王維 趙學(xué)千 賈育松 李晉玉*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院骨傷一區(qū)，北京 100700

2.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)屬原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)的一種，一般發(fā)生在女性絕經(jīng)后2年內(nèi)，被視作一種多因素引起的年齡相關(guān)性慢性退行性病變，主要是由于絕經(jīng)后女性卵巢功能減退，雌激素水平下降,致使由破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)主導(dǎo)的骨吸收能力強(qiáng)于由成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)主導(dǎo)的骨形成，造成骨代謝失衡，骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨量減少。

表觀遺傳學(xué)是指在DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下,基因功能發(fā)生可遺傳的遺傳信息變化,并最終導(dǎo)致可遺傳的表型變化,而且這種改變?cè)诎l(fā)育和細(xì)胞增殖過程中能穩(wěn)定傳遞且具有可逆潛能[1]。表觀遺傳學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容分為對(duì)基因轉(zhuǎn)錄過程中的調(diào)控和對(duì)轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控兩部分，具體包括DNA甲基化(DNA methylation)、組蛋白修飾(histone modification)、染色質(zhì)重塑 (chromatin remodeling)和非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)調(diào)控等，能夠產(chǎn)生基因組印記、母性影響、基因沉默、核仁顯性、休眠轉(zhuǎn)座子激活等效應(yīng)[2]。

骨質(zhì)疏松癥是遺傳、表觀遺傳和環(huán)境等多個(gè)因素共同作用的結(jié)果[3]。大量研究[4]證實(shí)了表觀遺傳學(xué)參與PMOP的發(fā)生發(fā)展，并且有學(xué)者認(rèn)為與基礎(chǔ)的遺傳因素相比，表觀遺傳起到了更為關(guān)鍵的作用，其通過影響多條信號(hào)通路和相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，參與改變各類骨細(xì)胞的分化命運(yùn)。本文將從DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNAs這三個(gè)方面綜述表觀遺傳和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系。

1 DNA甲基化對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的影響機(jī)制

DNA甲基化過程是由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基,經(jīng)過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 (DNMTs) 的催化形成5-甲基胞嘧啶,此過程主要發(fā)生于基因的胞嘧啶-鳥嘌呤 (CpG) 雙核苷酸序列，并且可以通過DNA的復(fù)制而遺傳。真核細(xì)胞內(nèi)甲基化狀態(tài)有三種:持續(xù)的低甲基化狀態(tài)、誘導(dǎo)的去甲基化狀態(tài)和高度甲基化狀態(tài)。基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 甲基化是抑制基因表達(dá)最常見的表觀遺傳現(xiàn)象之一。

就圍絕經(jīng)期女性而言，激素水平改變和衰老會(huì)影響體內(nèi)DNA甲基化程度。Sjur等[4]在POMP患者骨活檢中，選取顯著影響骨密度(bone mineral density，BMD)水平的基因進(jìn)行甲基化分析，發(fā)現(xiàn)CpG甲基化數(shù)量最多的前4位轉(zhuǎn)錄物(MEPE,SOST,DKK1,WIF1)均為骨代謝抑制因子，認(rèn)為骨代謝有關(guān)基因的CpG甲基化程度與BMD高低以及骨折風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。但在PMOP發(fā)病過程中，所涉及的基因DNA甲基化趨勢(shì)的上調(diào)或下調(diào)，要取決于基因本身及其所在組織。

1.1 雌激素受體的DNA甲基化

雌激素受體(estrogen receptor,ER)廣泛存在于各類骨細(xì)胞當(dāng)中，不僅可以通過ER經(jīng)典基因組效應(yīng)等途徑與雌激素結(jié)合發(fā)揮作用，還可作為雌激素轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮更多作用[5]。ER在雌激素介導(dǎo)下對(duì)于Wnt/β-catenin、BMP-smads、MAPK等多個(gè)成骨分化信號(hào)通路都具有調(diào)節(jié)作用[6-8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后婦女體內(nèi)Erα甲基化程度升高導(dǎo)致ER表達(dá)量下降，而ERα高甲基化可能與絕經(jīng)期婦女血清同型半胱氨酸 (homocysteine,Hcy)升高有關(guān)。LV等[9]研究認(rèn)為Hcy使ERα啟動(dòng)子A區(qū)甲基化程度升高從而抑制ERα表達(dá)。Hcy自身也可以通過增加OC活性、降低OB活性和直接作用于骨基質(zhì)等途徑參與骨代謝[10]。

1.2 調(diào)節(jié)因子的DNA甲基化

骨形成蛋白(BMP)是生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子(TGF-β)的一種，其介導(dǎo)的BMP-Smads信號(hào)通路參與BMSCs向OB的分化增殖及骨細(xì)胞礦化等方面。在BMPs之中，BMP2調(diào)節(jié)成骨分化能力最強(qiáng)[11]。當(dāng)BMP2參與成骨分化時(shí)，會(huì)使啟動(dòng)子Cpg島去甲基化，BMP2表達(dá)活性增強(qiáng)，進(jìn)而調(diào)控通路下游參與骨形成基因如Dlx5、Runx2、Osterix的表達(dá)。Mehrun等[12]通過RT-PCR得出在病理狀態(tài)下，BMP2啟動(dòng)子高甲基化會(huì)使BMP2的轉(zhuǎn)錄活性下降，造成骨形成減弱。然而關(guān)于BMP2表觀修飾改變具體機(jī)制尚不清楚。Matsumoto等[7]發(fā)現(xiàn)BMPs家族另一具有骨特異性的成員BMP4，在MC3T3-E1細(xì)胞中受到雌激素調(diào)節(jié)后敏感性上調(diào)，進(jìn)而影響成骨分化。故絕經(jīng)期后雌激素水平驟降可能改變BMPs的表觀修飾狀態(tài)。

硬化蛋白(sclerostin，SOST)是調(diào)節(jié)骨形成的負(fù)性因子，缺乏SOST蛋白會(huì)導(dǎo)致骨密度異常升高。Sjur等[13]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在PMOP患者體內(nèi)，SOST啟動(dòng)子甲基化程度顯著升高，且與年齡相關(guān)。Yu等[14]發(fā)現(xiàn)在OP患者體內(nèi)SOST高甲基化阻礙了SP7、Runx2和ERα的反式激活，進(jìn)而使骨重建受阻。同時(shí)，SOST基因甲基化狀態(tài)改變還與OP患者成骨細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)。

1.3 成骨與成脂分化中的DNA甲基化

各種原因?qū)е碌墓橇肯陆党０橐娭窘?rùn)增加，BMSCs向成骨分化減少、成脂分化增多是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的重要機(jī)制之一[15]。Runx2作為多種成骨信號(hào)通路及調(diào)節(jié)蛋白的下游基因，是成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志。PPARγ是參與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的重要調(diào)節(jié)因子。因此，Runx2和PPARγ的DNA甲基化程度對(duì)于BMSCs的分化命運(yùn)有重要影響。Xu等[16]發(fā)現(xiàn)在脂肪組織來源干細(xì)胞(ATSCs)中，RUNX2啟動(dòng)子cpg島呈高甲基化狀態(tài)，在BMSCs中呈低甲基化狀態(tài)。而PPARγ則剛好相反，其啟動(dòng)子在ATSCs呈低甲基化，在BMSCs中呈高甲基化。此外，Cho等[17]發(fā)現(xiàn)在脂肪前體細(xì)胞中成骨細(xì)胞標(biāo)記堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和BMP2基因啟動(dòng)子 CpG島發(fā)生了過度甲基化，使其不能受到Wnt3a調(diào)控進(jìn)行成骨分化。

2 組蛋白修飾對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的影響機(jī)制

組蛋白是染色質(zhì)基本單位核小體的組成部分，組蛋白八聚體被DNA纏繞形成核小體。組蛋白修飾往往發(fā)生在4種常見組蛋白 (H2A、H2B、H3和H4,尤以H3、H4較多) 的游離氨基端尾巴，常見的修飾種類包括組蛋白乙?；?去乙酰化、甲基化/去甲基化、泛素化/去泛素化和磷酸化等等。組蛋白修飾可通過改變基因的周遭環(huán)境，增強(qiáng)或減弱轉(zhuǎn)錄輔助因子對(duì)基因表達(dá)的作用；還可直接影響染色質(zhì)的構(gòu)造及狀態(tài)，改變蛋白與基因之間的相互作用；亦能作為信號(hào)影響其下游基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，進(jìn)而改變基因的表達(dá)[18]。

2.1 組蛋白去乙?；?/h3>

組蛋白乙?；亲钪匾慕M蛋白修飾機(jī)制之一。它與基因轉(zhuǎn)錄的激活與抑制密切相關(guān)，一般是組蛋白乙酰化激活基因轉(zhuǎn)錄，而去乙?；瘎t使基因轉(zhuǎn)錄受到抑制。這兩種活動(dòng)分別由分組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)和去乙?；D(zhuǎn)移酶(HDAC)調(diào)控。HDACs在骨重建過程中可以催化調(diào)節(jié)因子Runx2,NF-κB,p53發(fā)生組蛋白去乙?；?。敲除了HADC的小鼠會(huì)發(fā)生骨小梁變細(xì)、骨質(zhì)流失和骨礦化下降[19]。Behera等[20]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，HADC3通過使細(xì)胞因子發(fā)生組蛋白去乙?；⑻嵘齆F-κB表達(dá)量?jī)煞N途徑抑制炎性細(xì)胞因子分泌。而炎性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素IL-6、腫瘤壞死因子TNF-α是OC形成的關(guān)鍵因子。故HADC3可能通過調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子參與到骨代謝當(dāng)中。

Sirtuins(SIRTs)家族是NAD依賴性的去乙?；福ǔ１徽J(rèn)為是調(diào)控衰老的關(guān)鍵因子。而衰老與雌激素缺乏、持續(xù)性鈣丟失一樣，均是絕經(jīng)期女性患骨質(zhì)疏松癥的獨(dú)立易感因素[21-23]。在SIRTs家族中，Sirt1可與PPARγ共抑制因子NCOR和SMAT結(jié)合，降低PPARγ的活性，抑制細(xì)胞成脂分化。Sirts的NAD依賴性使得在其反應(yīng)過程中[NAD+]/[NADH]的比率起到重要的調(diào)控作用。NAMPT作為NAD+生物合成的限速酶，通過調(diào)控NAD的生物活性參與Sirts的催化過程。而NAMPT自身也參與到骨穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中，它能夠抑制破骨細(xì)胞分化[24]。Li等[25]研究發(fā)現(xiàn)在CIA小鼠模型中，敲除NAMPT基因可導(dǎo)致Nfatc1基因組蛋白乙酰化程度下降而甲基化程度升高，認(rèn)為NAMPT基因是調(diào)控Nfatc1啟動(dòng)子表觀修飾的主要因素。Nfatc1在OC形成和功能發(fā)揮中起關(guān)鍵作用[26-27]，NAMPT通過NAMPT-RANKL-Nfatc1途徑影響破骨分化，是骨重建失衡的重要原因之一。

2.2 組蛋白去甲基化

組蛋白甲基化具有影響基因的表達(dá)失活和激活、基因沉默和DNA修復(fù)等作用。組蛋白甲基化由多種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶催化，并且既可單獨(dú)又可重復(fù)多次被甲基化。組蛋白去甲基化酶使得甲基化修飾具有可逆性。去甲基化酶主要有兩類：一類是賴氨酸特異性去甲基化酶1 (lysine specific demethylase 1,LSD1)，一類是含有Jumonji結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì) (jumonji domain-containing protein,JMJD) 家族。其中，去甲基化酶JMJD 家族在骨代謝調(diào)節(jié)中起到重要作用。

在ER信號(hào)傳遞系統(tǒng)當(dāng)中，LSD1和JMJD1A參與雌二醇(E2)與ER靶基因結(jié)合的過程。LSD1和JMJD1A催化ER靶基因組蛋白位點(diǎn)H3K9me2去甲基化，使其順利轉(zhuǎn)錄[28]。另一組蛋白去甲基化酶JMJD2B與ERα結(jié)合，通過改變ER靶基因表觀修飾狀態(tài)和染色體結(jié)構(gòu)，刺激靶基因應(yīng)答[29]。JMJD2B還與H3的K4位點(diǎn)甲基化酶MLL2結(jié)合形成復(fù)合物，作為ER的共激活因子發(fā)揮功能[30]。郭承等[31]發(fā)現(xiàn)在PMOP患者骨組織中 JMJD2A、JMJD2B 基因和蛋白量均降低，且JMJD2A、JMJD2B的低表達(dá)與ER表達(dá)下降密切相關(guān)，故提出ER、JMJD2A、JMJD2B可能共同參與了PMOP的發(fā)病過程，但具體聯(lián)系尚不清晰。Kim等[32]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)JMJD2B通過降低H3K9me2和H3K9me3在PPARγ2啟動(dòng)子上募集，使PPARγ2表達(dá)上升，進(jìn)而引起HFD誘導(dǎo)的肥胖小鼠發(fā)生肝臟脂肪變性。敲除了JMJD2B的HepG2細(xì)胞中，PPARγ2的mRNA和蛋白質(zhì)含量均下降。故而JMJD2B對(duì)于PPARγ表達(dá)的調(diào)控，可能使得BMSCs向成脂分化增多而成骨減弱，導(dǎo)致PMOP發(fā)生。

3 非編碼RNA對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的影響機(jī)制

非編碼RNA通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾影響基因表達(dá)。ncRNA分為兩大類：管家ncRNA和調(diào)節(jié)性ncRNA，后者在表觀遺傳修飾中具有重要地位。ncRNA根據(jù)長(zhǎng)度和功能的不同可分為微小RNA(microRNA，miRNA)、PIWI相互作用RNA、siRNA、長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，ln-cRNA)、增強(qiáng)子RNA及啟動(dòng)子相關(guān)RNA。

3.1 microRNA

microRNA是長(zhǎng)度為20～25 bp的小分子非編碼單鏈RNA。大量實(shí)驗(yàn)證明miRNA既有可能對(duì)骨重建有積極作用，如miR-149高甲基化可以激活SDF-1/CXCR4途徑提升MSCs成骨分化潛力[33]；又可能對(duì)骨重建有負(fù)面影響，如MiR-125A-3p通過靶向Smad4和Jak1負(fù)向調(diào)節(jié)hADSCs成骨分化[34]、miR-133a過表達(dá)會(huì)使Rankl介導(dǎo)的OC分化活躍造成骨質(zhì)流失和PMOP發(fā)生[35]。miRNA還在BMSCs的分化命運(yùn)中起重要作用，如miR-705負(fù)調(diào)控成骨促進(jìn)因子Hoxa10和成脂抑制因子Foxo1蛋白的表達(dá)，下調(diào)Runx2、上調(diào)PPARγ表達(dá)，抑制BMMSCs成骨分化的同時(shí)促進(jìn)其成脂分化[36]。

LeT-7作為最早發(fā)現(xiàn)的micro RNA之一，被證實(shí)參與衰老過程中的細(xì)胞分化、增值和凋亡[37]。閆孌等[38]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在行雙側(cè)卵巢切除術(shù)(OVX)的小鼠BMSCs中，雌激素下降導(dǎo)致leT-7a高表達(dá)，繼而會(huì)使BMSCs向成脂分化增多而成骨分化減弱，BMSCs的增殖也會(huì)受到抑制。Wenpu等[39]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在PMOP模型小鼠的MSCs中l(wèi)eT-7A-5P表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，leT-7A-5P通過抑制TGF-β受體Ⅰ的表達(dá)影響TGF-β信號(hào)通路，下調(diào)成骨因子Runx2和Osterix，降低ALP和鈣化結(jié)節(jié)的形成，抑制成骨分化。LeT-7c作為leT-7家族另一成員亦有類似作用。實(shí)驗(yàn)表明leT-7c在氧化應(yīng)激和骨質(zhì)疏松狀態(tài)下表達(dá)活躍，能夠靶向SCD-1降低其蛋白水平，關(guān)閉wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制OB分化[40]。

ERα、miRNA和BMSCs的分化方向都在PMOP的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，然而它們潛在的分子機(jī)制和相關(guān)性仍不清楚。Li等[41]發(fā)現(xiàn)在ERα缺陷型大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)中，有25種miRNA表達(dá)上調(diào)，164種miRNA表達(dá)下調(diào)，其中不乏能夠調(diào)節(jié)成骨成脂分化以及信號(hào)通路的miRNA，如miR-210-3p和miR-214-3p。進(jìn)一步研究顯示，在ERα缺陷型rBMSCs中，miR-210-3p通過Wnt信號(hào)通路抑制細(xì)胞成骨分化、促進(jìn)成脂分化，導(dǎo)致rBMSCs成骨分化受限。這一發(fā)現(xiàn)說明PMOP的發(fā)病機(jī)制中可能存在一個(gè)以表觀修飾為橋梁，雌激素受體及調(diào)節(jié)因子蛋白、相關(guān)DNA、RNA相互連接影響的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，影響有關(guān)細(xì)胞的成骨分化。

3.2 LncRNA

LncRNA是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可以通過Wnt/β、PI3K-Akt、BMPs/TGF-β等多個(gè)信號(hào)通路促進(jìn)OB的分化,也可通過RANK/RANKL/OPG、MAPK和PPAR-γ通路抑制OC的分化。

LncRNA可以通過調(diào)控骨代謝相關(guān)基因的表觀修飾影響成骨分化。LncRNA-DANCR是調(diào)節(jié)成骨分化的重要介質(zhì)。Xiang等[42]發(fā)現(xiàn)在絕經(jīng)期低骨密度婦女的外周血單核細(xì)胞中，DANCR表達(dá)量明顯上升。DANCR通過促進(jìn)IL-6、TNF-α的表達(dá)，刺激破骨細(xì)胞生成，參與骨吸收過程。Zhu等[43]發(fā)現(xiàn)DANCR能夠使EZH2募集于Runx2啟動(dòng)子，使其發(fā)生高甲基化，致使Runx2表達(dá)下降，成骨分化受到抑制。

LncRNA也可通過影響信號(hào)通路，調(diào)節(jié)BMSCs的分化方向。Li等[44]發(fā)現(xiàn)LncRNA-Bmncr可以調(diào)節(jié)衰老過程中BMSCs的分化命運(yùn)。它可通過維持細(xì)胞外基質(zhì)蛋白纖維調(diào)節(jié)素的表達(dá)和激活BMP2介導(dǎo)的信號(hào)通路刺激BMSCs成骨分化。Bmncr通過促進(jìn)TAZ和ABL互相作用，使TAZ和Runx2/PPARG轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合，促進(jìn)BMSCs成骨分化并抑制脂肪形成。此外，恢復(fù)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)中的Bmncr表達(dá)水平可以逆轉(zhuǎn)年齡相關(guān)的成骨成脂分化失調(diào)。

LncRNA亦可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)調(diào)節(jié)BMSCs定向分化。Yuan等[45]發(fā)現(xiàn)一全新長(zhǎng)鏈非編碼RNA：PGC1β-OT，其具有促進(jìn)小鼠BMSCs成骨分化、抑制脂肪分化的功能。經(jīng)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，PGC1β-OT上含有miR-148A-3p結(jié)合位點(diǎn)。miR-148A-3p可以通過靶向Kdm6b來調(diào)節(jié)骨祖細(xì)胞的成骨成脂分化[46]。PGC1β-OT通過拮抗miR-148A-3p上調(diào)其靶基因Kdm6b的表達(dá)，從而達(dá)到促進(jìn)成骨、抑制成脂的目的。

4 結(jié)語

表觀遺傳機(jī)制的存在既提供了大量的可供治療針對(duì)的靶點(diǎn)，又提示人們可從改變表觀修飾機(jī)制著手進(jìn)行治療。研究[47]顯示miRNA是OP的重要治療靶點(diǎn)，如淫羊藿-仙茅藥調(diào)控miRNA-144治療繼發(fā)型骨質(zhì)疏松。同時(shí)近年來發(fā)現(xiàn)的一系列表觀遺傳活性藥物，可能也在OP的治療中發(fā)揮一定作用，如BET蛋白拮抗劑JQ1可減少OVX大鼠骨質(zhì)流失[48]；NMP調(diào)節(jié)OB/OC平衡、抑制炎性細(xì)胞因子，治療OVX大鼠骨質(zhì)疏松癥[49]。在診斷方面，以循環(huán)miRNAs為首的一系列表觀修飾被看作是新興的骨病生物標(biāo)志物，參與到骨病的早期診斷和鑒別當(dāng)中[50-51]。

表觀遺傳學(xué)存在于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制中的方方面面，但其最主要的影響是改變了間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞等關(guān)鍵細(xì)胞的正常分化。綜合各類試驗(yàn)，可以窺見在PMOP的發(fā)病機(jī)制中，存在一個(gè)以表觀修飾及其因子，聯(lián)合DNA、RNA及相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，影響基因表達(dá)。但是其上下游關(guān)系和調(diào)節(jié)的分子機(jī)制、為何會(huì)發(fā)生如上的表觀遺傳狀態(tài)改變等問題，仍有待進(jìn)一步研究。此外，文章收錄的實(shí)驗(yàn)多是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或體外實(shí)驗(yàn)，尚不足以解釋人體的病理變化。接下來還應(yīng)尋找表觀遺傳機(jī)制在人體內(nèi)外的異同，建立起體內(nèi)與體外研究的聯(lián)系。相信隨著更多系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)的面世，未來會(huì)對(duì)表觀遺傳是如何影響PMOP發(fā)病機(jī)制有更加全面、深刻的認(rèn)識(shí)。