究表明較高劑量的發(fā)酵冬棗粉能顯著提高小鼠血清IL-2、TNF-α含量，這些與本試驗(yàn)研究結(jié)果基本一致。由此可見(jiàn)，適量的紅棗提取物添加能通過(guò)提高細(xì)胞因子水平來(lái)促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體免疫能力增強(qiáng)。

4 小結(jié)

綜上，本試驗(yàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適量的紅棗提取物添加能起到顯著增強(qiáng)機(jī)體腎臟功能，保護(hù)肝臟的作用，同時(shí)能顯著提升血清LZM和SOD 活性，TP、C4 、IL-6和TNF-α的含量，以及顯著上調(diào)頭腎的C3、Factor H、IL-1β和SOD基因的mRNA表達(dá)量。