陳文偉，曹建萌，劉志剛，楊 娜，盧邁新

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

羅非魚性成熟時(shí)間早，性成熟后產(chǎn)卵周期短，如果雌雄混養(yǎng)會(huì)因群體內(nèi)自繁進(jìn)而導(dǎo)致人工養(yǎng)殖的羅非魚種群密度過大，規(guī)格參差不齊，極大降低了羅非魚的經(jīng)濟(jì)效益，并且羅非魚雄魚比雌魚更具生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，因此目前羅非魚的商業(yè)化生產(chǎn)往往依賴雄性的單性養(yǎng)殖?，F(xiàn)已有許多方法可控制羅非魚雄性化[1-6]，但在實(shí)際生產(chǎn)過程中都有一定的局限性[7]。

微衛(wèi)星標(biāo)記具有多態(tài)性高、雜合度大、容易擴(kuò)增與檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、親子鑒定、遺傳多樣性分析、動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀的連鎖分析等，羅非魚性別相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)已有大量研究。Lee等[8]利用UNH995與UNH104(189 bp等位基因與Y染色體連鎖)正確地推測(cè)了兩個(gè)尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)家系中95%的雄性和雌性個(gè)體的性別，利用GM354(129 bp雄性獨(dú)有)、UNH168、GM271(121 bp雄性獨(dú)有)和UNH131(193 bp等位基因與Z染色體連鎖，187 bp的等位基因與W染色體連鎖)正確地推測(cè)了一個(gè)奧利亞羅非魚(O.aureus)家系中97%雄性和85%雌性個(gè)體的性別[9]。Khan等[10]發(fā)現(xiàn)UNH995與一個(gè)尼羅羅非魚家系(HRT26)的性別顯著相關(guān)。張庭等[11]在篩選奧利亞羅非魚微衛(wèi)星位點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)UNH168在奧利亞羅非魚家系的雌性個(gè)體中可擴(kuò)增出135 bp和171 bp兩個(gè)條帶，而在該家系雄性個(gè)體中只有171 bp一個(gè)條帶。根據(jù)目前的研究，尼羅羅非魚的性別決定區(qū)域定位于連鎖群(Linkage group,LG)1和LG23上[8,12-15]，而奧利亞羅非魚的性別決定區(qū)域定位于LG1和LG3上[9,16]。本研究擬通過對(duì)不同羅非魚群體遺傳多樣性的分析，以及對(duì)兩個(gè)尼羅羅非魚群體和兩個(gè)奧利亞羅非魚群體性別相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選和分析，以期為今后羅非魚育種以及羅非魚遺傳性別的鑒定提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 羅非魚來源及基因組DNA提取

實(shí)驗(yàn)魚詳細(xì)信息見表1，本實(shí)驗(yàn)所用實(shí)驗(yàn)魚均為混合群體。剪取所有實(shí)驗(yàn)魚尾鰭，浸泡在無水乙醇中于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肈Neasy Blood & Tissue Kit試劑盒(購自北京柏奧易思生物科技公司)提取基因組DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，微量分光光度計(jì)(OSE-260，購自北京天根生化科技公司)檢測(cè)DNA的濃度及純度；用ddH2O將基因組DNA稀釋至終濃度為50 ng/μL，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

1.2.1 兩個(gè)尼羅羅非魚群體及兩個(gè)奧利亞羅非魚群體性別相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的初步篩選

參考羅非魚微衛(wèi)星遺傳圖譜，從LG1、LG3及LG23上選擇24個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，從GenBank上下載這些微衛(wèi)星位點(diǎn)引物序列 ，并由金唯智生物科技公司合成，引物詳細(xì)信息見表2。對(duì)每對(duì)引物的擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化后，在兩個(gè)尼羅羅非魚群體及兩個(gè)奧利亞羅非魚群體中進(jìn)行初步擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括：50 ng/μL DNA模板1 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix for PAGE 10 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR熱循環(huán)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，X ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)為25～28個(gè)，最后72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，產(chǎn)物上樣量為5 μL，50 bp ladder上樣量為3 μL，電泳緩沖液為1×TBE。先使用50 V低電壓電泳30 min，再使用150 V電壓電泳150 min。銀染參考許紹斌等[17]的方法并適當(dāng)調(diào)整，同一位點(diǎn)等位基因由大到小記為A、B、C…。統(tǒng)計(jì)各微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因種類和數(shù)目，并在所選樣本內(nèi)部雌雄群體之間進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，初步篩選跟性別相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記。

1.2.2 初步篩選的微衛(wèi)星標(biāo)記在各群體中的擴(kuò)增驗(yàn)證

在兩個(gè)尼羅羅非魚群體與兩個(gè)奧利亞羅非魚群體中初步篩選到與性別相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記后，在這些微衛(wèi)星標(biāo)記上游引物的5′端添加不同顏色的熒光標(biāo)記序列(FAM,HEX)，統(tǒng)一在全部群體中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增采用降落PCR，PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括：50 ng/μL DNA模板1 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 5 μL，ddH2O 3 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，62～52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1 ℃；之后95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行22～25個(gè)循環(huán)，最后72 ℃末端延伸20 min后，4 ℃保存。帶熒光的PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA測(cè)序儀ABI 3730xl進(jìn)行熒光電泳檢測(cè)，并使用軟件GeneMarker V2.2.0 對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行條帶分型。統(tǒng)計(jì)所有群體的各項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)，并進(jìn)行聚類分析，統(tǒng)計(jì)各微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因種類和數(shù)目，并在兩個(gè)尼羅羅非魚及兩個(gè)奧利亞羅非魚群體內(nèi)部雌雄之間進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，進(jìn)一步篩選跟性別相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用軟件Popgone32和GenAlEx 6.50計(jì)算各微衛(wèi)星位點(diǎn)的觀測(cè)等位基因數(shù)(Ne)、有效等位基因數(shù)(Na)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、香農(nóng)信息指數(shù)(I)、Nei’s遺傳距離和遺傳一致度，并檢驗(yàn)各位點(diǎn)各群體是否偏離哈代溫伯格定律，用軟件PIC-CALC以及Cervus計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)，用POPTREE軟件對(duì)各群體進(jìn)行NJ聚類分析。

表2 24對(duì)微衛(wèi)星引物信息Tab.2 Information of 24 pairs of microsatellite primers

2 結(jié)果與分析

2.1 兩個(gè)尼羅羅非魚群體及兩個(gè)奧利亞羅非魚群體性別相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的初步篩選結(jié)果與分析

將24個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在WN1、WN2、GN1、GN2、WO1、WO2、PO1以及PO2群體中擴(kuò)增，利用Popgene32軟件統(tǒng)計(jì)各微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因種類和數(shù)目，并在所有羅非魚樣本群體內(nèi)部雌雄群體之間進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，最終篩選到UNH931、GM128、GM201、GM258、GM597以及UNH898共6個(gè)與性別相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記。在無錫尼羅羅非魚群體(WN1,WN2)中，UNH898與性別顯著相關(guān)(P<0.05)，GM597與性別極顯著相關(guān)(P<0.01)。在高要尼羅羅非魚群體(GN1,GN2)中，UNH931與性別顯著相關(guān)，GM597、UNH898、GM128與性別極顯著相關(guān)。在無錫奧利亞羅非魚群體(WO1,WO2)中，GM201與性別顯著相關(guān)。在番禺奧利亞羅非魚群體(PO1,PO2)中，GM258、GM597與性別顯著相關(guān)，詳細(xì)結(jié)果見表3。

表3 兩個(gè)尼羅羅非魚群體及兩個(gè)奧利亞羅非魚群體性別相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記統(tǒng)計(jì)Tab.3 Statistics of sex-related microsatellite markers of two O.niloticus populations and two O.aureus populations

2.2 初步篩選到的性別相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記在不同養(yǎng)殖群體中的擴(kuò)增結(jié)果與分析

2.2.1 微衛(wèi)星擴(kuò)增結(jié)果

將初步篩選到的6個(gè)跟性別相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記在全部群體中擴(kuò)增，均可得到相應(yīng)的產(chǎn)物。6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在所有群體297個(gè)樣本中共檢測(cè)到95個(gè)等位基因，其大小在97～302 bp之間，各位點(diǎn)在各群體等位基因數(shù)在1～13個(gè)之間。

2.2.2 群體遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計(jì)

各群體平均觀測(cè)等位基因數(shù)為2.167～9.333，平均有效等位基因數(shù)為1.624～4.966，平均觀測(cè)雜合度為0.324～0.983，平均期望雜合度為0.329～0.782，平均多態(tài)信息含量為0.275～0.753。YY1群體多態(tài)性最低，WY群體多態(tài)性最高，WN1、WN2、GN1、GN2、WY1以及YY2群體達(dá)到高度多態(tài)(PIC>0.5)，WO1、WO2、PO1、PO2、ZY1以及YY1群體為中度多態(tài)(0.25

表4 所有羅非魚群體的平均遺傳多樣性參數(shù)Tab.4 Average genetic diversity parameters for all tilapia populations

2.2.3 遺傳距離、遺傳一致度以及聚類分析

YY1群體與WO1群體間遺傳距離最大(5.404)，遺傳一致度最小(0.005)，因此兩者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。WO2群體與WO1群體之間遺傳距離最小(0.029)，遺傳一致度最大(0.972)，因此兩者親緣關(guān)系最近。無錫尼羅羅非魚群體(WN1,WN2)、高要尼羅羅非魚群體(GN1,GN2)、無錫奧利亞羅非魚群體(WO1,WO2)以及番禺奧利亞羅非魚群體(PO1,PO2)內(nèi)雌雄之間遺傳距離較小，遺傳一致度較大，說明這些群體雌雄之間分化程度不高，詳細(xì)結(jié)果見表5。根據(jù)群體間Nei’s遺傳距離用NJ法得到聚類圖，所有群體聚為兩大支：WO1、WO2、PO1、PO2以及ZY1群體聚為一支，GN1、GN2、WY1、WN1、WN2、YY1以及YY2群體聚為另一支，見圖1。

表5 所有羅非魚群體之間的遺傳距離及遺傳一致度Tab.5 Genetic distance and genetic similarity coefficient among all tilapia populations

注：對(duì)角線以上為遺傳一致度，對(duì)角線以下為遺傳距離。

圖1 所有羅非魚群體的聚類分析圖Fig.1 Cluster dendrogram of all tilapia populations

2.2.4性別相關(guān)微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選

將初步篩選到的6個(gè)與性別相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)一步在12個(gè)群體中擴(kuò)增驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)：GM597與無錫尼羅羅非魚群體(WN1,WN2)、高要尼羅羅非魚群體(GN1,GN2)以及番禺奧利亞羅非魚群體(PO1,PO2)的性別顯著相關(guān)(P<0.05)，鑒別率(鑒別率=群體內(nèi)可準(zhǔn)確鑒定性別的個(gè)體數(shù)/群體內(nèi)個(gè)體總數(shù)×100%)分別為39.1%、60.5%與7.5%；UNH898與高要尼羅羅非魚群體(GN1,GN2)的性別極顯著相關(guān)(P<0.01)，鑒別率為71.1%。將GM597與UNH898聯(lián)合分析可100%鑒定兩個(gè)尼羅羅非魚群體的性別。將GM597與GM258在無錫奧利亞羅非魚群體和番禺奧利亞羅非魚群體中聯(lián)合分析，兩個(gè)群體的雌雄鑒別率分別為33.3%和40.0%。YY1群體中UNH898的基因型與無錫尼羅羅非魚群體及高要尼羅羅非魚群體均不相同，利用UNH898可以100%將YY1群體與兩個(gè)尼羅羅非魚群體區(qū)分開，部分結(jié)果見表6～8。

3 討論

3.1 群體內(nèi)以及群體間的遺傳差異

表4和表5列出了各個(gè)羅非魚群體的遺傳參數(shù)，無錫尼羅、高要尼羅、無錫奧利亞以及番禺奧利亞各個(gè)群體內(nèi)部雌、雄之間各項(xiàng)遺傳參數(shù)(Na、Ne、Ho、He、I、PIC)差別不大，表明這些群體內(nèi)部雌雄之間遺傳多樣性基本相同。無錫尼羅、高要尼羅、無錫奧利亞以及番禺奧利亞各個(gè)群體內(nèi)部雌、雄之間的遺傳距離(0.029～0.198)相對(duì)較小，遺傳一致度相對(duì)較大(0.820～0.972)，表明這些群體內(nèi)部雌雄之間基因組差異較小。董在杰等[18]利用RAPD技術(shù)對(duì)尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚雌、雄群體進(jìn)行分析，結(jié)果表明，奧利亞羅非魚雌雄群體的遺傳多樣性程度接近，而尼羅羅非魚雄性群體的遺傳多樣性要比雌性群體豐富，遺傳變異比雌性群體大，本研究中兩個(gè)奧利亞羅非魚群體的結(jié)果與之一致，而兩個(gè)尼羅羅非魚群體內(nèi)雌、雄之間的遺傳多樣性并無明顯差異，一方面可能是群體差異性導(dǎo)致的，另一方面可能是本研究所選標(biāo)記數(shù)較少的原因。無錫尼羅與高要尼羅雌雄群體的平均多態(tài)信息含量均達(dá)到了高度多態(tài)(0.580～0.729)，說明兩個(gè)尼羅羅非魚群體的遺傳多樣性較高，這一結(jié)果與宋紅梅等[19]在構(gòu)建羅非魚DNA遺傳圖譜時(shí)得到的三個(gè)尼羅羅非魚群體平均多態(tài)信息含量為0.608(達(dá)到高度多態(tài))的結(jié)果相差不大，高于袁文華等[20]在奧尼羅非魚及其親本的微衛(wèi)星分析中尼羅群體的平均多態(tài)信息含量(0.469)。無錫奧利亞與番禺奧利亞雌雄群體的平均多態(tài)信息含量均為中度多態(tài)(0.307～0.354)，說明兩個(gè)奧利亞羅非魚群體的遺傳多樣性中度偏低，這一結(jié)果略高于張庭等[21]對(duì)四個(gè)奧利亞群體進(jìn)行微衛(wèi)星分析時(shí)得到的4個(gè)群體的平均多態(tài)信息含量為0.276(達(dá)到中度多態(tài))的結(jié)果。同種羅非魚不同群體間多態(tài)信息含量的差別可能是不同選育群體之間的遺傳差異性導(dǎo)致的。ZY1、WY1、YY1以及YY2型羅非魚是經(jīng)過激素誘導(dǎo)以及種內(nèi)和種間雜交后得到的羅非魚，目前微衛(wèi)星標(biāo)記在這些群體中研究較少，WY1以及YY2群體的平均多態(tài)信息含量分別為0.753和0.528(達(dá)到高度多態(tài))，說明這兩個(gè)群體遺傳多樣性較高，ZY1以及YY1型羅非魚的平均多態(tài)信息含量分別為0.486和0.275(達(dá)到中度多態(tài))，說明這兩個(gè)群體遺傳多樣性適中。劉志剛等[22]在利用線粒體DNA構(gòu)建羅非魚“粵閩1 號(hào)” 及其繁育群體的NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹時(shí)發(fā)現(xiàn)YY1與YY2群體并沒有聚為一支，而在本研究中YY1與YY2群體在聚類分析中聚為一支，這一結(jié)果可能是線粒體DNA只能通過母系遺傳而微衛(wèi)星DNA可通過父系及母系共同遺傳的差異導(dǎo)致的。

表6 GM597與羅非魚性別的關(guān)聯(lián)分析Tab.6 Sex-related analysis between GM597 and tilapia

表7 UNH898與羅非魚性別的關(guān)聯(lián)分析Tab.7 Sex-related analysis between UNH898 and tilapia

表8 GM597與UNH898在兩個(gè)尼羅羅非魚群體中雌雄鑒別率統(tǒng)計(jì)Tab.8 Statistics on male and female identification rates of GM597 and UNH898 in two O.niloticus populations

3.2 性別相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的分析

本實(shí)驗(yàn)采用兩種實(shí)驗(yàn)方案對(duì)兩個(gè)尼羅羅非魚以及兩個(gè)奧利亞羅非魚群體進(jìn)行性別相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選。第一種實(shí)驗(yàn)方案采用常規(guī)PCR擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)，12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，篩選到與性別相關(guān)的標(biāo)記較多。第二種實(shí)驗(yàn)方案采用降落PCR擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)，毛細(xì)管電泳分離，篩選到與性別相關(guān)的標(biāo)記較少。造成這一差異的原因有兩個(gè)方面：一方面由于所擴(kuò)增的微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性較高，等位基因較為豐富，大量等位基因只相差2 bp，造成基因分型存在不同程度的誤差，另一方面?zhèn)鹘y(tǒng)的PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳相較于降落PCR和毛細(xì)管電泳在實(shí)際操作過程中不可控的因素更多，誤差更大。

采用兩種實(shí)驗(yàn)方案均發(fā)現(xiàn)GM597與無錫尼羅羅非魚群體(WN1,WN2)、高要尼羅羅非魚群體(GN1,GN2)以及番禺奧利亞羅非魚群體的性別顯著相關(guān)(P<0.05)，UNH898與高要尼羅羅非魚群體(GN1,GN2)的性別極顯著相關(guān)(P<0.01)。將GM597與UNH898聯(lián)合分析可100%鑒定兩個(gè)尼羅羅非魚群體的性別，利用UNH898可以100%將YY1群體與兩個(gè)尼羅羅非魚群體區(qū)分開。Eshel等[13,14]研究發(fā)現(xiàn)位于LG23內(nèi) Scaffold 101上長(zhǎng)度為1.5 Mbp的區(qū)域是尼羅羅非魚的一個(gè)性別決定區(qū)域，UNH898與一個(gè)尼羅羅非魚家系的性別極顯著相關(guān)，其276 bp的等位基因是雄性個(gè)體的一個(gè)標(biāo)記。本研究中篩選到的微衛(wèi)星標(biāo)記GM597與UNH898位于該性別決定區(qū)域內(nèi)，因此GM597與UNH898可作為篩選YY1超雄魚的候選標(biāo)記。Sun等[15]篩選到一個(gè)與尼羅羅非魚性別相關(guān)的AFLP標(biāo)記SCAR-5位于上述性別決定區(qū)域附近，后續(xù)可以在該區(qū)域附近開發(fā)多種類型的分子標(biāo)記應(yīng)用到尼羅羅非魚的性別鑒定過程中。目前的研究顯示奧利亞羅非魚的性別決定區(qū)域位于LG1與LG3上[9,16]，本研究發(fā)現(xiàn)位于LG23上的GM597與番禺奧利亞羅非魚群體(PO1,PO2)的性別顯著相關(guān)(P<0.05)，但其雌雄鑒別率只有7.5%，將GM597與GM258在無錫奧利亞羅非魚群體(WO1,WO2)和番禺奧利亞羅非魚群體(PO1,PO2)中聯(lián)合分析，兩個(gè)群體的雌雄鑒別率分別為33.3%和40.0%，均低于50%，可能是樣本量少的原因，導(dǎo)致結(jié)果存在一定誤差。與Lee等[8,9]的研究結(jié)果相比本實(shí)驗(yàn)中并沒有檢測(cè)到UNH995和UNH104與尼羅羅非魚群體的性別相關(guān)，也沒有檢測(cè)到GM354與奧利亞羅非魚群體的性別相關(guān)，這可能是由于不同選育群體之間的遺傳差異性導(dǎo)致的，此外本實(shí)驗(yàn)篩選到的與羅非魚性別相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)量較少，可能與選取的引物數(shù)量相對(duì)較少有關(guān)，后續(xù)可以開發(fā)多種性別相關(guān)的分子標(biāo)記，應(yīng)用到羅非魚的性別鑒定過程中。