蔡 瑩，孔凡叢，丁慶慶綜述，楊 燕,2審校

線粒體是細(xì)胞中制造能量的結(jié)構(gòu)，通過三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的形式提供能量，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原應(yīng)激，從而在細(xì)胞存活中發(fā)揮重要作用[1]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中，線粒體調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和各種凋亡途徑，對(duì)神經(jīng)元的存活和死亡至關(guān)重要。線粒體結(jié)構(gòu)為桿狀(0.75～3 mm)，為真核細(xì)胞中雙層膜包被的細(xì)胞器，其外膜和內(nèi)膜包含磷脂和蛋白質(zhì)。與線粒體外膜(outer membrane of mitochondria，OUM)相比，線粒體內(nèi)膜(inner membrane of mitochondria,IMM)更復(fù)雜，折疊強(qiáng)度更大，大分子相對(duì)不易滲透。線粒體外膜(OUM)光滑，能滲透大量的營養(yǎng)物質(zhì)、離子和能量分子(ATP和ADP)。IMM的不透水特性對(duì)于維持線粒體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)以及線粒體的完整性至關(guān)重要。IMM中的不同離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有助于線粒體與外部環(huán)境之間的通信。例如，鈣(Ca2+)通過能量驅(qū)動(dòng)的單向轉(zhuǎn)運(yùn)體從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入線粒體，而Ca2+從線粒體向細(xì)胞質(zhì)的流出是由離子梯度驅(qū)動(dòng)的反向轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)節(jié)。氧化應(yīng)激增加和能量代謝受損會(huì)損害Ca2+穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致鈣超載和錯(cuò)誤轉(zhuǎn)運(yùn)。這種異常情況導(dǎo)致鈣通過非選擇性通道快速流出，最終導(dǎo)致mPTP的形成[2]。

1 mPTP的結(jié)構(gòu)與功能

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)由Hunter等人發(fā)現(xiàn)，是存在于線粒體內(nèi)外膜之間的一組蛋白復(fù)合體，是一種峰電導(dǎo)為～1.3 nS 的非選擇性通道。通透性轉(zhuǎn)換(permeability transition,PT)是指線粒體內(nèi)膜(IMM)對(duì)分子量高達(dá)1.5 kDa的離子和溶質(zhì)的通透性增加，導(dǎo)致線粒體基質(zhì)腫脹，細(xì)胞通過凋亡(程序性細(xì)胞死亡)和壞死(非程序性自溶)而死亡[3]。直到最近，mPTP的結(jié)構(gòu)仍存在爭議，目前認(rèn)為mPTP包括OMM中的電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)、IMM中的腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)子(adenine nucleotide translocator,ANT)和線粒體基質(zhì)中的親環(huán)素D(cyclophilin D,CypD)[4]。VDAC有助于線粒體外膜的通透性并與線粒體的苯二氮卓受體相關(guān)，因此它們調(diào)節(jié)線粒體外膽固醇向膜間隙的轉(zhuǎn)移。ANT允許腺嘌呤核苷酸的磷酸化和非磷酸化衍生物通過IMM流入，CypD是線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的關(guān)鍵組成部分，因具有肽丙異構(gòu)酶活性而有助于蛋白質(zhì)折疊，CypD也與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)[2]。

在正常生理?xiàng)l件下，mPTP的所有成分都被解聚；而在凋亡或應(yīng)激刺激下這些成分會(huì)結(jié)合形成1.0～1.3 nm的孔隙，觸發(fā)分子的非選擇性通量。鑒于mPTP形成的機(jī)制基礎(chǔ)，研究人員提出mPTP的形成是由IMM中的ANT與CypD的結(jié)合引發(fā)的，其中CypD從線粒體基質(zhì)轉(zhuǎn)移至IMM。這種結(jié)合促進(jìn)了由ANT和VDAC組成的隧道樣結(jié)構(gòu)的形成，并通過跨越兩個(gè)線粒體膜將線粒體基質(zhì)與胞質(zhì)連接起來。 mPTP的形成不僅是細(xì)胞死亡的關(guān)鍵事件，還對(duì)線粒體的功能和細(xì)胞發(fā)育非常重要[5,6]。使用鈣超載模型，發(fā)現(xiàn)mPTP開放需要組裝ATP酶(C-亞基)、無機(jī)多磷酸鹽(polyP)和聚羥基丁酸酯(PHB)[7]。

除了以上成分，F(xiàn)1F0-ATP合成酶是mPTP孔型結(jié)構(gòu)的組成成分，也參與mPTP開放。Bonora等使用遺傳方法表明F1F0 ATP合成酶二聚體的解離和C環(huán)的參與在mPTP誘導(dǎo)中至關(guān)重要[8]。Baev等利用光散射，熒光和電子顯微鏡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)鈣誘導(dǎo)的PTP在低滲溶液中被顯著抑制[9]。使用基于RNAi的篩選方法，Shanmughapriya等證實(shí)了痙攣性截癱7(spastic paraplegia 7，SPG7)在Ca2+和ROS誘導(dǎo)的PTP開放中的必要性作用,并提出SPG7是構(gòu)成PTP復(fù)合體并調(diào)節(jié)其功能的保守核心組成部分[10]。關(guān)于VDAC和ANT參與mPTP形成的研究報(bào)道尚存在差異，這提示還存在可促進(jìn)mPTP形成的其他重要分子成分，但CypD被認(rèn)為在mPTP的組成中至關(guān)重要。 mPTP開放與各種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，包括阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)、朊病毒病 (prion disease)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(motor neuron disease,MND)，亨廷頓舞蹈癥(Huntington disease,HD)、脊髓性肌萎縮癥(Spinal muscular atrophy,SMA)和肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)[1]。mPTP開放的特征在于整個(gè)IMM的電化學(xué)勢能的解耦聯(lián)和線粒體滲透性的紊亂，伴隨著Ca2+的錯(cuò)誤轉(zhuǎn)運(yùn)和線粒體中ATP生成減少。當(dāng)mPTP開放時(shí)，通過凋亡途徑發(fā)生細(xì)胞死亡，這會(huì)導(dǎo)致氧化磷酸化和ATP水解的機(jī)制減少。在此過程中，充足的ATP和mPTP的瞬時(shí)開放導(dǎo)致細(xì)胞色素C通過線粒體釋放，其激活半胱天冬酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)和線粒體驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞凋亡。與細(xì)胞凋亡相反，持續(xù)和廣泛的mPTP開放通過介導(dǎo)氧化磷酸化的解偶聯(lián)來限制ATP合成。隨著高能量需求的開始和ATP產(chǎn)生的減少，細(xì)胞團(tuán)失去其結(jié)構(gòu)和功能完整性，導(dǎo)致不可逆的損傷和細(xì)胞死亡[11]。

2 mPTP在不同神經(jīng)退行性疾病中的作用

2.1 AD和mPTP 阿爾茨海默病(AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，其特征在于認(rèn)知功能逐漸下降和神經(jīng)元不可逆轉(zhuǎn)的喪失。AD是老年期最常見的癡呆類型，是隨后導(dǎo)致死亡的主要原因。AD腦的病理特征在于β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成的神經(jīng)炎性斑和tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)。神經(jīng)炎性斑和神經(jīng)原纖維病變均可導(dǎo)致受累腦區(qū)神經(jīng)元的丟失[12]。mPTP的開放可能與在AD腦中觀察到的線粒體功能障礙有關(guān)，mPTP在AD的代謝應(yīng)激中起作用。Bonora M等發(fā)現(xiàn)來自AD患者和AD動(dòng)物模型的腦線粒體中CypD表達(dá)增加[13]。在淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型中，CypD蛋白的基因去除可防止線粒體功能障礙，并改善突觸和認(rèn)知功能喪失，而且從CyPD基因敲除小鼠中獲得的神經(jīng)元顯示出Aβ依賴性活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生減少，鈣緩沖能力增加，線粒體呼吸功能改善以及AD中突觸可塑性異常的減弱[1]。在對(duì)AD患者外周組織線粒體功能障礙的研究中，Maria Jose Perez等研究發(fā)現(xiàn)AD患者皮膚成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出與AD病理影響的神經(jīng)元相似的線粒體損傷跡象，AD成纖維細(xì)胞有線粒體鈣調(diào)節(jié)障礙，并顯示出非特異性線粒體鈣通道的持續(xù)激活，即mPTP。使用環(huán)孢素A (Ciclosporin A,CsA)藥物阻斷mPTP的作用可以阻止AD成纖維細(xì)胞線粒體超氧化物水平的增加，改善AD成纖維細(xì)胞線粒體和胞質(zhì)鈣的失調(diào)[14]。

神經(jīng)毒性聚集體的沉積是由毒性肽的過量產(chǎn)生和清除機(jī)制的功能障礙介導(dǎo)的。這些聚集體會(huì)誘發(fā)神經(jīng)元的功能障礙，導(dǎo)致認(rèn)知和記憶障礙，而且自由基生成和鈣平衡失調(diào)會(huì)增加聚集體的神經(jīng)毒性作用。Aβ的存在已在人AD腦和轉(zhuǎn)基因(Tg)AD動(dòng)物模型的線粒體中得到證實(shí)[15]。關(guān)于線粒體中的Aβ是原位產(chǎn)生還是輸入的尚有爭議，Picone P等提出Aβ來源于細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)池，然后在線粒體中內(nèi)化[16]。Aβ和CypD之間的相互作用導(dǎo)致mPTP的形成，線粒體電位降低、線粒體呼吸功能降低、自由基形成增加、導(dǎo)致氧化應(yīng)激和促凋亡蛋白的釋放。鑒于AD的病理生理級(jí)聯(lián)反應(yīng)起始于mPTP形成，針對(duì)mPTP的治療性干預(yù)可能有助于逆轉(zhuǎn)該疾病病理。目前，mPTP已作為神經(jīng)退行性疾病的潛在藥物靶點(diǎn)廣泛研究。

2.2 PD和mPTP 帕金森病(PD)目前影響全球約630萬人，預(yù)計(jì)到2030年將影響800萬～900萬人。它主要通過黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta,SNPc)中多巴胺能神經(jīng)元的喪失和突觸前神經(jīng)元細(xì)胞中過量α-突觸核蛋白的存在來影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，該疾病的主要臨床表現(xiàn)有靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢平衡障礙。細(xì)胞氧化還原狀態(tài)受損、代謝缺陷和線粒體功能障礙在PD中有報(bào)道，Ca2+穩(wěn)態(tài)、α-突觸核蛋白聚集體的喪失、線粒體呼吸復(fù)合物I缺陷和線粒體自噬也與PD有關(guān)[17]。與AD相似，PD通過線粒體功能障礙以相同的方式形成mPTP，包括一系列事件：IMM去極化、受損的氧化磷酸化、ROS產(chǎn)生增加、線粒體基質(zhì)腫脹、IMM嵴去折疊、Ca2+穩(wěn)態(tài)喪失、以及通過OMM釋放凋亡蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Ludtmann MHR等研究發(fā)現(xiàn)LRRK2的缺失、抑制和突變能導(dǎo)致通過Na+/Ca2+/ Li+交換體(NCLX)進(jìn)行的的線粒體Ca2+排出受損，進(jìn)而降低線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(PTP)的開放閾值并增加細(xì)胞死亡。NCLX活性可以通過直接(擬磷酸NCLX突變體)和間接(蛋白激酶A)激活來恢復(fù)，反過來提高了PTP開放閾值。這可能為PD的治療提供一種新的策略[18]。

2.3 HD和mPTP 亨廷頓舞蹈病(Huntington disease,HD)是一種遺傳性常染色體顯性遺傳病，神經(jīng)元代謝和能量處理的缺陷是HD腦的主要特征。其臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)功能障礙和精神障礙，并伴有癡呆。HD是由于亨廷頓基因(Htt)CAG重復(fù)序列的異常擴(kuò)增導(dǎo)致亨廷頓蛋白質(zhì)(mHtt)中聚谷氨酰胺的病理延長，進(jìn)一步損害腦細(xì)胞所致。目前Htt在細(xì)胞中以及病理機(jī)制中的作用尚不明確。越來越多的證據(jù)表明線粒體損傷參與了該病的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展。 在細(xì)胞和鼠類HD模型中，多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)了線粒體紊亂，包括鈣處理缺陷、去極化、線粒體運(yùn)輸能力下降、ATP產(chǎn)生減少以及活性氧(ROS)增多。系統(tǒng)分析表明，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)可能是影響線粒體的這些變化的原因。阻斷mPTP活性不僅可以預(yù)防整體的線粒體缺陷，還可以逆轉(zhuǎn)Htt引起的腦病變。因此，進(jìn)一步了解Htt是否通過mPTP直接或間接影響線粒體功能，對(duì)于確定HD的病理進(jìn)展和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)具有重要意義[1,19]。

3 mPTP是一種潛在的藥物靶點(diǎn)

不可逆的mPTP形成與各種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，制定藥理學(xué)和遺傳學(xué)干預(yù)措施抑制mPTP的形成為治療神經(jīng)退行性疾病提供了方向。

目前認(rèn)為，在所有參與mPTP形成的組分中，CypD發(fā)揮關(guān)鍵作用。在阿爾茨海默病(AD)中，線粒體功能障礙是誘發(fā)突觸損傷和神經(jīng)應(yīng)激的關(guān)鍵。AD患者的線粒體表現(xiàn)出呼吸功能、能量代謝和線粒體形態(tài)的改變[20,21]。與非AD腦的線粒體相比，從AD患者大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)分離的線粒體中CypD的表達(dá)顯著增加。Du H等研究發(fā)現(xiàn)CypD表達(dá)增加與Aβ表達(dá)增加呈正相關(guān)，二者具有結(jié)合親和力，而且具有序列特異性。表達(dá)APP突變的AD小鼠模型與其同窩對(duì)照組相比，也表現(xiàn)出大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)CypD表達(dá)增加[15]。有研究使用mAPP模型建立mPTP形成過程中發(fā)生的各種事件，包括使皮質(zhì)線粒體中IMM的CypD表達(dá)增加、Ca2+穩(wěn)態(tài)改變和線粒體腫脹，并進(jìn)行了消融CypD以防止mPTP形成的研究[2]，使用CypD抑制劑環(huán)孢菌素A消除CypD也可以減輕這些不利影響[14]。

線粒體F1Fo ATP合酶失調(diào)是一種典型的線粒體缺陷，導(dǎo)致該疾病中氧化磷酸化的失敗。寡霉素敏感性相關(guān)蛋白(Oligomycin sensitivity conferring protein,OSCP)是至關(guān)重要的F1Fo ATP合酶亞基。OSCP水平降低以及OSCP與β淀粉樣蛋白(Aβ)的相互作用構(gòu)成了AD相關(guān)疾病中F1Fo ATP合酶病理的關(guān)鍵方面。目前促進(jìn)這種與AD相關(guān)的OSCP變化的詳細(xì)機(jī)制尚未闡明。Gauba E等在AD患者以及AD小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，CypD可能是AD相關(guān)疾病中介導(dǎo)OSCP缺陷的關(guān)鍵媒介，AD小鼠模型中CypD缺失可以使OSCP的改變減少，F(xiàn)1Fo ATP合酶功能得以保留，線粒體生物能量學(xué)得以恢復(fù)以及小鼠的認(rèn)知能力得到改善。AD治療中線粒體功能障礙的一種治療策略[22]。Thomas B等采用神經(jīng)毒素MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6 -四氫吡啶)制備的急性PD小鼠模型模型中，與對(duì)照組小鼠相比，CypD基因敲除(Ppif-/-)組顯示出明顯的細(xì)胞保護(hù)作用[23]。在急性大腦中動(dòng)脈閉塞和再灌注后，CypD缺陷小鼠的腦梗死面積也顯著減少，有力地支持了CypD在鈣超載和氧化應(yīng)激受到影響的缺血性損傷模型中具有重要作用。同樣，在體外研究中，CypD在線粒體通透性轉(zhuǎn)換(CyD-mPT)中的重要作用在谷氨酸引發(fā)的延遲鈣失調(diào)(delayed calcium deregulation,DCD)和興奮毒性細(xì)胞死亡中得到驗(yàn)證。與對(duì)照小鼠相比，來自Ppif-/-小鼠的皮質(zhì)神經(jīng)元對(duì)DCD和細(xì)胞死亡更耐受。

以上研究均表明CypD是預(yù)防慢性神經(jīng)退行性疾病進(jìn)展的強(qiáng)有力的作用靶點(diǎn)。為了確定mPTP形成在神經(jīng)退行性疾病進(jìn)展中的作用，臨床研究主要使用CypD抑制劑環(huán)孢菌素。但是環(huán)孢菌素作為研究CypD抑制和線粒體功能障礙的臨床工具具有一定的局限性，主要包括其毒性和免疫抑制作用，其他方面包括組織穿透力和血腦屏障的穿透力低等[1]。Warne J等設(shè)計(jì)并合成了一種新的線粒體靶向CypD抑制劑JW47，其使用喹諾鹽陽離子與環(huán)孢霉素結(jié)合。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，JW47表現(xiàn)出對(duì)軸突的顯著保護(hù)作用，并通過最少的免疫抑制改善了運(yùn)動(dòng)評(píng)估[24]。Ahmed-Belkacem等人利用基于核磁共振(NMR)和X射線晶體學(xué)等方法生成了一種新的非肽類小分子親環(huán)素抑制劑家族，與CsA無關(guān)，具有很強(qiáng)的體外PPIase抑制活性[25]。Elkamhawy A等測定了28種新型吡嗪基脲對(duì)β淀粉樣蛋白(Aβ)誘導(dǎo)的mPTP開放的對(duì)抗作用，其中17種化合物對(duì)Aβ誘導(dǎo)的mPTP開放的神經(jīng)保護(hù)作用優(yōu)于CsA。其中1-[3-(芐氧基)(吡嗪-2-基)-3-(3,4-二氯苯基)脲(5)]、1-[3-(benzyloxy)(pyrazin-2-yl)-3-(3,4- dichlorophenyl)urea (5)]在ATP測定和MTT測定中有效地維持了線粒體功能和細(xì)胞活力[26]。

今后，多種藥理學(xué)方法的使用將通過增加候選分子的藥物樣特性和生物活性來促進(jìn)新藥物的開發(fā)，例如增強(qiáng)線粒體生物發(fā)生、抑制過量的線粒體ROS產(chǎn)生和mPTP開放。候選藥物分子可以通過最佳擬合合成，半合成和微生物分子的虛擬篩選及其化學(xué)轉(zhuǎn)化得到新型活性類似物，并使用計(jì)算機(jī)模擬定量結(jié)構(gòu)活性關(guān)系(quantitative structure-activity relationships,QSAR)建模、分子對(duì)接、吸收、分布、代謝、排泄和毒性研究，以設(shè)計(jì)出具有更高生物利用度、更低毒性、穿過血腦屏障及其他特性的藥物。

4 小 結(jié)

綜上所述，線粒體功能障礙和mPTP形成在介導(dǎo)神經(jīng)退行性疾病中具有重要作用。盡管與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的mPTP形成的結(jié)構(gòu)和機(jī)制基礎(chǔ)尚未明確闡明，但用mPTP抑制劑獲得的結(jié)果表明其作為治療各種神經(jīng)退行性疾病的潛在靶點(diǎn)具有良好前景。利用QSAR建模等優(yōu)化技術(shù)進(jìn)行藥物開發(fā)也有助于篩選虛擬模擬物及其藥物樣潛能。