謝旭東 趙蕾 吳亞菲 王駿

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙周病科，成都 610041

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是1988年由Wozney等[1]最初從脫礦后的骨組織中分離而來，因其移植到嚙齒動物軟組織后可以誘導(dǎo)異位軟骨內(nèi)成骨而得名。與BMP其他家族成員（BMP2～7）不同，BMP1具有獨特的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，不屬于轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF） β超家族，而是蝦紅素蛋白酶家族成員[2]。以BMP1為原型，一類結(jié)構(gòu)相似的細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶被稱為BMP1/tolloid（TLD）蛋白酶家族。臨床報道發(fā)現(xiàn)BMP1/TLD蛋白酶家族的編碼基因發(fā)生突變可導(dǎo)致伴有成骨發(fā)育不全（osteogenesis imper-fecta，OI）的Ⅰ型牙本質(zhì)發(fā)育不全（dentinogenesis imperfecta，DGI）[3]，提示該蛋白酶家族在牙及骨等硬組織發(fā)育中具有重要作用。Bmp1或tolloid樣蛋白1（tolloid-like 1，Tll1）全基因敲除小鼠因骨骼、心臟等多器官的發(fā)育缺陷而分別在圍產(chǎn)期、胚胎期死亡[4-5]。Bmp1和Tll1全基因敲除的早期致死性阻礙了對其功能的進一步研究。隨著Cre/LoxP系統(tǒng)的條件性基因敲除技術(shù)的發(fā)展成熟，對于BMP1/TLD蛋白酶家族在硬組織（牙和骨）發(fā)育中的作用研究也取得了重要突破。本文將對BMP1/TLD蛋白酶家族在牙和骨組織發(fā)育中的作用及其機制研究所得的進展作一綜述。

1 BMP1/TLD蛋白酶家族的組成

BMP1/TLD蛋白酶家族包括BMP1、TLD、TLL1和TLL2。該家族各成員具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)域，均含有一個N端前功能域、一個類蝦紅素基質(zhì)金屬蛋白酶區(qū)、數(shù)個CUB區(qū)（complement-Uegf-BMP1 do-mains）和類表皮生長因子區(qū)。CUB區(qū)是一種結(jié)構(gòu)和功能相對保守的結(jié)構(gòu)域，最初在補體、Uegf（一種海膽胚胎蛋白，也稱為fibropellin）和BMP1中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于多種機體發(fā)育過程中的調(diào)控蛋白。

BMP1和TLD為BMP1基因編碼的2種剪接變體，兩者結(jié)構(gòu)和序列的相似度達到了41%[6]。TLL2主要在骨骼肌中表達，Tll2基因敲除小鼠僅有輕微的肌肉表型，因此，在骨等硬組織的發(fā)育過程中不太可能扮演重要的角色[7]。而BMP1與TLL1在骨和牙等硬組織中共同表達，且蛋白產(chǎn)物具有重疊效應(yīng)，對于機體的正常生長發(fā)育發(fā)揮著重要作用。

2 BMP1/TLD蛋白酶家族在細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的作用

BMP1/TLD蛋白酶作為基質(zhì)金屬蛋白酶，主要功能是參與細(xì)胞外基質(zhì)多種蛋白的酶切加工。因此BMP1/TLD蛋白酶的重要性主要取決于其酶切產(chǎn)物的功能特性。就硬組織的生長發(fā)育而言，BMP1/TLD蛋白酶的重要酶切產(chǎn)物包括膠原蛋白和非膠原蛋白兩大類。

一方面，BMP1/TLD蛋白酶家族對于膠原蛋白的生物合成起著關(guān)鍵作用。在體內(nèi)Ⅰ～Ⅲ型膠原均以前體形式合成，具有延伸的NH2和COOH末端肽。只有這些N端和C端前肽被水解切除后才能暴露中心的三股旋轉(zhuǎn)域，形成成熟的單體，并最終交聯(lián)結(jié)合成膠原纖維[8]。研究已證實，BMP1/TLD蛋白酶家族可負(fù)責(zé)切除前膠原的C端前肽，充當(dāng)C端前肽酶的作用。在BMP1/TLD蛋白酶家族的4個成員中，BMP1對C端前肽的水解效率最高，其次為TLD和TLL1，而TLL2不具有酶切活性[4,9]。未被酶切的C端前肽可通過兩方面作用抑制成熟膠原纖維合成：1）通過影響膠原單體的交聯(lián)作用而顯著增加其溶解度；2）體積較大的C端前肽對膠原單體的有序堆積在空間上起著阻礙作用[4]。另一方面，BMP1/TLD蛋白酶家族也參與了多種非膠原蛋白的肽鏈切割，例如小整合素結(jié)合配體N連接的糖蛋白（small integrin-binding ligand, n-linked glycoprotein family，SIBLING）、賴氨酸氧化酶、層粘連蛋白5等[6]，從而調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)，影響機體的生長發(fā)育。

3 BMP1/TLD蛋白酶家族成員對牙發(fā)育的影響

3.1 在牙發(fā)育過程中的表達分布

Zhang等[5]構(gòu)建了Bmp1laczflox/ 和Tll1laczflox/ 小鼠，并通過X-gal染色觀察到Bmp1和Tll1基因在小鼠牙及牙周組織中均有表達，且Bmp1在成牙本質(zhì)細(xì)胞層內(nèi)的表達量明顯高于Tll1，提示在牙本質(zhì)發(fā)育過程中BMP1可能發(fā)揮著更為重要的作用。免疫組化染色進一步證實了小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞表達Bmp1和Tll1蛋白。

3.2 在牙發(fā)育過程中的作用及機制

DGI是一種罕見的牙齒發(fā)育異常的遺傳性疾病，發(fā)病率約為0.013%～0.09%[10]，主要表現(xiàn)為牙齒顏色改變，牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)變薄。由于釉牙本質(zhì)界的發(fā)育異常，患牙的釉質(zhì)易從牙本質(zhì)表面脫落引起牙本質(zhì)暴露，進而增加患齲病的風(fēng)險。DGI一共分為3種類型：Ⅰ型為伴有OI的牙本質(zhì)發(fā)育不全，對乳牙的影響大于恒牙；Ⅱ型又被稱為遺傳性乳光牙本質(zhì)，臨床表現(xiàn)與Ⅱ型類似，但不伴有成骨發(fā)育不全，此型最為常見，乳牙和恒牙的受影響程度無顯著差異；Ⅲ型被稱為殼狀牙，罕見，牙本質(zhì)極薄，髓腔和根管明顯增大，主要影響恒牙牙本質(zhì)的發(fā)育[11-14]。

Valencia等[3]在Ⅰ型DGI患者檢測到BMP1基因突變，提示Ⅰ型DGI的發(fā)生可能與BMP1/TLD蛋白酶家族的編碼基因突變密切相關(guān)。Zhang等[5]利用條件性基因敲除技術(shù)將基因型為2.3 kb Col1a1-Cre和Bmp1flox/flox；Tll1flox/flox的 轉(zhuǎn)基因小鼠配對，獲得基因型為2.3 kb Col1a1-Cre；Bmp1flox/flox；Tll1flox/flox的小鼠，從而實現(xiàn)同時在表達Ⅰ型膠原的細(xì)胞（包括成牙本質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞等）特異性地敲除Bmp1和Tll1基因。在另一項背靠背的研究中，Wang等[15]構(gòu)建了可誘導(dǎo)的Bmp1/Tll1雙基因敲除小鼠模型（UBC-CreERT2；Bmp1flox/flox；Tll1flox/flox），并通過注射他莫昔芬控制誘導(dǎo)基因敲除的時間，實現(xiàn)了在小鼠出生后特異時間點同時敲除Bmp1和Tll1基因。雙方的實驗結(jié)果均發(fā)現(xiàn)，雙基因敲除小鼠牙本質(zhì)發(fā)育缺陷，未礦化的前期牙本質(zhì)層明顯增寬，髓腔增大，推測其可能機制為Bmp1和Tll1基因的缺失阻礙了對牙本質(zhì)的主要蛋白成分Ⅰ型膠原的酶切作用，使得Ⅰ型膠原不能被激活，從而造成了牙本質(zhì)發(fā)育的缺陷。同時，雙基因敲除小鼠還伴有輕微OI的表現(xiàn)，即牙槽骨的發(fā)育缺陷和牙周膜內(nèi)膠原纖維含量的降低。

值得注意的是，除了參與膠原蛋白的酶切加工，BMP1/TLD蛋白酶家族也參與了重要的牙本質(zhì)非膠原蛋白的生物合成，主要包括牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白（dentin matrix protein，DMP）1和牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）。DMP1最初是從大鼠牙本質(zhì)中分離提取而來，隨后被發(fā)現(xiàn)在骨和多種軟組織中均有表達。DMP1是一種細(xì)胞外酸性磷酸化蛋白，在體內(nèi)以前體形式合成，通過蛋白酶水解成相對分子質(zhì)量為37 000的N端片段與相對分子質(zhì)量為57 000的C端片段而發(fā)揮功能。研究發(fā)現(xiàn)，BMP1/TLD蛋白酶家族參與了DMP1的酶切加工和生物合成過程[16]，而DMP1又在成牙本質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化和成熟過程中必不可少，對于牙本質(zhì)、骨組織的生長發(fā)育都起至關(guān)重要的作用[17]。Dmp1基因敲除小鼠牙本質(zhì)發(fā)育出現(xiàn)明顯缺陷，表現(xiàn)為前期牙本質(zhì)層增寬，牙髓腔增大，牙本質(zhì)礦化程度低，牙本質(zhì)礦物質(zhì)沉積速率明顯減慢，牙本質(zhì)小管系統(tǒng)異常[18]，以上表型與Bmp1/Tll1雙基因敲除小鼠類似。Wang等[15]的研究進一步發(fā)現(xiàn)，Bmp1/Tll1雙基因敲除小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞層和牙槽骨內(nèi)DMP1表達量均顯著下降。TRAP染色結(jié)果顯示，基因敲除小鼠牙槽骨內(nèi)TRAP陽性的破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，其原因可能為基因敲除小鼠牙槽骨內(nèi)DMP1表達量的急劇減少引起骨細(xì)胞功能缺陷，從而影響破骨細(xì)胞的激活。破骨細(xì)胞數(shù)量減少也部分解釋了Bmp1/Tll1雙基因敲除小鼠的牙齒萌出障礙表型。

BMP1/TLD蛋白酶家族還參與了DSPP的酶切加工，促使DSPP成為成熟的牙本質(zhì)涎蛋白（dentin sia-loprotein，DSP）和牙本質(zhì)磷蛋白（dentin phospho-protein，DPP）。DSP和DPP對鈣離子具有很高的親和力，可調(diào)節(jié)牙本質(zhì)礦化的速度和位點[19-21]。DSPP作為牙本質(zhì)基質(zhì)內(nèi)含量僅次于Ⅰ型膠原的蛋白成分，其蛋白水解過程對于牙本質(zhì)的礦化起著關(guān)鍵作用[22-24]。Gibson等[25]通過敲除小鼠Dspp基因后發(fā)現(xiàn)牙本質(zhì)層明顯變薄，髓腔增大。Bmp1/Tll1雙基因敲除小鼠與Dspp基因敲除小鼠相似的牙本質(zhì)發(fā)育缺陷表型提示BMP1/TLD蛋白酶家族可能通過參與DSPP的酶切加工過程調(diào)控牙本質(zhì)的礦化。以上猜想也通過Bmp1/Tll1雙基因敲除小鼠DSP表達量顯著降低得到了進一步證實[15]。

4 BMP1/TLD蛋白酶對骨發(fā)育的影響

4.1 在骨組織中的表達分布

Scott等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，Bmp1、Tld和Tll1在胎齡15.5 d小鼠的軟骨膜及肌腱等部位均有表達，其中Tll1的分布較Bmp1和Tld局限，且其表達量也更低，而Tll2的表達分布不同于其他3個家族成員，僅見于骨骼肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。

隨后，通過對出生后21 d的小鼠股骨進行分析發(fā)現(xiàn)，Tld在骨骺及干骺端的骨化中心均有表達。與之相比，Bmp1的分布則更為廣泛，除以上部位以外，其在骺軟骨中也有表達，表明BMP1可能在骺軟骨的發(fā)育中發(fā)揮著更為重要的作用。而Tll1主要在骨膜和軟骨膜中表達，其在骨化中心的表達量要低于Bmp1和Tld。

4.2 在骨發(fā)育中的作用及機制

OI是一類罕見遺傳性疾病，發(fā)病率為1/15 000～1/20 000，臨床表現(xiàn)有復(fù)發(fā)性骨折、廣泛性骨畸形、骨質(zhì)疏松和Wormian骨等[26-27]。1979年Sil lence等[28]根據(jù)臨床和影像學(xué)表現(xiàn)將OI按照嚴(yán)重程度依次分為從輕微到致死的4種類型。隨后，Marini等[29]結(jié)合Sillence分類法并分析膠原蛋白合成的缺陷程度，將OI分類進行了改良：Ⅰ型（輕微型）為僅有膠原量的減少而結(jié)構(gòu)正常，而Ⅱ型（致死型）、Ⅲ型（嚴(yán)重型）和Ⅳ（中度型）為編碼膠原蛋白的基因發(fā)生突變且引起了膠原結(jié)構(gòu)的異常。

在很長一段時間里，研究者們均認(rèn)為OI的發(fā)病機制是編碼Ⅰ型膠原α1和α2鏈的Col1A1和Col1A2基因發(fā)生了常染色體顯性突變[30]。但是近年來研究發(fā)現(xiàn)，部分OI病例與BMP1基因突變密切相關(guān)。BMP1基因的突變導(dǎo)致由其編碼的BMP1和TLD蛋白酶合成受阻，從而影響前膠原C端前肽的水解切除，引起膠原排列紊亂。同時，BMP1基因突變還可導(dǎo)致膠原原纖維調(diào)節(jié)因子飾膠蛋白聚糖的合成障礙，進一步加劇了膠原纖維的生物合成缺陷[3,31-33]。有趣的是，BMP1基因突變所導(dǎo)致的OI臨床癥狀較Ⅰ型膠原缺陷引起的OI更為嚴(yán)重，原因可能是BMP1/TLD蛋白酶不僅對Ⅰ型膠原的C端前肽具有水解作用，還能對其他前膠原發(fā)揮酶切作用，并且能激活交聯(lián)的引發(fā)劑——賴氨酰氧化酶。

Muir等[34]利用條件性基因敲除技術(shù)，研究Bmp1和Tll1基因?qū)π∈蠊趋老到y(tǒng)生長發(fā)育的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bmp1/Tll1雙基因敲除小鼠體型明顯小于對照組，平均體重僅為對照組小鼠的73%，身長比對照組短13%，股骨長度較對照組短5%；股骨彎曲試驗結(jié)果顯示，Bmp1/Tll1雙基因敲除小鼠骨質(zhì)較對照組更為脆弱，符合典型的OI臨床特征；屈服強度試驗結(jié)果顯示，基因敲除小鼠骨韌性下降，這一表現(xiàn)也與OI相符。其可能的機制為，骨的拉伸強度主要由Ⅰ型膠原纖維提供，Bmp1和Tll1基因的缺失導(dǎo)致Ⅰ型膠原纖維的合成障礙，且Ⅰ型膠原纖維又與構(gòu)成骨礦化的納米晶體成核和生長密切相關(guān)，繼而引起基因敲除小鼠骨組織的礦化缺陷。在該實驗中研究者還觀察到，基因敲除小鼠股骨提取物中DMP1水解后產(chǎn)生的C端片段減少，因此推測BMP1/TLD蛋白酶家族還參與了骨組織中對非膠原蛋白DMP1的酶切作用，進一步影響了骨組織的礦化[35]。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，BMP1/TLD蛋白酶家族在牙和骨等硬組織發(fā)育中均發(fā)揮著重要的作用，深入探究其作用機制將為相關(guān)基因缺陷疾病的臨床干預(yù)提供新思路。目前的研究主要關(guān)注BMP1/TLD蛋白酶家族在細(xì)胞外基質(zhì)酶切加工中的作用，隨著越來越多酶切底物的發(fā)現(xiàn)，BMP1/TLD蛋白酶在硬組織發(fā)育中的作用機制還有待進一步的拓展。具體來說，已有研究初步證實BMP1/TLD蛋白酶家族參與多種信號分子的激活：1）通過酶切BMP2/4的拮抗劑腱蛋白，進而激活BMP信號通路[36]；2）通過剪切TGF β結(jié)合蛋白活化TGF β1。TGF β1是一種分泌型多肽，可影響細(xì)胞的增殖、分化等多種功能[37]；3）通過酶切胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3激活I(lǐng)GF。IGF在有絲分裂、機體生長、代謝等中均發(fā)揮重要作用[38]。但是，各信號通路在BMP1/TLD蛋白酶家族相關(guān)的基因缺陷疾病中的具體作用機制尚未明確，這將是未來的重點研究方向之一。另一方面，目前所取得的研究成果對于BMP1基因突變后不同個體間硬組織發(fā)育缺陷臨床表現(xiàn)的巨大差異尚不能做出合理的解釋，也有待于更深入研究的開展。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。