張 泰，李瑞瑋，楊麗菁，郭 玲

云南省第三人民醫(yī)院 1科教科 2婦科，昆明 650011

體外受精(invitrofertilization，IVF)—胚胎移植是治療不孕癥最常用的手段，隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，目前單囊胚移植周期的臨床妊娠率可達(dá)60%以上，然而活產(chǎn)率卻只有50%[1]。成功的妊娠離不開(kāi)高質(zhì)量的胚胎，同時(shí)也受子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎著床的接受能力，即子宮內(nèi)膜容受性的影響。IVF妊娠失敗原因近70%因子宮內(nèi)膜因素造成[2]。若能準(zhǔn)確評(píng)估患者的子宮內(nèi)膜容受性將會(huì)極大地改善IVF最終臨床結(jié)局。長(zhǎng)期以來(lái)，可編碼蛋白的基因是研究生長(zhǎng)、發(fā)育及疾病探索的重點(diǎn)。然而，基因測(cè)序分析顯示，人類基因組中僅有不到10%的基因負(fù)責(zé)編碼蛋白質(zhì)的合成[3]。多種研究明確指出，不編碼蛋白質(zhì)的RNA，即非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)廣泛存在于細(xì)胞中，且有著不可或缺的作用。眾多的ncRNA根據(jù)形狀、功能及分子大小的不同又可細(xì)分為：核糖體RNA、小核RNA、小干擾RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、微小RNA(microRNA，miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，lncRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)等[4]。近年來(lái)，表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平的大量研究證實(shí)，ncRNA參與對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控，并對(duì)生長(zhǎng)、發(fā)育以及疾病的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用[5-7]。

miRNA與子宮內(nèi)膜容受性

miRNA是一類內(nèi)源性的、長(zhǎng)度約22 nt的非編碼RNA[8]，廣泛存在于各種生物中，能與mRNA結(jié)合阻斷編碼蛋白的基因表達(dá)。近年來(lái)，隨著對(duì) miRNA研究的不斷深入，其作用機(jī)制及功能日漸明了。單個(gè)miRNA分子可以影響多個(gè)基因的表達(dá)，單個(gè)基因的表達(dá)也可以被多個(gè)miRNA分子調(diào)控，miRNA與其調(diào)控的靶基因之間存在著相互作用關(guān)系[9]。

大量研究表明，miRNA對(duì)調(diào)控子宮內(nèi)膜容受性及胚胎植入過(guò)程中的相關(guān)因子發(fā)揮重要的作用。子宮內(nèi)膜是雌激素和孕激素直接作用的靶器官，雌激素和孕激素也是胚胎著床過(guò)程中發(fā)揮主要作用的激素。Lessey[10]研究顯示，正是通過(guò)miRNA途徑使機(jī)體的雌激素及孕激素對(duì)子宮內(nèi)膜容受性產(chǎn)生了影響，并且通過(guò)對(duì)雌激素、孕激素及子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖的調(diào)控，才讓胚胎得以成功植入。黏蛋白(mucin，Muc)1存在于子宮上皮細(xì)胞表面，并作為抗黏連分子阻止胚胎附著于子宮內(nèi)膜[11-13]。Inyawilert等[14]研究顯示，let-7的兩種同源體let-7a與let-7b共同調(diào)控子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞黏附性，并且發(fā)現(xiàn)Muc1是let-7a/b的下游靶點(diǎn)，它們分別與Muc1的3’UTR區(qū)域互補(bǔ)來(lái)抑制其基因表達(dá)，從而增加子宮內(nèi)膜容受性。

另一方面，胚胎著床的關(guān)鍵還在于胚胎對(duì)著床位點(diǎn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)作為催化細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要酶之一，在胚胎著床過(guò)程中扮演著不可或缺的角色。Chen等[15]對(duì)需要IVF-胚胎移植治療的患者研究顯示，在植入窗口期(window of implantation，WOI)，孕酮提高的女性子宮內(nèi)膜細(xì)胞中miR-125b的表達(dá)顯著上調(diào)，并在體外表現(xiàn)出孕酮依賴性，同時(shí)，細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)和小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，miR-125b表達(dá)高低依賴于孕酮水平和胚胎著床受損程度的高低，miR-125b可在體內(nèi)和體外顯著下調(diào)人MMP26，進(jìn)而抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移和侵襲，導(dǎo)致胚胎附著和子宮內(nèi)膜侵襲能力下降。另有研究者通過(guò)人類絨毛膜細(xì)胞系和人子宮內(nèi)膜細(xì)胞系構(gòu)建人胚胎植入的體外模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多氯聯(lián)苯可通過(guò)調(diào)控mir-30d表達(dá)下調(diào)及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)過(guò)程造成子宮內(nèi)膜容受性的損傷，而在瞬間轉(zhuǎn)染mir-30d模擬物后，多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的EMT標(biāo)記被抑制，進(jìn)而使mir-30d靶向EMT過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子Snai1表達(dá)升高，使模型中人類絨毛膜細(xì)胞損傷部分恢復(fù)[16]。2017年，一項(xiàng)對(duì)7名反復(fù)植入失敗(recurrent implantation failure，RIF)患者和5名經(jīng)胚胎移植后懷孕并分娩的不孕患者分別取WOI的子宮內(nèi)膜進(jìn)行基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，存在105個(gè)差異表達(dá)的miRNA，隨后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)驗(yàn)證其中18個(gè)miRNA的表達(dá)水平證實(shí)與芯片結(jié)果一致，進(jìn)一步生物信息學(xué)分析顯示，has-miR-145、hsa-miR-374、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-429和hsa-miR-5088可能與RIF患者較低的子宮內(nèi)膜容受性有關(guān)[17]。

此外，女性生殖系統(tǒng)生理病理過(guò)程與miRNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控也有著密切關(guān)系[18]。Zhou等[19]通過(guò)基因芯片比對(duì)3例輕度子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)不孕女性和3例無(wú)疾病不孕女性的在位子宮內(nèi)膜樣本，結(jié)果顯示存在66個(gè)差異顯著的miRNA，經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，miR-196a可通過(guò)分裂原活化抑制劑/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)通路介導(dǎo)輕度子宮內(nèi)膜異位癥患者在位子宮內(nèi)膜的異常孕酮受體，使其表達(dá)下調(diào)，發(fā)生子宮內(nèi)膜異位癥孕酮抵抗。Di Pietro等[20]研究顯示，慢性子宮內(nèi)膜炎患者其子宮內(nèi)膜和血清中的miR-27a-3p和miR-124-3p表達(dá)上調(diào)且分別與胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin like growth factor，IGF)1和白細(xì)胞介素11的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；同時(shí),生存曲線分析顯示miR-27a-3p和miR-124-3p可作為子宮內(nèi)膜容受性新的潛在分子標(biāo)志物。這些研究成果揭示了miRNA可作為子宮內(nèi)膜容受性評(píng)估及診療的一個(gè)強(qiáng)有力的突破點(diǎn)。

lncRNA與子宮內(nèi)膜容受性

lncRNA是一類長(zhǎng)度大于200 nt的非編碼RNA。長(zhǎng)期以來(lái)lncRNA被認(rèn)為是低表達(dá)且不參與蛋白質(zhì)編碼的轉(zhuǎn)錄“噪音”。lncRNA幾乎涉及人類生物學(xué)的各個(gè)方面。按基因組中l(wèi)ncRNA所在位置和背景的不同，將其分為5種：正義鏈lncRNA、反義鏈lncRNA、雙向lncRNA、內(nèi)含子區(qū)lncRNA和基因間區(qū)lncRNA[21]。此外，在多種組織和細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)lncRNA的存在，其中大部分lncRNA分布于細(xì)胞核中，也有部分存在于胞漿中，甚至在細(xì)胞核與胞漿中同時(shí)存在[22]。

研究表明lncRNA在子宮內(nèi)膜的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)生了差異性表達(dá)，并且通過(guò)不同機(jī)制在疾病基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用。Sigurgeirsson等[23]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)7名健康女性增生期和WOI的子宮內(nèi)膜進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜組織中有516個(gè)lncRNA顯著差異表達(dá)，其中177個(gè)lncRNA在增生期表達(dá)較高，339個(gè)在WOI的表達(dá)較高。Fan等[24]通過(guò)基因芯片技術(shù)，對(duì)比5例移植后懷孕患者的子宮內(nèi)膜組織與7例RIF患者子宮內(nèi)膜組織中l(wèi)ncRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示RIF的組織中有197個(gè)lncRNA表達(dá)異常(包括132個(gè)lncRNA上調(diào)及65個(gè)lncRNA下調(diào))，對(duì)其中異常表達(dá)的8個(gè)lncRNA表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致。2018年，有研究對(duì)3例進(jìn)行人工授精患者和3例RIF患者的分泌中期子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)兩者間存在742個(gè)差異lncRNA(335個(gè)上調(diào)、407個(gè)下調(diào))及460個(gè)差異mRNA(199個(gè)上調(diào)、261個(gè)下調(diào))，其中10個(gè)lncRNA及6個(gè)mRNA經(jīng)20例RIF患者與30例對(duì)照患者樣本采用qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示有148個(gè)lncRNA可能通過(guò)順式調(diào)節(jié)147個(gè)mRNA影響子宮內(nèi)膜容受性[25]。

另一方面，測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)的進(jìn)步使基因研究更加準(zhǔn)確高效，有研究者構(gòu)建植入失敗相關(guān)的lncRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(implantation failure related lncRNA-mRNA network，IFLMN)，通過(guò)拓?fù)浞治?、聚類分析及共表達(dá)分析篩選IFLMN中的6個(gè)關(guān)鍵lncRNA(NONHSAT083203.2、NONHSAT212577.1、 NONHSAT035952.2、NONHSAT193031.1、NONHSAT053761.2和NONHSAT 025064.2)，并且驗(yàn)證它們?cè)赗IF患者子宮內(nèi)膜中呈高表達(dá)，隨著進(jìn)一步構(gòu)建這6個(gè)lncRNA的內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)子網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)它們與子宮內(nèi)的免疫活性、生長(zhǎng)因子結(jié)合、血管增生、細(xì)胞凋亡及類固醇合成關(guān)系密切，并為胚胎植入的子宮內(nèi)膜做準(zhǔn)備[26]。因此，這6個(gè)lncRNA或能成為檢測(cè)和診斷子宮內(nèi)膜容受性的生物標(biāo)志物。lncRNA H19作為最早發(fā)現(xiàn)的lncRNA之一，已被證實(shí)其在細(xì)胞核和胞漿中同時(shí)存在，在胚胎時(shí)期和病理狀態(tài)下發(fā)生高表達(dá)，出生后在大多數(shù)組織中表達(dá)降低[27]。Ghazal等[28]研究顯示，EMs患者子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖能力下降可能是因?yàn)閘et-7的表達(dá)升高，抑制了IGF1受體的表達(dá)，同時(shí)，在位內(nèi)膜中l(wèi)ncRNA H19的低表達(dá)作為let-7表達(dá)升高的原因也進(jìn)一步揭示EMs患者內(nèi)膜容受性的損傷很可能是由H19/Let-7/IGF1受體途徑調(diào)節(jié)。大量對(duì)lncRNA的研究揭示了新的基因調(diào)控通路，或許會(huì)成為研究子宮內(nèi)膜容受性的基礎(chǔ)。

circRNA與子宮內(nèi)膜容受性

circRNA是新發(fā)現(xiàn)的一類具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，長(zhǎng)度從幾百到幾千個(gè)堿基[29]，沒(méi)有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴，并以共價(jià)鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)，耐受核酸外切酶剪切，大量存在于真核轉(zhuǎn)錄組中。circRNA主要存在3種作用機(jī)制：作為ceRNA、與蛋白質(zhì)相互作用以及翻譯蛋白質(zhì)。

circRNA在不同物種中具有保守性，并相對(duì)線性RNA有更高的穩(wěn)定性，這些特性使circRNA具有可開(kāi)發(fā)疾病新型診斷與治療方法的巨大潛力。Liu等[30]通過(guò)基因芯片比對(duì)3例RIF患者子宮內(nèi)膜組織與3例有過(guò)至少1次生育史的可育女性子宮內(nèi)膜組織circRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示存在856個(gè)差異circRNA(423上調(diào)、433下調(diào))，通過(guò)qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證及生物信息學(xué)分析顯示，其中兩個(gè)上調(diào)的circRNA：hsa_circRNA_070616與hsa_circRNA_103716可能是作為hsa-miR-574-5p的分子海綿，但其是否對(duì)子宮內(nèi)膜容受性形成過(guò)程發(fā)揮作用尚有待進(jìn)一步地驗(yàn)證。有研究對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞用米非司酮培養(yǎng)處理后，再與人臍帶華通氏膠間充質(zhì)干細(xì)胞(Wharton’s jelly derived mesenchymal stem cells，WJ-MSCs)共培養(yǎng)，通過(guò)基因芯片比對(duì)有無(wú)WJ-MSCs共培養(yǎng)處理的兩組樣品cricRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示7757個(gè)circRNA存在差異表達(dá)(5423上調(diào)、2334下調(diào))，隨后選取差異倍數(shù)最大的9個(gè)circRNA進(jìn)一步驗(yàn)證，證實(shí)有7個(gè)circRNA在共培養(yǎng)組中顯著上調(diào)，其中hsa_circ_0111659的表達(dá)變化呈現(xiàn)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低；同時(shí)，生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)到hsa_circ_0111659與miR-17-5p、miR-20b-5p和miR-93-5p均存在靶向關(guān)系以及結(jié)合位點(diǎn)，這可能是circRNA作為miRNA的分子海綿競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，從而抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子相關(guān)mRNA的降解[31]。隨著研究人員越來(lái)越關(guān)注circRNA，相關(guān)研究報(bào)道也在不斷出現(xiàn)，相信circRNA在未來(lái)子宮內(nèi)膜容受性的機(jī)制與診治中將發(fā)揮更大作用。

結(jié) 語(yǔ)

現(xiàn)階段預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜容受性的主要方法是采用陰道超聲評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜的厚度、容積、分型、血流灌注及激素水平檢測(cè)等，但是經(jīng)過(guò)超聲和激素水平檢測(cè)判斷適合移植的患者中，胚胎移植的成功率僅在50%左右[2]，因此需要更好的手段準(zhǔn)確判斷子宮內(nèi)膜容受性。市場(chǎng)上已出現(xiàn)檢測(cè)子宮內(nèi)膜容受性的芯片產(chǎn)品，判斷其是否處于適合移植的階段(陰道超聲亦可實(shí)現(xiàn)這種判斷)，所以并沒(méi)有真正解決在不同患者間即使子宮內(nèi)膜處于適宜條件下移植失敗率仍較高的問(wèn)題。

目前，子宮內(nèi)膜容受性與miRNA方面的研究為今后miRNA對(duì)胚胎植入的探索提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)的主要方向，但要將miRNA用于臨床作為非侵入性指標(biāo)，還需要大量的循證醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。而對(duì)子宮內(nèi)膜容受性在lncRNA和circRNA方面的研究大多還停留在組織學(xué)階段，影響子宮內(nèi)膜容受性形成機(jī)制的相關(guān)報(bào)道還較少，部分研究結(jié)果尚存在爭(zhēng)議，其具體功能和作用機(jī)制還不清楚，還需要開(kāi)展大量實(shí)驗(yàn)，以求篩選出更多與胚胎植入過(guò)程密切相關(guān)的ncRNA分子。同時(shí)，驗(yàn)證已篩選出的ncRNA分子，并研究它們?cè)谧訉m內(nèi)膜容受性形成過(guò)程中的具體作用機(jī)制，將來(lái)能為臨床提供具體的治療靶點(diǎn)?？傊?，隨著研究的不斷深入，子宮內(nèi)膜容受性以及胚胎植入領(lǐng)域中ncRNA的作用必將越來(lái)越清晰。