張敏娜，鐘 鳴，王光輝

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 日照 276826)

高度惡性腫瘤三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)的生物學(xué)特點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞雌激素受體(estrogen receptor,ER)陰性、孕激素受體(progesterone receptor,PR)陰性和人類表皮生長(zhǎng)因素受體2(human epidemal growth factor receptor 2,HER2)陰性，腫瘤細(xì)胞的增殖不依賴于ER、PR和HER2，缺乏明確的藥物靶點(diǎn)，常規(guī)途徑給藥化療難以奏效，且不良反應(yīng)嚴(yán)重[1]。多柔比星(Doxorubicin，Dox)通過干擾腫瘤細(xì)胞mRNA 和DNA的合成抑制腫瘤增殖。該藥對(duì)S期和M期腫瘤細(xì)胞作用尤為突出，屬廣譜周期非特異性抗腫瘤藥物(對(duì)乳腺癌、急性白血病、肉瘤、惡性淋巴瘤、肺癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤均有作用)，在治療惡性腫瘤同時(shí)對(duì)正常組織細(xì)胞選擇性低，細(xì)胞毒性以造血系統(tǒng)毒性(骨髓抑制)和心臟毒性(心律失常、心肌損傷、心力衰竭等)最為突出。近年來研究發(fā)現(xiàn)，納米遞藥系統(tǒng)顯著改變化療藥物體內(nèi)生物學(xué)特性[2]，尤其降低藥物的細(xì)胞毒性方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[3]。本文就近年來Dox納米遞藥系統(tǒng)在TNBC治療中的應(yīng)用進(jìn)行介紹，為TNBC治療提供參考。

1 納米材料獨(dú)特的生物學(xué)特性及在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用

1976年Birrenbach等人首先提出了納米粒和納米囊的概念，1977年Couvreur等人發(fā)現(xiàn)納米顆粒能夠進(jìn)入細(xì)胞，并具有溶酶體趨向性。1978年Kreuter等人用納米顆粒進(jìn)行了疫苗載體的研究，1979年Couvreur等人用納米材料進(jìn)行抗癌藥物載體的研究，90年代納米技術(shù)研究已成為醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。納米材料在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用包括生物熒光標(biāo)記、病原體檢測(cè)、細(xì)胞及生物分子的分離純化、磁共振成像、靶向藥物/基因傳輸、腫瘤診斷和治療等方面[4]。納米材料主要通過其特有的粒徑效應(yīng)(直徑在1～100 nm范圍)、表面效應(yīng)(拉曼光譜散射)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)介導(dǎo)的超強(qiáng)吸附能力、化學(xué)反應(yīng)能力、分散與團(tuán)聚能力等發(fā)揮作用[5]。

具備靶向藥物/基因傳輸功能的納米遞藥系統(tǒng)應(yīng)用廣泛，發(fā)展較為迅速，早期的納米遞藥系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，通常以脂質(zhì)體為載體，攜帶藥物進(jìn)入體內(nèi)，可減少被單核細(xì)胞吞噬清除的機(jī)會(huì)，藥動(dòng)學(xué)監(jiān)測(cè)顯示藥物在體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)，藥效隨之增強(qiáng)。隨著納米遞藥系統(tǒng)研究的深入，納米材料參與靶向給藥方面取得了很大的成效，可實(shí)現(xiàn)負(fù)載藥物后到達(dá)病區(qū)進(jìn)行集中釋放。近年來隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，納米載體攜帶藥物能有效克服細(xì)胞內(nèi)環(huán)境屏障(如腫瘤病灶周圍的酸性環(huán)境屏障)、病灶區(qū)域滲透壓屏障等順利到達(dá)靶組織/靶細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)藥物緩控釋放，增加了藥物的療效，減少了藥物的不良反應(yīng)。納米技術(shù)引領(lǐng)藥物的遞送向智能化和可視化方向發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了集紫外光激發(fā)光熱效應(yīng)、磁力效應(yīng)、化學(xué)效應(yīng)與一體的藥物治療新策略，實(shí)現(xiàn)了智能化給藥和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，為醫(yī)藥研究的新領(lǐng)域[6,7 ]。

近年來，在腫瘤治療方面，納米材料具有較好的組織相容性，通過腫瘤細(xì)胞過表達(dá)的分子，精準(zhǔn)識(shí)別腫瘤組織，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的攝取，激發(fā)光導(dǎo)熱消融作用殺死腫瘤細(xì)胞，有效遏制腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。納米材料表面的離子體共振波長(zhǎng)可以隨長(zhǎng)寬比變化，實(shí)現(xiàn)了從可見光區(qū)域到近紅外區(qū)域連續(xù)可調(diào)，形成極高的表面電場(chǎng)強(qiáng)度增強(qiáng)效應(yīng)，極大的光學(xué)吸收和散射截面，用于腫瘤診斷、成像、精準(zhǔn)治療和實(shí)時(shí)治療監(jiān)測(cè)[8,9]。

2 多柔比星納米遞藥系統(tǒng)在TNBC中的應(yīng)用

2.1 基于腫瘤酸性微環(huán)境的多柔比星體Dox納米遞藥系統(tǒng)腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME) 由腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)和酸性pH值、乏氧、間質(zhì)液體壓力等因素組成，與腫瘤的增殖、分化和遷移密切相關(guān)。酸性微環(huán)境的形成源于缺氧條件下的腫瘤組織的無氧代謝，缺氧環(huán)境激活糖酵解，通過一系列產(chǎn)生酸的級(jí)聯(lián)生化反應(yīng)形成[10]。pH 值敏感型納米遞藥系統(tǒng)通過pH 值敏感化學(xué)鍵(腙鍵、縮醛鍵、酯鍵、酰胺鍵、肟鍵等化學(xué)鍵)連接Dox，腫瘤酸性微環(huán)境中此鍵斷裂斷裂，釋放藥物，因此腫瘤組織藥物濃度高于正常組織。這種藥物傳遞系統(tǒng)顯著改變藥物的體內(nèi)生物學(xué)特性，尤其在降低藥物的細(xì)胞毒性方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，增效減毒作用的發(fā)揮依賴于惡性腫瘤形成的酸性微環(huán)境，成為抗腫瘤治療的重要研究方向。

TME中酸性pH值和水解酶(蛋白)的過表達(dá)，為Dox靶向納米遞藥系統(tǒng)提供發(fā)揮作用的條件。基于pH反應(yīng)的生物降解多聚谷氨酸(poly glutamic acid，PGA)的Dox納米遞藥系統(tǒng)Dox-PGA，PGA為 pH敏感性連接物，酸性環(huán)境促進(jìn)了納米載體聚合物主鏈的特異性釋放Dox。TNBC小鼠模型經(jīng)靜脈系統(tǒng)Dox-PGA給藥發(fā)現(xiàn)低劑量的Dox對(duì)原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移(降低90%)產(chǎn)生了明顯的抑制效果[11]。Dox-PGA遞藥系統(tǒng)可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)Dox攝取，最大限度的減少正常細(xì)胞對(duì)Dox的攝取，保護(hù)正常組織。納米蛋白交聯(lián)聚合物籠(cross-linked polymer cage，CLPC)一方面借助腫瘤酸性微環(huán)境促發(fā)鏈接Dox的pH值敏感的腙鍵斷裂，在腫瘤局部釋放藥物形成高濃度Dox，進(jìn)而發(fā)揮Dox的抑制和殺滅腫瘤效應(yīng)；另一方面阻止正常細(xì)胞(pH約為7.40)對(duì)Dox攝取。更有意義的是CLPC進(jìn)一步通過改變聚合物籠中交聯(lián)的程度調(diào)整納米載體表面電位，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)調(diào)控Dox納米載體的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)TNBC荷瘤小鼠對(duì)其耐受性良好， Dox血漿半衰期延長(zhǎng)，內(nèi)臟器官蓄積減少，細(xì)胞的毒性降低[12]。

酸性腫瘤微環(huán)境及過表達(dá)特定的酶蛋白(水解酶)、溫度和pH值構(gòu)成了Dox釋放調(diào)節(jié)體系。魚精蛋白中螺旋/α-螺旋構(gòu)象的改變以及蛋白質(zhì)的酶解在酸性環(huán)境和溫度的配合下可有效的調(diào)控表面電荷轉(zhuǎn)化，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)Dox的攝取量。魚精蛋白-PAA-b-PNIPAAm納米凝膠載體，對(duì)溫度、pH和酶等變化因素敏感，其作用機(jī)制與酶蛋白的構(gòu)象調(diào)節(jié)有關(guān)。當(dāng)pH由7.4下調(diào)到5.0過程中，通過酶蛋白的構(gòu)象調(diào)節(jié)引起表面電荷轉(zhuǎn)化逐漸增強(qiáng)， TNBC MCF-7細(xì)胞株對(duì)Dox攝取明顯增加[13]。另外納米粒子可改變某些蛋白酶活性：將膠原酶I固定于納米顆粒(nanoparticles，NPs)表面，膠原酶酶活性明顯提高,有助于Dox穿越組織。 Amoozgar等[14]實(shí)驗(yàn)證實(shí)NPs表面涂覆膠原酶I后降解腫瘤組織膠原蛋白能力增強(qiáng)，Dox的藥物穿透能力進(jìn)一步增加；NPs蛋白質(zhì)涂層降低了Dox的釋放速率，從而能夠持續(xù)緩慢釋放Dox，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，提高藥效。

2.2 組織相容性生物活性增加的多柔比星體Dox納米遞藥系統(tǒng)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和納米磁性混合顆粒LDGI(LDGI由脂質(zhì)體、Dox、金納米棒和氧化鐵納米團(tuán)簇構(gòu)成)構(gòu)成的綜合性納米藥物遞送體系集合光聲成像、靶向熱療和藥物化療與一體，其最為突出的特點(diǎn)是LDGI具有良好的組織相容性，可有效地吸收到MSCs中，維持細(xì)胞功能。此外，LDGI中氧化鐵納米顆粒使MSCs表達(dá)趨化因子受體CXCR4上調(diào)，進(jìn)一步易化與TNBC腫瘤細(xì)胞的識(shí)別,提高了腫瘤治療的靶向性。釋放的Dox進(jìn)入細(xì)胞核增多，有效阻斷腫瘤DNA合成，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Xu等[15]體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與單純LDGI相比，MSCs-LDGI通過腫瘤內(nèi)注射和靜脈注射兩種途徑均能增強(qiáng)Dox在腫瘤組織分散能力和穿透腫瘤細(xì)胞的能力。納米遞藥系統(tǒng)與細(xì)胞膜之間的組織相容性還取決于腫瘤局部形成的滲透壓和藥物本身在腫瘤酸性微環(huán)境中是否帶有電荷等因素的影響，Dox作為一種可電離的弱堿藥物，正常情況下以不帶電的形式自由地滲透細(xì)胞膜，然而，在酸性TME中，Dox表面形成電荷，靜電斥力作用下跨膜過程受阻，由此克服靜電斥力構(gòu)成的電荷屏障增加細(xì)胞相容性成為TNBC治療研究的另一個(gè)方向。Abumanhal等[16]應(yīng)用靜脈注射碳酸氫鹽-脂質(zhì)體-Dox對(duì)TNBC動(dòng)物模型治療結(jié)果顯示，給藥在24 h后在腫瘤組織中檢測(cè)到的脂質(zhì)體的含量為3.7%±0.3%，與注射游離非脂質(zhì)體碳酸氫鹽的對(duì)照組(腫瘤組織的脂質(zhì)體含量0.17%±0.04%)相比，腫瘤組織的脂質(zhì)體含量提高了21倍。進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果顯示，腫瘤內(nèi)pH值達(dá)到7.38±0.04。以上研究結(jié)果證實(shí)碳酸氫鹽-脂質(zhì)體-Dox給藥體系對(duì)TNBC的治療效果優(yōu)于單純Dox給藥和碳酸氫鹽-Dox給藥。對(duì)TME的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)碳酸氫鹽-脂質(zhì)體-Dox給藥體系治療過程中T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量均增加，有效增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的識(shí)別和應(yīng)答能力。

Dox負(fù)載能力的提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制和殺滅具有決定性的意義。由近紅外熒光染料菁5.5(CY5.5)和細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecular-1，ICAM-1)抗體硫醚橋聯(lián)的周期性介孔有機(jī)二氧化硅納米粒(periodic mesoporous organosilica，PMO)構(gòu)成的Dox靶向遞藥系統(tǒng)PMO-CY5.5-ICAM具有良好生物組織相容性，Dox負(fù)載能力提高至400 mg·g-1，共聚焦顯微鏡顯示，Dox能有效靶向進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)Dox在TNBC移植腫瘤組織中累積量大于對(duì)照組，有效遏制腫瘤增殖[17]。

靶向納米遞藥系統(tǒng)增加組織相容性尚需突破其他的限制如藥物靶向分布、細(xì)胞內(nèi)化速度、溶酶體逃逸受限和腫瘤耐藥性等因素。Alimoradi等[18]通過實(shí)驗(yàn)研究聚苯乙烯馬來酸-叔十二烷S-亞硝基硫醇SMA-TDODSNO和 Dox聯(lián)合應(yīng)用對(duì)TNBC腫瘤細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位、溶酶體膜通透性和腫瘤體積變化的影響。結(jié)果SMA-TDODSNO-Dox協(xié)同降低TNBC 4T1細(xì)胞株的細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。4T1細(xì)胞與SMA-TDODSNO-Dox(40 μmol·L-1)共孵育后，細(xì)胞吸收顯著增強(qiáng)，Dox濃度增加了2倍。SMA-TDODSNO單獨(dú)給藥可使腫瘤體積減少為單純Dox組的2倍；SMA-TDODSNO-Dox聯(lián)合應(yīng)用可使腫瘤體積顯著減少為Dox組的4.7倍，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未見可監(jiān)測(cè)的以體重減輕為標(biāo)志的細(xì)胞毒性。

2.3 以腫瘤過表達(dá)的分子為靶點(diǎn)的納米遞藥系統(tǒng)盡管TNBC表達(dá)低或缺乏雌激素、孕酮或Her2/Neu受體，TNBC癌細(xì)胞由于生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移或腫瘤耐藥性的需要，往往過表達(dá)一些分子，可作為腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，為腫瘤診斷提供有價(jià)值參考信息。更重要的是這些分子中，上皮細(xì)胞粘附/激活分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)、CD44受體分子、葉酸受體α(folate receptor α,FRα)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor,TFR)等，可作為納米遞藥系統(tǒng)識(shí)別、穿越腫瘤細(xì)胞的重要靶分子。由靶向EpCAM的銀包覆金納米棒(AuNR/Ag)和負(fù)載Dox組成的靶向納米遞藥系統(tǒng)能夠特異性靶向EpCAM高表達(dá)的腫瘤。該系統(tǒng)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的有效劑量(ED50)為3 μmol·L-1，對(duì)4T1細(xì)胞有效劑量(ED50)為110 μmol·L-1。電感耦合等離子體質(zhì)譜分析結(jié)果顯示表達(dá)EpCAM的TNBC腫瘤細(xì)胞對(duì)Dox攝取速率增加[19]。

CD44受體在前列腺癌、膠質(zhì)瘤和乳腺癌等多種腫瘤中表達(dá)增加，過度表達(dá)CD44受體的腫瘤往往預(yù)后不良。并且，CD44過表達(dá)已在許多不同的癌癥干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)中被發(fā)現(xiàn)，它們存在于許多實(shí)體腫瘤中，并促進(jìn)生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)和對(duì)傳統(tǒng)療法的耐藥性。TNBC中CSCs與腫瘤預(yù)后差、早期復(fù)發(fā)有關(guān)，這是因?yàn)镃SCs具有較高的耐藥性和腫瘤異質(zhì)性，是抗癌治療的主要靶點(diǎn)。包裹金NPs(AuNPs)聚合納米復(fù)合物(polymer nanocomposite，PNC)是由不穩(wěn)定的酸腙鍵與硫代透明質(zhì)酸偶聯(lián)的Dox和硫代聚乙二醇DNA CD44適配體共同組成的遞藥系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，CD44陽性的TNBC細(xì)胞和CD44陰性TNBC細(xì)胞中相比，PNC的攝取量增加1倍，抑制腫瘤細(xì)胞增殖效果更明顯，腫瘤細(xì)胞更新能力下降，且 Dox的效能提高，非靶組織毒性有所減少[20]。

化療是乳腺癌治療的主要策略，缺乏特異性和化療藥物不良反應(yīng)的高負(fù)擔(dān)仍然是乳腺癌患者成功治療的最重要障礙。高親和力FR跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)葉酸至細(xì)胞內(nèi)部， 根據(jù)構(gòu)成FR的糖多肽的不同分為四種亞型：FRα、FRβ、FRγ和FRδ。FRα為葉酸結(jié)合蛋白，以高親和力結(jié)合并將活性形式的葉酸單向轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞。FRα在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌和垂體腺瘤等腫瘤中高表達(dá)，與惡性腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。β-乳球蛋白納米顆粒BNPs共軛葉酸和Dox構(gòu)成遞藥系統(tǒng)FD-BNPs粒徑為(109.77±2.80) nm，具有良好的分散性和穿透細(xì)胞膜能力。包封率為68.82%±1.76%的FD-BNPs對(duì)乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7和MDA-MB-231)的生長(zhǎng)抑制作用和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用顯著?；谶@些發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)D-BNPs具有促進(jìn)藥物釋放和靶向Dox遞送能力，對(duì)乳腺癌和TNBC具有較高的治療潛力[21]。

利用葉酸和/或轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferring ，TF)對(duì)納米材料進(jìn)行功能化，使藥物靶向傳遞更加精準(zhǔn)有效，因?yàn)榘┘?xì)胞過表達(dá)葉酸和TFR，可以介導(dǎo)攜帶藥物的納米遞藥系統(tǒng)的內(nèi)吞作用。對(duì)金納米粒AuNPs經(jīng)葉酸/TF配體修飾后的藥物載體，能夠更加精準(zhǔn)靶向控制藥物的釋放，減少藥物的副作用，提高藥物的療效。Santiago 等[22]在實(shí)驗(yàn)中將Dox加載到葉酸/TF配體修飾后的藥物載體，用超靈敏的表面增強(qiáng)拉曼散射光譜來監(jiān)測(cè)跟蹤其受激釋放情況。研究結(jié)果證實(shí)AuNPs經(jīng)葉酸/TF配體修飾后的藥物載體在不損傷正常細(xì)胞的前提下，對(duì)靶向癌細(xì)胞實(shí)現(xiàn)Dox高劑量給藥，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了腫瘤治療的影像學(xué)監(jiān)測(cè)。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，多柔比星納米遞藥系統(tǒng)作為近年來TNBC治療的新策略，其優(yōu)勢(shì)包括：(1)多柔比星納米遞藥系統(tǒng)在腫瘤酸性微環(huán)境中，實(shí)現(xiàn)了Dox緩釋效應(yīng)和對(duì)腫瘤細(xì)胞的持續(xù)作用。(2)多柔比星納米遞藥系統(tǒng)組織相容性增加，一方面腫瘤細(xì)胞攝入Dox增加，加強(qiáng)化療藥物療效，另一方面正常細(xì)胞吸收減少，明顯減輕藥物的骨髓抑制和心臟毒性等細(xì)胞毒性不良反應(yīng)。(3)納米材料所獨(dú)有的紫外線激發(fā)光熱效應(yīng)殺滅各個(gè)時(shí)期腫瘤細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞和耐藥腫瘤細(xì)胞。(4)納米遞藥系統(tǒng)同時(shí)實(shí)現(xiàn)了免疫系統(tǒng)的激活和腫瘤治療的可視化監(jiān)測(cè)。

當(dāng)前納米遞藥系統(tǒng)存在的問題主要集中在納米材料的材質(zhì)引發(fā)的組織器官的毒性反應(yīng)，主要包括納米材料對(duì)線粒體、游離核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體和細(xì)胞核等重要細(xì)胞器結(jié)構(gòu)損傷和功能的抑制[23]。如納米銀顆粒在體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基導(dǎo)致組織和器官的氧化應(yīng)激損傷[24]，進(jìn)入肝細(xì)胞引發(fā)肝藥酶代謝活力降低導(dǎo)致代謝障礙，干擾轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2所致的蛋白酶表達(dá)異常等[25]。除此之外，納米的組織特異性、對(duì)遞送條件的控制、載體的大小、生物分布率的限制等因素也會(huì)影響攜帶藥物藥效的發(fā)揮。隨著納米技術(shù)構(gòu)筑的載體不斷完善，未來的納米遞藥系統(tǒng)結(jié)構(gòu)上將會(huì)是集合高效性、低毒性和精準(zhǔn)靶向性于一體，功能上實(shí)現(xiàn)納米載體同時(shí)攜帶化療藥物、腫瘤增殖抑制基因片段和免疫增強(qiáng)劑等綜合療法于一體，實(shí)現(xiàn)智能化給藥，通過多途徑、多靶點(diǎn)抑制和殺滅腫瘤細(xì)胞，為TNBC治療和研究帶來新的契機(jī)。