黃偉嘉 李培瑋 邱小明

1 TBX5的概述

T-box轉(zhuǎn)錄因子（T-box transcription factor gene,TBX）基因擁有一個(gè)共同的DNA結(jié)構(gòu)域T-box，作為一種高效的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子可編碼一系列調(diào)節(jié)進(jìn)化保守的涉及器官發(fā)生和發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，并且相同基因的不同選擇性剪切亞型在細(xì)胞增殖中起到不同作用[1]。TBX家族的基因突變可能導(dǎo)致發(fā)育綜合征，而目前越來(lái)越多的研究支持這些變化在某些癌癥中發(fā)揮一定作用[2]。以往對(duì)于TBX家族基因的研究?jī)H涉及器官發(fā)育[2-5]，但是目前已有少量學(xué)者開始研究TBX家族的基因在正常和癌癥組織中的表達(dá)水平[6,7]，并由此探究其作為生物標(biāo)志物在肺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制中的作用。

TBX2亞家族（TBX2-5）在人體組織中均有表達(dá)，TBX5在心臟、肺、前肢、食管、膀胱、乳腺、前列腺和甲狀腺等組織中均有表達(dá)，而TBX5在正常心臟和肺組織中表達(dá)水平最高[8]。TBX5在肺芽的發(fā)展中有直接的作用，TBX4和TBX5通過成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10（fibroblast growth factor 10, FGF10）信號(hào)通路的激活共同調(diào)控肺分支的形態(tài)發(fā)生[3]。TBX5的異位表達(dá)和過表達(dá)會(huì)抑制集落形成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，在正常細(xì)胞中的表達(dá)可使發(fā)育受阻，在癌細(xì)胞中的表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移[9,10]。

目前，TBX5被認(rèn)為參與到了食管腺癌和結(jié)腸癌的發(fā)生過程[11,12]。Palles等[13]通過全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)TBX5（rs2701108）與Barrett食管和食管腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。而與編碼Barrett食管轉(zhuǎn)錄因子的基因也參與到了胸廓、膈肌和食管的發(fā)育中。Becker等[11]的研究同樣證實(shí)了rs2701108在Barrett食管和食管腺癌發(fā)生中的作用，推測(cè)TBX5在膈肌的組織的發(fā)育過程中起重要作用，而TBX5基因突變可能導(dǎo)致食管裂孔疝進(jìn)而導(dǎo)致胃食管反流病，最終導(dǎo)致Barrett食管進(jìn)展為食管腺癌。此外，β-catenin-TBX5復(fù)合體（Yes-associated protein 1, YAP1）在β連環(huán)蛋白（β-catenin）驅(qū)動(dòng)的癌癥，特別是結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[12]。

啟動(dòng)子甲基化被認(rèn)為是抑制腫瘤相關(guān)基因尤其是抑癌基因失活的主要機(jī)制之一，伴隨著基因的改變，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[14-17]。TBX5甲基化可在68%的原發(fā)性結(jié)腸癌中檢測(cè)到，同時(shí)與總生存不佳顯著相關(guān)（P=0.000,7）。TBX5在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平很低，甚至不表達(dá)，而TBX5的再表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖（P＜0.001）和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡（P＜0.01）。TBX5通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶抑制劑2A（cyclindependent kinase inhibitor 2A, CDKN2A）和轉(zhuǎn)移抑制因子1（metastasis suppressor 1, MTSS1），下調(diào)γ-神經(jīng)突觸核蛋白（synuclein gamma, SNCG）、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因2（metastasis-associated 1 family member 2, MTA2）來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。TBX5通過外源性凋亡途徑與B淋巴瘤-2基因相關(guān)X蛋白（BCL2-associated X protein, BAX）和顆粒酶A的表達(dá)水平誘導(dǎo)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞凋亡[10]。因此，TBX5甲基化程度可能是反映結(jié)腸癌患者生存的預(yù)測(cè)因子。

此外，微小RNA-10b（microRNA-10b, miR-10b）的上調(diào)與腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)[18,19]。miR-10b通過抑制轉(zhuǎn)錄因子TBX5的表達(dá)，進(jìn)而抑制抑癌基因雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶1A基因（gene of dual specificity tyrosine phosphorylation regulated kinase 1A,DYRK1A）和與張力蛋白同源在10號(hào)染色體有缺失的磷酸酶基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN）的表達(dá)，最終促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。而臨床結(jié)果[20]也證實(shí)，相較于TBX5高表達(dá)的乳腺腫瘤患者而言，TBX5低表達(dá)患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存和總生存更差。不過在I期和II期的胃癌患者中，Zheng等[7]發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的TBX5反而與不良生存相關(guān)，而III期和IV期胃癌患者，腫瘤組織中的TBX5表達(dá)水平與正常組織并沒有顯著差異。由此，TBX5在腫瘤組織中的表達(dá)水平可能是潛在的預(yù)后指標(biāo)。

2 TBX5在肺癌中的表達(dá)

目前，不少研究[21]認(rèn)為TBX5和肺癌發(fā)生的關(guān)系尚不明確。Khalil等[8]的研究發(fā)現(xiàn)相較于正常肺組織，TBX2亞家族在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)受到顯著抑制（P＜1×10-9），在肺癌前病變組織中TBX2亞家族基因水平均有所下降（P＜1×10-4），所以TBX2亞家族基因水平的下調(diào)可能與早期非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生相關(guān)。該研究結(jié)果與另一項(xiàng)研究體外實(shí)驗(yàn)[22]的結(jié)果一致。

Arora等[3]的研究發(fā)現(xiàn)TBX4和TBX5在生長(zhǎng)中小鼠的肺和氣管的間充質(zhì)中均有表達(dá)，但在上皮細(xì)胞中不表達(dá)，TBX5的缺失可僅使單肺發(fā)育而氣管并不形成，TBX4的缺失則并不會(huì)有這樣的影響。TBX4和TBX5均通過FGF10來(lái)調(diào)節(jié)肺分支的形成，通過性別決定區(qū)域Y盒（sex-determining region Y-box,SOX9）基因以獨(dú)立于獨(dú)立于FGF10的途徑控制氣管或支氣管軟骨形成。Horie等[23]發(fā)現(xiàn)TBX4參與到關(guān)鍵成纖維細(xì)胞作用相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，也細(xì)胞中和超增強(qiáng)子相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。肺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞可能是由常駐成纖維細(xì)胞發(fā)展而來(lái)，而肺特異性成纖維細(xì)胞特征的喪失可能是其表型轉(zhuǎn)化為癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的原因。病理情況下，肺成纖維細(xì)胞中表達(dá)較高的基因，尤其是轉(zhuǎn)錄因子，在肺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞中均被抑制，而TBX2、TBX4和TBX5的沉默與肺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞中的DNA高甲基化有關(guān)。

早先有研究提出癌癥域（field of cancerization）[24]和組織損傷域（field of tissue injury）[25]，而相較于無(wú)瘤的吸煙者，患有肺癌的吸煙者在正常支氣管組織中的TBX2亞家族基因表達(dá)減少，同時(shí)具有可疑結(jié)節(jié)的吸煙者的支氣管組織中TBX2亞家族基因表達(dá)顯著減少（P＜1×10-5）。所以TBX2亞家族的表達(dá)受抑制可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病早期發(fā)生，其基因表達(dá)水平可以作為具有可疑結(jié)節(jié)的高風(fēng)險(xiǎn)吸煙者檢測(cè)肺癌的生物標(biāo)志物[8]。Ma等[26]在他們的研究中，首次提出TBX5在非小細(xì)胞肺癌的正常鄰近組織中高度表達(dá)，但是在非小細(xì)胞肺癌的組織和細(xì)胞中，其水平顯著下調(diào)。因此表明TBX5的水平和肺癌的進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)。基于組織微陣列的免疫組化染色結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌組織內(nèi)TBX5表達(dá)水平和腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis, TNM）分期（P= 0.016）、組織病理學(xué)類型（P=0.029）和淋巴結(jié)狀態(tài)顯著相關(guān)（P=0.035），而與年齡、性別和病理學(xué)分化沒有關(guān)系（P＞0.05）。在裸鼠中的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TBX5水平增加顯著減弱了細(xì)胞的致瘤能力，TBX5過表達(dá)使腫瘤體積和質(zhì)量顯著降低，由此證明了TBX5可以在體內(nèi)發(fā)揮腫瘤抑制作用。不過相反的是，相較于鄰近正常組織，同屬于TBX2亞家族的TBX2在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001），同時(shí)其表達(dá)水平和組織學(xué)類型（P=0.014）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（P=0.008）和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況（P=0.021）顯著相關(guān)。TBX2的表達(dá)水平對(duì)于總生存期來(lái)說也是獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)（HR=2.21,P=0.001,5），反映了癌組織的轉(zhuǎn)移潛力[27,28]。Yu等[29]的研究進(jìn)一步指出TBX2可能是晚期肺腺癌骨轉(zhuǎn)移的潛在指標(biāo)。所以TBX2亞家族不僅可能作為肺癌的治療靶點(diǎn)，其基因表達(dá)水平也是潛在的診斷肺癌和判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物。

除了TBX2，TBX3-5的mRNA表達(dá)水平均和基因的甲基化程度呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）[17]。Shi等[30]在全基因組范圍內(nèi)對(duì)鱗狀細(xì)胞肺癌的表觀遺傳模式進(jìn)行了研究，通過微陣列研究并結(jié)合DNA甲基化和mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)鑒定出449個(gè)伴隨表達(dá)改變的異常甲基化基因，在經(jīng)過基因本體論（gene ontology, GO）分析和焦磷酸測(cè)序后鑒定出CLDN1、TP63、TBX5、TCF21、ADHFE1和HNF1B等6個(gè)DNA甲基化生物標(biāo)志物。受試者工作特征（receiver operating characteristics, ROC）曲線分析納入了癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示曲線下面積（area under the curve, AUC）為0.984，所以TBX5可能是潛在的診斷肺鱗癌的生物標(biāo)志物。雖然在肺鱗癌和肺腺癌中TBX2-5的甲基化程度均顯著升高，特別是TBX4和TBX5，不過分期（I期-II期vsIII期-IV期）和吸煙史似乎對(duì)甲基化程度沒有顯著影響。由此，TBX2亞家族的甲基化可能發(fā)生在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生早期[17]。Nawaz等[31]的研究發(fā)現(xiàn)多重甲基化特異性PCR（multiplex methylation specific polymerase chain reaction, MMSP）可用于檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移潛力，他們發(fā)現(xiàn)有兩種組合的靈敏度和特異性最高，均為86%和97%，分別是HOXA9、TBX5、PITX2和HOXA9、TBX5、PITX2、RASSF1A。不過他們的研究中提到這種監(jiān)測(cè)僅可用于治療后的隨訪和癌癥的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。

3 TBX5調(diào)控肺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究

TBX5在發(fā)育的心臟和肢體芽中呈現(xiàn)梯度分布，表明TBX5在體內(nèi)具有不同的作用[32,33]。TBX5過表達(dá)顯著抑制體外非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、集落形成和侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Ma等[26]首次提出TBX5水平與人肺癌進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)，在裸鼠內(nèi)TBX5水平升高可基本阻斷腫瘤的生長(zhǎng)，所以TBX5可以作為非小細(xì)胞肺癌的診斷和治療的靶標(biāo)。而Bruneau等[34]的研究提出TBX5存在于成熟心臟中和心臟的腫瘤發(fā)生率低可能存在一定關(guān)系，可能是TBX5潛在地抑制某些腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。

而Khalil等[22]進(jìn)一步提出TBX2-5的下調(diào)并不是TBX陰性表達(dá)的細(xì)胞擴(kuò)增所致，而是由于細(xì)胞的自主調(diào)節(jié)機(jī)制所致，這對(duì)于其能否作為可靠的生物標(biāo)志物極為關(guān)鍵。他們的研究提出TBX2-5共同構(gòu)成了抑制肺癌進(jìn)展的通路[22]，這也被Ma等[26]包括非小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的不同癌細(xì)胞系的研究所證明。TBX2-5能夠通過調(diào)節(jié)甲基化和去甲基化過程來(lái)抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，而甲基化和去甲基化過程可影響與癌癥發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)的下游基因的表達(dá)[1,22]。

不過Khalil等[22]發(fā)現(xiàn)在他們的研究之前并沒有學(xué)者提出TBX4-5在其他癌細(xì)胞系中過表達(dá)，而有研究認(rèn)為TBX2和TBX3可以通過靶向CDKN1A和CDKN1B[35]以及CDKN2A基因特異性影響衰老[36]，但是Khalil的研究認(rèn)為CDKN2A基因的激活程度輕，與其在細(xì)胞增殖中起到的主要抑制作用不符，并不能特異性影響衰老[22]。同時(shí)，Khalil等[22]提出他們實(shí)驗(yàn)中所采用的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)是第一個(gè)在癌癥環(huán)境中無(wú)偏移評(píng)價(jià)TBX2-5作用的方法，而與其他研究所采用的“先驗(yàn)”方法不同。He等[9]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TBX5可憑借不同的敏感性有效抑制不同癌細(xì)胞的集落形成，包括U2OS細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、H1299細(xì)胞和Saos-2細(xì)胞，而TBX5的異位表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

Qiao等[37]分析了來(lái)自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的非吸煙女性肺癌的微陣列數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)TBX5-AS1（TBX5 antisense RNA 1）等3個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）在肺癌組織中顯著下調(diào)，而另有5個(gè)lncRNA顯著上調(diào)。Xiong等[38]的研究發(fā)現(xiàn)TBX5-AS1的高表達(dá)也與肺鱗癌的不良預(yù)后相關(guān)（P=0.023）。AFAP1-AS1的上調(diào)與非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后不良相關(guān)[39]，其他的研究[40-44]也提出肺癌組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)水平的上調(diào)與肺癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。目前，TBX5-AS1的生物學(xué)功能并不清楚，但是Qiao等[37]推測(cè)其異常表達(dá)可能在女性肺癌的發(fā)生發(fā)展中有一定作用。

有研究[45]認(rèn)為沙利度胺可以抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)可以特異性地和TBX5結(jié)合。不過，研究[22,45-47]認(rèn)為Khalil的體外實(shí)驗(yàn)和有關(guān)沙利度胺的臨床試驗(yàn)都是失敗的，沒有對(duì)腫瘤細(xì)胞有很好的抑制作用。Jazieh等[46]的II期單臂臨床試驗(yàn)的中位總生存期為10.8個(gè)月，中位無(wú)進(jìn)展生存期為4個(gè)月。Hoang等[48]有關(guān)沙利度胺的III期臨床試驗(yàn)（ECOG 3598）發(fā)現(xiàn)放化療聯(lián)合沙利度胺并未改善局部晚期非小細(xì)胞肺癌患者的總生存期，與對(duì)照組相比，3級(jí)不良反應(yīng)的發(fā)生率更高（53%vs44%,P=0.004）。Nemer等[45]的實(shí)驗(yàn)并未證明在使用沙利度胺后，細(xì)胞因子和黏附分子發(fā)生變化，沙利度胺的抑癌作用可能對(duì)于肺腺癌并不適用。

4 結(jié)論

目前對(duì)于TBX2亞家族的研究已逐漸從器官的發(fā)生發(fā)育轉(zhuǎn)向腫瘤的發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移，而TBX5已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和肺癌、食管癌、胃癌、乳腺癌和結(jié)腸癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移之間存在一定關(guān)系。目前的研究對(duì)于TBX5與肺癌發(fā)生的機(jī)制并沒有很好的闡述，不過，已經(jīng)有研究提出包括TBX5在內(nèi)的四種TBX2亞家族基因在NSCLC中表達(dá)受抑制。在癌前病變的組織中，其表達(dá)水平相對(duì)于正常組織也有所下降，而TBX2-5可以獨(dú)立調(diào)控肺癌的進(jìn)展。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和表觀遺傳學(xué)等相關(guān)研究提出了基因異常甲基化的現(xiàn)象，TBX5會(huì)因啟動(dòng)子被甲基化而沉默或降低活性，因而無(wú)法抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。因此，調(diào)節(jié)TBX5的表達(dá)水平可能是調(diào)控肺癌發(fā)生和進(jìn)展的途徑，TBX5的表達(dá)水平和甲基化程度是潛在的用以診斷肺癌和判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物，不過需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)闡明TBX5通路的機(jī)制和作用，同樣也需要更多的臨床樣本闡述TBX5在肺癌中的表達(dá)及其預(yù)后價(jià)值。