馮 芬，張春平

(南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳與細(xì)胞生物學(xué)教研室，江西 南昌 330006)

脯氨酰寡肽酶(prolyl oligopeptidase，POP)是一種81kDa的單體絲氨酸蛋白酶[1]，是絲氨酸蛋白酶S9家族的成員。POP在生物界中廣泛存在，僅在酵母和放線菌中未檢測到POP活性[2]。人類POP基因由15個外顯子組成[2]。POP在哺乳動物的大腦中高度表達(dá)，主要存在于丘腦和皮質(zhì)的GABA能和膽堿能中間神經(jīng)元中[3]。此外，POP在睪丸，卵巢，肝臟和心臟也有大量表達(dá)。在生殖與發(fā)育方面，人類的初級精母細(xì)胞和精子細(xì)胞的細(xì)胞核中存在大量POP，卵母細(xì)胞和初級卵泡也有POP的表達(dá)[4]，我們前期報道POP表達(dá)于小鼠卵巢壁層顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞和黃體細(xì)胞[5-6]。POP主要通過切割脯氨酸殘基的α-羰基發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[7]。結(jié)構(gòu)研究表明，POP由30 kDa肽酶結(jié)構(gòu)域組成，該結(jié)構(gòu)域含有Ser-His-Asp催化三聯(lián)體，頂部是40 kDa七葉β-螺旋槳結(jié)構(gòu)域，能夠限制底物進(jìn)入大活性部位腔，實驗和計算研究表明，為了調(diào)節(jié)底物進(jìn)入POP的活性位點，這個結(jié)構(gòu)域會發(fā)生大規(guī)模的構(gòu)象變化[8]。新近研究發(fā)現(xiàn)，POP的非酶學(xué)活性也發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)。肝臟中的POP通過調(diào)節(jié)功能性線粒體蛋白和核酸結(jié)合蛋白來影響代謝[9]。在肝星狀細(xì)胞中，POP通過誘導(dǎo)Smad 7和PPAR-γ減少TGF-β超家族成員的信號傳導(dǎo)，表明POP對肝纖維化的保護(hù)作用[10]。

1 POP的功能

1.1 POP的酶學(xué)功能POP作為絲氨酸蛋白酶S9家族中的一員，水解底物一般具有Y-Pro-X結(jié)構(gòu)，X表示除脯氨酸外的氨基酸，Y表示保留的殘基或多肽。POP還可以特異性地水解脯氨酸之外的氨基酸如丙氨酸、絲氨酸、α-氨基、羥脯氨酸和半胱氨酸。POP的水解效率依次為Pro>Ala>Cys>Ser[2]。研究表明其參與了多種肽激素和神經(jīng)肽的成熟和降解，例如促甲狀腺素釋放激素(thyrotropin-releasing hormone，TRH)、血管緊張素(angiotensin，Ang)、精氨酸加壓素(arginine-vasopressin，AVP)、α-黑素細(xì)胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH)、促黃體激素釋放激素(luteinizing hormone-releasing hormone，LHRH)、物質(zhì) P (substance P ，SP)和神經(jīng)降壓素(neurotensin，NT)等[3]。POP是腦脊液中SP降解的主要水解酶。它通過切割P物質(zhì)肽鏈中Pro4-Gln5之間的肽鍵，從而發(fā)揮其水解作用[11]。已知TRH的降解需要四種酶的參與，分別是焦谷氨酰氨肽酶Ⅰ(PAP Ⅰ)、焦谷氨酰氨肽酶Ⅱ(PAP Ⅱ)、甲狀腺激素酶和POP，POP可以使TRH或PAP Ⅰ/PAP Ⅱ/甲狀腺激酶的產(chǎn)物His-Pro-NH2脫酰胺進(jìn)而發(fā)揮水解作用。此外，POP可以通過切割NT分子中的Pro7-Arg8和Pro10-Tyr11之間的肽鍵促使NT降解[11]。POP在血管生成素Ⅰ和血管生成素Ⅱ生成血管緊張素(1-7)的過程中也發(fā)揮重要的水解作用[12]。POP還參與胸腺素-β4的降解，當(dāng)體內(nèi)的POP被抑制時，胸腺素-β4(ThyMosinβ4，Tβ4)的降解產(chǎn)物Ac-SDKP減少[13]。Tβ4-POP-Ac-SDKP軸在促進(jìn)組織愈合和疤痕形成中起重要作用[8,13]。POP的水解活性與底物的磷酸化狀態(tài)有關(guān)，研究表明，如果POP底物絲氨酸的P10殘基發(fā)生了磷酸化，反應(yīng)速率可以提高；而如果絲氨酸未發(fā)生磷酸化，POP甚至不能切割A(yù)la-Ser之間的肽鍵[11]。

1.2 POP的非酶學(xué)功能新近研究表明，POP不僅通過酶學(xué)活性發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，還表現(xiàn)出非酶學(xué)的活性。POP可以負(fù)調(diào)控IP5/6的多肌醇聚磷酸酶(MInsPP)的生成來控制IP3的合成[13]。在帕金森病患者的大腦中，POP可以與α-突觸核蛋白(Synuclein α,αSyn)結(jié)合并能加速αSyn的聚集[14]。同時，POP也是PI3K類自噬通路的負(fù)調(diào)控因子，抑制自噬小體的形成，能減弱自噬小體對αSyn的清除作用[15-16]，因此，POP對αSyn的聚集有雙重作用。多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(dopamine transporter，DAT)負(fù)責(zé)多巴胺再循環(huán)，DAT的功能由幾種不同的機(jī)制調(diào)節(jié)，但DAT內(nèi)化的主要調(diào)節(jié)因子是蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)介導(dǎo)的磷酸化，POP通過影響DAT的磷酸化改變其功能[14]。在胰腺癌細(xì)胞中，POP通過抑制TRS1的降解來增強(qiáng)P13K/AKT通路活性。在SH-SY5Y細(xì)胞系中，POP抑制劑不影響IP3信號傳導(dǎo)，但可以降低p-ERK水平。ERK1 / 2屬于MAPK家族，參與多種細(xì)胞過程，如細(xì)胞增殖和分化[6]。我們新近報道了POP通過激活ERK信號通路促進(jìn)了小鼠黃體細(xì)胞孕酮的分泌[6]。

2 POP異常與疾病

2.1 帕金森病帕金森病(parkinson's disease，PD)是一種神經(jīng)退行性運(yùn)動障礙，涉及多種神經(jīng)系統(tǒng)，其特征是黑質(zhì)(substantia nigra，SN)中的多巴胺能神經(jīng)元丟失，之后形成路易體(Lewy bodies，LBs)。LBs是PD的神經(jīng)病理學(xué)標(biāo)志。PD和其他突觸核蛋白病的發(fā)病機(jī)制主要是αSyn的清除明顯減少和αSyn的錯誤折疊及聚集，αSyn異常能破壞神經(jīng)元的功能并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]。POP不僅具有水解作用，還可以通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮作用。在生理條件下，αSyn主要存在于神經(jīng)末梢突觸前的突觸小泡周圍，與許多促進(jìn)其聚集的突觸體蛋白結(jié)合。POP可以加速αSyn聚集過程，而POP的小分子抑制劑一方面可以減少αSyn寡聚體的形成，另一方面通過自噬作用增加αSyn寡聚體清除作用。自噬是真核細(xì)胞中廣泛存在的一種利用溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)異常蛋白和受損細(xì)胞器的代謝過程，對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起重要作用[17]。因此，POP抑制劑也通過雙重作用抑制αSyn聚集，一方面通過阻斷POP介導(dǎo)的途徑，另一方面通過誘導(dǎo)自噬通量增加[15]。

2.2 腫瘤研究表明POP在許多癌癥中的表達(dá)都會升高，而且在惡性腫瘤中的表達(dá)亦高于良性腫瘤，有文獻(xiàn)報道卵巢上皮癌的惡性程度與POP含量呈正相關(guān)[4]。已知，POP參與血管形成，在惡性腫瘤中，POP通常與Tβ4一起過表達(dá)，Tβ4可被POP水解，進(jìn)而產(chǎn)生血管生成肽Ac-SDKP，促進(jìn)血管生成[18]。POP抑制劑可以抑制人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系NB-1和人胃癌細(xì)胞系KATO的生長。POP抑制劑SUAM-14746與細(xì)胞周期G0/G1阻滯、細(xì)胞核內(nèi)p27kip1水平升高以及pRb2/p130蛋白表達(dá)增加有關(guān)。已知POP是細(xì)胞周期循壞的正調(diào)節(jié)因子，它介導(dǎo)KATO Ⅲ細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的退出或重新進(jìn)入細(xì)胞周期。POP抑制劑不僅阻止細(xì)胞周期的G0/G1期，而且還阻礙S期和G2期及M期的進(jìn)展[19]。除此之外，有體外研究表明抑制POP蛋白酶水解活性可阻止胃癌細(xì)胞的生長[18]。POP抑制劑SUAM-14746以抑制細(xì)胞增殖的方式抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，因此，POP還是用于乳腺癌治療的潛在靶向分子[20]。

3 POP抑制劑潛在的治療前景

研究表明POP參與了廣泛的生理和病理過程，因此POP抑制劑可能成為靶向藥物。POP抑制劑可分為化學(xué)合成抑制劑和天然抑制劑。合成抑制劑又可分為擬肽、雜芳基酮，主要有KYP-2047、JTP-4819、ZPP等；天然抑制劑大多是生物堿，主要有黃芩素、小檗堿等[3,21]。

3.1 JTP-4819JTP-4819，化學(xué)名為左旋-(2S)-芐胺碳?；?[(2S)-2-乙醇酰吡咯烷基]-2-吡咯烷甲酰胺，是一種競爭性可逆抑制劑，具有高度特異性，不會抑制其他脯氨酸特異性酶[3]。JTP-4819可以抑制神經(jīng)肽的降解，如TRH、AVP和SP，從而增加認(rèn)知功能[3,22]，因此被稱為認(rèn)知增強(qiáng)劑。有文獻(xiàn)報道JTP-4819可以治療東莨菪堿誘導(dǎo)的遺忘癥，進(jìn)一步的研究表明發(fā)揮作用的機(jī)制是JTP-4819抑制了POP的水解作用，使大腦中的SP和AVP增加，導(dǎo)致膽堿能釋放增加[21]。在阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)動物模型中，JTP-4819改善了大鼠背側(cè)海馬區(qū)病變的空間學(xué)習(xí)障礙[22]。JTP-4819對神經(jīng)肽能和膽堿能神經(jīng)元的作用，以及對動物記憶障礙的改善，使它成為AD治療的一個方向[3]。在藥物性質(zhì)方面，JTP-4819可以透過血腦屏障，在腦和組織中的藥物濃度幾乎相同。然而，實驗發(fā)現(xiàn)由于JTP-4819的高度親水性，使它很難通過神經(jīng)元細(xì)胞膜，這將降低它在治療神經(jīng)障礙中的作用[3]。

3.2 KYP-2047KYP-2047，化學(xué)名為(2S)-1-[[(2S)-1-(1-氧代-4-苯基丁基)-2-吡咯烷基]羰基]-2-吡咯烷腈，是JTP-4819的衍生物，具有特異性和良好的選擇性[3]。KYP-2047比JTP-4819有更強(qiáng)的透過性，能高效透過血腦屏障并且效果持久，它能均勻地分布在皮質(zhì)，海馬和紋狀體中。相同劑量下，KYP-2047能比JTP-4819更快到達(dá)細(xì)胞內(nèi)作用位點。已知POP促進(jìn)αSyn的錯誤折疊和聚集，KYP-2047不僅可以通過水解POP減弱POP和αSyn之間的共定位阻止αSyn的堆積[14]，還可以上調(diào)自噬的正調(diào)控因子beclin 1，促進(jìn)αSyn聚集體的降解[16]。POP抑制劑KYP-2047對突觸核蛋白及其聚集的顯著影響可能為PD的藥物治療開辟新途徑。此外，POP參與Ac-SDKP的產(chǎn)生，KYP-2047還能通過抑制Ac-SDKP的生成進(jìn)而影響新血管的形成[3]。

3.3 ZPPZPP，化學(xué)名為N-芐氧酰基羰-脯氨酰-脯氨酸，是人們發(fā)現(xiàn)的第一種有效的POP特異性抑制劑[3]。ZPP是一種競爭性抑制劑，IC50=0.74 nmol·L-1，它與POP結(jié)合后不僅能在空間上阻斷POP活性位點的疏水性頭部，而且與催化結(jié)構(gòu)域的SER554殘基形成可逆的共價半縮醛鍵[23]，干擾POP的作用。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)是一種糖酵解蛋白，不僅可以產(chǎn)生能量，而且還是一種多功能酶[3]。在特定情況下，GAPDH經(jīng)凋亡因子誘導(dǎo)后會過表達(dá)，繼而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，最后引起細(xì)胞死亡。ZPP可以通過阻止GAPDH易位至細(xì)胞核中發(fā)揮作用。已知GAPDH可以和某些神經(jīng)變性疾病的蛋白質(zhì)結(jié)合，如AD中的β-淀粉樣蛋白前體蛋白和亨廷頓病(Huntington's disease，HD)中的聚谷氨酰胺重復(fù)序列[3]。因此，ZPP也可能成為神經(jīng)相關(guān)性疾病的治療藥物目標(biāo)。

3.4 小檗堿將天然產(chǎn)品用于醫(yī)療方面在國際上越來越受歡迎，藥用植物是藥物研究和開發(fā)的重點對象，因為它們能產(chǎn)生具有各種各樣生物活性的化學(xué)分子。小檗堿是一種異喹啉生物堿，可以從許多藥用植物中分離。它是POP的非共價抑制劑，IC50=145 μmol·L-1。小檗堿作為一種天然藥品有很多優(yōu)點，如易溶于水，毒性小，易通過血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Aβ是AD病理生理學(xué)中最重要的標(biāo)志之一，β-淀粉樣蛋白前體蛋白裂解酶1是生成Aβ過程中的限速酶，小檗堿可以下調(diào)β-淀粉樣蛋白前體蛋白裂解酶1[3]，這表明小檗堿可能成為AD治療的靶標(biāo)。研究表明，小檗堿類似物有更好的抑制效果。由于小檗堿是一種天然化合物，所以它為治療神經(jīng)精神疾病開辟了新的視角[4,12]。小檗堿還具有多種藥理作用，對心血管疾病、糖尿病、高脂血癥、癌癥、腹瀉和阿爾茨海默病等疾病都有治療作用[24]。

3.5 黃芩素黃芩素(5，6，7-三羥基黃酮)是從黃芩中分離出的主要類黃酮，可以到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有一定的劑量依賴性[25]。由于黃芩苷是黃芩素的前藥，所以這兩種化合物都能夠特異性抑制POP。黃芩苷及其糖苷配基衍生物黃芩素的IC50相似，表明糖部分不參與黃芩苷與POP的相互作用。通過對體外胃腸道和血腦屏障吸收途徑的研究發(fā)現(xiàn)黃芩素才是實際到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用的分子，因此，黃芩苷是一種能夠抑制POP的新型前藥[25]。黃芩素可以影響多因素神經(jīng)退行性疾病，如AD和PD。在AD中，黃芩素不僅可以預(yù)防Aβ-肽的纖維形成和寡聚化，還能夠解聚已形成的纖維蛋白。在PD中，黃芩素具有抑制αSyn聚集的能力，在神經(jīng)傳遞，膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和突觸維持中發(fā)揮重要作用[3]。

4 結(jié)語

POP與多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，但是除了αSyn，POP對其他神經(jīng)性疾病的作用機(jī)制尚未研究清楚。POP在腫瘤的發(fā)生中也起重要作用，使POP抑制劑成為研究的熱點。POP抑制劑種類雖多，但不同抑制劑發(fā)揮作用的位點及抑制效果有很大差異。關(guān)于POP在生理和病理中的作用以及POP抑制劑的開發(fā)需要進(jìn)一步的探索。