胡 鑫，丁晨雨， 葉 勤，吳榮華,2，張 倩，李 虹，李 云,2

(1.西南大學(xué)動物科技學(xué)院重慶三峽生態(tài)漁業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，重慶 400715；2.淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，重慶 400715；3.西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715；4.重慶市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，重慶 400200)

在魚類運(yùn)輸過程中，使用魚用麻醉劑能明顯減輕魚類的應(yīng)激反應(yīng)，減少經(jīng)濟(jì)損失。目前報道有MS-222(三卡因)、苯佐卡因、丁香酚等近30種藥物可以作為魚用麻醉劑[1]。但是這些藥物在生產(chǎn)中使用時由于有藥物殘留，需要休藥期等問題，存在較大的安全隱患。因此，開展安全、無殘留魚用麻醉劑的研究非常必要。已有文獻(xiàn)表明，CO2對魚類具有麻醉作用[2,3]，與其它鎮(zhèn)靜劑相比較，CO2具有無藥物殘留、無休藥期，對人和環(huán)境無害等優(yōu)點，是一種有著良好發(fā)展前景的魚用麻醉劑[4,5]。迄今，有關(guān)魚類CO2麻醉的報道主要集中在麻醉效果及生理指標(biāo)影響方面[6,7]，針對大宗淡水養(yǎng)殖魚類CO2麻醉的報道較少[8]，尤其是CO2麻醉對魚類神經(jīng)調(diào)控機(jī)制的影響未見報道。

鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)作為大宗淡水養(yǎng)殖魚類之一，在保障水產(chǎn)品供給方面具有重要作用。鮮活鰱運(yùn)輸常使用充氧有水運(yùn)輸，但鰱抗應(yīng)激能力差，在高密度養(yǎng)殖、氣溫氣壓驟變、長途運(yùn)輸、裝卸的情況下，較其它魚類更容易產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致魚體損傷甚至死亡，造成經(jīng)濟(jì)損失。本研究以鰱為對象，研究CO2處理對鰱的麻醉效應(yīng)、血清代謝和應(yīng)激指標(biāo)變化、腦神經(jīng)遞質(zhì)含量和神經(jīng)調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)的影響，為魚類CO2麻醉機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)資料，為鰱?；钸\(yùn)輸技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗鰱體長(15.73 ± 0.81) cm、體重(53.70 ± 8.00) g，購于重慶市沙坪壩區(qū)雙連水庫。暫養(yǎng)15 d后挑選健康且規(guī)格一致的鰱用于實驗。CO2麻醉裝置和工藝參照文獻(xiàn)[8]。實驗前停食24 h，分別置于實驗水體為5 L的密封魚缸并放入溫度為25 ℃的恒溫箱中進(jìn)行實驗。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果確定CO2濃度為(155 ± 15) mg/L開展后續(xù)實驗。

設(shè)兩個處理組，每組設(shè)6個平行，每個平行組5尾魚。第一組CO2麻醉處理，O2初始濃度為(8.46 ± 0.25) mg/L，CO2初始濃度為(155 ± 15) mg/L；第二組充O2處理，O2初始濃度為(9.74 ± 0.65) mg/L。兩組在處理15 h和恢復(fù)通空氣24 h兩個時間點隨機(jī)取9尾魚進(jìn)行取樣。對照組為正常暫養(yǎng)鰱，用開放魚缸持續(xù)通空氣，溶解氧為(7.47 ± 0.55) mg/L，在暫養(yǎng)停食24 h后隨機(jī)取9尾魚進(jìn)行取樣。

1.2 實驗方法

觀察各組鰱的呼吸頻率(次/min)，并記錄其行為狀況。使用PHS-25型精密pH計、便攜FlveGo溶解氧測定儀、FC-100型水中CO2測定儀對實驗前后水體中pH、溶解氧和CO2濃度進(jìn)行檢測。在各時間點采血分離血清，取魚體腦、肝胰臟組織，-80 ℃保存，用于后續(xù)測定。血清鈣離子(Ca2+)、血清鉀離子(K+)、血清乳酸(LD)、血清尿素氮(BUN)、肝糖原(GLY)、腦乙酰膽堿(Ach)含量測定參照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書。魚皮質(zhì)醇(COR)、魚多巴胺(DA)、魚5-羥色胺(5-HT)指標(biāo)測定參照慧嘉生物ELISA試劑盒說明書。

采樣常規(guī)qPCR技術(shù)檢測鰱腦組織kcnk3、kcnk9、hif-1α和epo基因表達(dá)量的變化。NCBI中查找近源物種的基因序列，qPCR引物由Primer Premier 5.0設(shè)計，并由擎科生物技術(shù)有限公司合成(表1)。內(nèi)參基因ef-1α的引物參考丁晨雨等[9]，每個樣品做3個技術(shù)重復(fù)，在95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，退火溫度退火1 min，72 ℃延伸10 min，40個循環(huán)。記錄基因擴(kuò)增曲線及Ct值，用2-ΔΔCT法分析kcnk3、kcnk9、hif-1α和epo基因的表達(dá)變化。

表1 qPCR擴(kuò)增目標(biāo)基因的引物序列Tab.1 Primers of target genes amplification for qPCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010和SPSS 22軟件處理數(shù)據(jù)，單因素方差分析法分析數(shù)據(jù)差異顯著性(P<0.05)，Origin 8.5繪制數(shù)據(jù)柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 CO2麻醉對鰱的呼吸頻率和感覺影響

0.5 h后，正常對照組鰱呼吸頻率(62.87 ± 2.45)次/min，CO2麻醉組鰱呼吸頻率(39.60 ± 5.03) 次/min，顯著降低，且平衡性降低，對聽覺和視覺刺激反應(yīng)也降低。O2處理組0.5 h后，呼吸頻率為(61.73 ± 2.99) 次/min，與正常對照組差異不顯著，對聽覺和視覺反應(yīng)迅速。

2.2 鰱血清生理生化指標(biāo)變化

充CO2、O2處理15 h后兩組鰱血清K+均顯著升高，恢復(fù)充氣后均發(fā)生顯著回降，但CO2組復(fù)蘇后鰱血清K+接近對照組。兩種處理組處理15 h后Ca2+均無顯著變化，恢復(fù)充氣后均發(fā)生顯著性下降(表2)。

表2 O2和CO2處理鰱血清生理生化指標(biāo)和肝糖原變化Tab.2 The Changes of serum physiological and biochemical indexes and liver glycogen of O2 and CO2treatment groups in silver carp

注：同行數(shù)值間上標(biāo)不同字母表示差異顯著顯著(P<0.05)，下同。

兩組鰱血清乳酸(LD)和尿素氮(BUN)水平在處理15 h后均顯著升高，尤其是BUN水平，幾乎達(dá)到對照組(8.97±2.22) mmol/L水平的2～3倍；恢復(fù)充氣后，LD水平和BUN水平仍顯著高于對照組。結(jié)果表明，CO2處理組鰱血清中LD、BUN水平在各個時期均顯著低于充O2處理組(表2)。

血清皮質(zhì)醇(COR)水平在CO2處理組與對照組無顯著差異，而O2處理組鰱血清COR則顯著升高到(94.06±11.46) mg/L，是對照組(39.85±7.30) mg/L的2倍多?；謴?fù)充氣后CO2復(fù)蘇組血清COR水平無顯著變化，O2復(fù)蘇組則顯著降低至正常水平。結(jié)果表明，CO2處理組血清COR水平顯著低于O2處理組(表2)。

2.3 鰱肝糖原的變化

CO2和O2處理后，兩組肝糖原(GLY)含量均顯著降低，恢復(fù)充氣后，CO2復(fù)蘇組仍顯著低于對照組，O2復(fù)蘇組則恢復(fù)至正常含量。結(jié)果表明，CO2處理組GLY含量在各個時期都顯著低于充O2處理組(表2)。

2.4 CO2麻醉鰱腦組織乙酰膽堿、多巴胺和5-羥色胺含量的變化

鰱經(jīng)CO2麻醉后，乙酰膽堿(Ach)含量輕微升高，多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)含量有所下降，下降幅度不大，但經(jīng)過充氣復(fù)蘇后，三種神經(jīng)遞質(zhì)含量均升高，尤其是DA含量顯著升高(表3)。

表3 CO2處理鰱腦組織乙酰膽堿、多巴胺和5-羥色胺的變化Tab.3 The changes of Ach，DA and 5-HT contents of brain tissue of CO2 treatment group in silver carp pg/mg prot

2.5 CO2麻醉后腦神經(jīng)調(diào)控相關(guān)基因kcnk3a、kcnk9、epo和hif-1α表達(dá)的變化

設(shè)鰱腦組織上述基因在正常情況下的表達(dá)量為1，鰱經(jīng)CO2處理后15 h，腦組織kcnk3a、kcnk9、epo和hif-1α各基因相對表達(dá)量分別上調(diào)了123%、158%、366%和22%。復(fù)蘇后kcnk3a、kcnk9和epo基因表達(dá)量發(fā)生顯著性降低，hif-1α基因表達(dá)量與對照組間顯著差異(圖1)。

圖1 二氧化碳處理鰱腦組織kcnk3a、kcnk9、epo和hif-1α基因表達(dá)的變化Fig.1 The changes of gene expressions of kcnk3a，kcnk9，epo and hif-1α of in brain tissue of CO2 treatment group in silver carp CO2處理組表示CO2麻醉處理后15 h，恢復(fù)充氣組表示恢復(fù)充氣后24 h，對照組表示正常充氣對照組。不同小寫字母表示各個基因不同處理方式mRNA差異顯著。

3 討論

3.1 CO2 麻醉對鰱應(yīng)激生理指標(biāo)的影響

神經(jīng)遞質(zhì)Ach、DA和5-HT可能是麻醉的作用靶位[10]，魚類發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時，DA和5-HT含量顯著上升[11,12]。本實驗中鰱在CO2麻醉處理后腦神經(jīng)遞質(zhì)DA和5-HT含量減少，復(fù)蘇后增多，表明CO2可能阻礙鰱腦神經(jīng)遞質(zhì)分泌，阻礙神經(jīng)細(xì)胞突觸間信號傳遞而起麻醉作用。已有的研究表明，魚類受到急性脅迫后在幾分鐘之內(nèi)血液皮質(zhì)醇水平迅速上升，受到慢性脅迫時血液皮質(zhì)醇也會緩慢持續(xù)升高，恢復(fù)到正常水平需要數(shù)小時[13]。因此，COR被廣泛用作魚體應(yīng)激反應(yīng)的量化指標(biāo)[14]。血液COR升高幅度與應(yīng)激因子強(qiáng)度和作用時間呈正相關(guān)[15]。本實驗中CO2處理組鰱血清COR含量輕微升高，而O2處理組顯著升高，表明鰱在CO2麻醉方式下產(chǎn)生的應(yīng)激程度較一次性充O2方式更低。這與黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)和羅非魚(Oreochromisspp.)用其它麻醉劑處理后的結(jié)果相似[16,17]。

3.2 CO2麻醉對鰱血清生化指標(biāo)的影響

本研究中，CO2和O2兩個處理組在15 h時均處于缺氧狀態(tài)，此時機(jī)體為了維持能量需要，肝糖原加速分解產(chǎn)生葡萄糖而導(dǎo)致肝糖原顯著下降?；謴?fù)充氣后，糖原分解速率低于糖原合成速率，糖異生途徑使肝糖原累積。血清中LD是衡量無氧代謝強(qiáng)度的重要指標(biāo)[18]，兩組鰱血清LD含量均顯著升高，鰱的無氧代謝均加強(qiáng)以滿足能量需求，恢復(fù)充氣后供氧充足，但是血液中的LD代謝較慢，需要數(shù)天才能恢復(fù)正常，白斑狗魚(Esoxlucius)、黃顙魚、羅非魚和金鯧(Trachinotusovatus)的研究中均有相似發(fā)現(xiàn)[3,19-20]。相比充O2處理，CO2麻醉處理的代謝物指標(biāo)顯著降低，說明CO2麻醉可以有效降低鰱的新陳代謝，有利于魚體保活。

本研究中，血清K+在兩種處理組均顯著升高，此時水體中溶氧較低，魚體處于缺氧狀態(tài)，加上血清LD升高，均會導(dǎo)致pH下降，此時，K+易從細(xì)胞內(nèi)逸出到細(xì)胞外，從而導(dǎo)致血清K+上升[21]。麻醉處理后血清中含量相對穩(wěn)定，恢復(fù)充氣24 h后，血清Ca2+顯著性下降，推測是由于鰱恢復(fù)后機(jī)體活動增加，細(xì)胞能量代謝加強(qiáng)，神經(jīng)、肌肉細(xì)胞增加了對Ca2+吸收，導(dǎo)致血清Ca2+水平下降。

CO2和O2兩種處理中鰱血清BUN都發(fā)生了顯著升高，表明腎功能出現(xiàn)障礙或部分受損[22]，但CO2麻醉處理鰱血清BUN升高的幅度較充O2處理小，這可能是因為鰱處于麻醉狀態(tài)，氨基酸代謝降低所致，此外鰱的腎臟在缺氧狀態(tài)下可能出現(xiàn)排泄障礙，BUN沒有被有效排出體外使得BUN含量高于正常水平，這與羅非魚的研究結(jié)果一致[23]。

3.3 CO2麻醉對鰱腦組織神經(jīng)調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)的影響

kcnk3a和kcnk9基因均為雙孔K+通道蛋白家族(K2P)成員，是麻醉劑的作用靶點，可被麻醉劑、酸化、低氧和滲透壓等因素調(diào)控[24,25]。本研究結(jié)果顯示CO2麻醉導(dǎo)致kcnk3a和kcnk9基因的表達(dá)量增加，可能激活K2P使K+通道產(chǎn)生了外向電流，造成細(xì)胞膜超級化現(xiàn)象，從而降低了神經(jīng)元的興奮性，減輕了低氧脅迫對鰱神經(jīng)細(xì)胞的損傷，這與氟烷和異氟烷的麻醉研究和缺氧損傷研究結(jié)果一致[26-28]。

本研究發(fā)現(xiàn)鰱經(jīng)CO2麻醉后，水體中溶氧降至(1.07±0.15) mg/L，誘導(dǎo)腦組織中低氧誘導(dǎo)因子hif-1α基因表達(dá)上調(diào)。epo作為促紅細(xì)胞生成素基因，其表達(dá)與釋放受hif調(diào)控[29]，在缺氧條件下，epo產(chǎn)物可以通過激活抗氧化酶活性促進(jìn)神經(jīng)元再生等方式保護(hù)腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞[30]。CO2麻醉后epo顯著上調(diào)了3.66倍，可能因為CO2麻醉造成了鰱缺氧激活了hif-epo調(diào)控通路，hif-1α進(jìn)入細(xì)胞并到達(dá)細(xì)胞核內(nèi)與DNA的缺氧反應(yīng)基因啟動子相結(jié)合，促進(jìn)epo基因轉(zhuǎn)錄[31]，使腦神經(jīng)系統(tǒng)避免低氧損傷，以維持鰱的正常生命活動。

以上研究結(jié)果表明，一定濃度CO2處理對鰱具有麻醉作用。CO2麻醉可能通過降低腦組織神經(jīng)遞質(zhì)含量降低神經(jīng)細(xì)胞興奮性，并激活K+通道產(chǎn)生外向電流，使神經(jīng)細(xì)胞膜超級化，中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到影響，進(jìn)而產(chǎn)生激素分泌紊亂、新陳代謝變慢和應(yīng)激反應(yīng)減緩等效應(yīng)。CO2麻醉對神經(jīng)遞質(zhì)的作用機(jī)制以及低氧誘導(dǎo)信號通路在麻醉過程的作用需要進(jìn)一步的研究。綜上所述，CO2麻醉處理鰱是一種安全有效的方法，較一次性充氧處理，可以顯著降低鰱新陳代謝，有效減緩其應(yīng)激反應(yīng)。