王佳慧 綜述 陸金春 梁元姣 審校

東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院/東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（江蘇南京 210037）

精子冷凍保存技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人類(lèi)輔助生殖。近十余年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)始探索無(wú)冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍，并獲得了一定的成功[1]。多項(xiàng)研究資料顯示[2]，使用無(wú)冷凍保護(hù)劑的玻璃化冷凍正常精液標(biāo)本可取得與常規(guī)慢速冷凍相同的臨床效果。但在這些報(bào)道的無(wú)冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍研究中，實(shí)際上均存在一些非滲透性的冷凍保護(hù)劑，而所謂的無(wú)冷凍保護(hù)劑是指無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑。本文將對(duì)無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍的可行性、具體實(shí)施方法、面臨的問(wèn)題及可能的應(yīng)對(duì)策略進(jìn)行綜述，以期為未來(lái)臨床常規(guī)開(kāi)展無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍技術(shù)提供指導(dǎo)。

一、無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍的可行性

玻璃化冷凍是指細(xì)胞及其保護(hù)劑溶液在足夠高的降溫速率下，由液相直接轉(zhuǎn)變成玻璃狀的固體狀態(tài)，并以這種玻璃態(tài)在低溫下長(zhǎng)期貯存的技術(shù)。在玻璃化的過(guò)程中，無(wú)冰晶形成，避免了冰晶對(duì)細(xì)胞的物理及化學(xué)損傷，有效保留了細(xì)胞的生物活性與基本功能，可獲得較傳統(tǒng)慢速冷凍方法更好的冷凍效果[3]。理論上，玻璃化冷凍相比于傳統(tǒng)的慢速冷凍方法，操作更為簡(jiǎn)便、耗時(shí)更短、費(fèi)用更低、凍融效果更好、精子存活率更高。然而，由于玻璃化冷凍一般使用了高濃度冷凍保護(hù)劑，包括滲透性冷凍保護(hù)劑和非滲透性冷凍保護(hù)劑[4]，而滲透性冷凍保護(hù)劑具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，同時(shí)人類(lèi)精子對(duì)滲透性冷凍保護(hù)劑毒性又極其敏感，使得玻璃化冷凍融解后的精子存活率和活動(dòng)率均顯著降低[5]。

滲透性冷凍保護(hù)劑也稱(chēng)為膜內(nèi)保護(hù)劑，常用的有甘油、二甲基亞砜（DMSO）、丙二醇、乙二醇等，均為小分子化合物。這類(lèi)保護(hù)劑能夠自由通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，提高細(xì)胞內(nèi)液體的粘滯系數(shù)和溶質(zhì)濃度，從而抑制細(xì)胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生，減輕冷凍及復(fù)溫過(guò)程中細(xì)胞皺縮和滲透性腫脹，但同時(shí)對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能造成明顯損傷。甘油不僅會(huì)影響細(xì)胞微管和微絲的組成和功能，損傷精子細(xì)胞骨架，而且能使蛋白質(zhì)變性、肌動(dòng)蛋白相互作用及破壞精子線粒體及質(zhì)膜完整性，甚至對(duì)受精后胚胎的發(fā)展產(chǎn)生不利影響，并且甘油量添加過(guò)高時(shí)，精子的頂體膜結(jié)構(gòu)會(huì)受到損傷，導(dǎo)致解凍后精子的受精能力下降[6]；DMSO是一種含硫有機(jī)化合物，毒性較高，不僅會(huì)與蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆結(jié)合，而且易導(dǎo)致果糖-1，6-二磷酸酶的活性喪失[7]；乙二醇易致精子尾部畸形等[8]。此外，復(fù)溫時(shí)，精子對(duì)水的滲透性高于滲透性冷凍保護(hù)劑，在滲透性冷凍保護(hù)劑尚未完全滲出細(xì)胞外的情況下，大量水的進(jìn)入可引起精子頂體過(guò)度膨脹、破裂，造成精子滲透性休克[9]。

那么，無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍是否可行？這是大家所關(guān)心的關(guān)鍵問(wèn)題。精子是可以相對(duì)容易實(shí)現(xiàn)無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的玻璃化冷凍的細(xì)胞，這是由其自身特點(diǎn)所決定的。與卵母細(xì)胞或胚胎相比，精子中的一些大分子結(jié)構(gòu)如DNA、組蛋白、透明質(zhì)酸酶的含量更高，可達(dá)胚胎的6-8倍[10]，且含水量較低，這就大大提高了精子內(nèi)胞質(zhì)液體粘滯系數(shù)，同時(shí)精子的頭部相對(duì)較小，冷凍穩(wěn)定性好，使得在無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑，但降溫速率足夠高的情況下，精子形成玻璃樣固體狀態(tài)成為可能。有間接證據(jù)表明[11]，精子細(xì)胞內(nèi)成分可以起到天然冷凍保護(hù)劑的作用，所有物種中滲透性最弱的小鼠精子可以在僅有非滲透性冷凍保護(hù)劑而沒(méi)有滲透性冷凍保護(hù)劑的情況下成功冷凍。另一方面，冷凍過(guò)程中的降溫速率與細(xì)胞內(nèi)冰晶形成直接相關(guān)。如果降溫速率極快，精子可迅速達(dá)到一種介于液態(tài)與固態(tài)之間、非晶體、透明的玻璃態(tài)，這不僅可保留細(xì)胞內(nèi)外正常的離子分布，而且可避免冰晶形成對(duì)精子細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架的物理?yè)p傷。研究顯示[12]，玻璃化冷凍過(guò)程中，冷凍速度越快，實(shí)現(xiàn)玻璃化冷凍所需要的滲透性冷凍保護(hù)劑的濃度越低。因此，當(dāng)精子冷凍速度達(dá)到一定程度時(shí)，無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍就可實(shí)現(xiàn)。

據(jù)此可知，要實(shí)現(xiàn)無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍，精子細(xì)胞內(nèi)較高的液體粘滯系數(shù)是基礎(chǔ)，而更高的降溫速率是保證。

二、無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍的具體實(shí)施方法

要成功實(shí)施無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍，降溫速率要足夠快，且要保證所有精子均快速進(jìn)入玻璃態(tài)，最好的方法就是：1.改變冷凍方式，采用快速降溫程序；2.改變冷凍載體，使液體樣本體積更小，而液體表面積/體積比更大；3.在冷凍保護(hù)液中添加合適的組分，以更好地保護(hù)精子免受損傷。

（一）冷凍方式的改變

目前精子玻璃化冷凍方式主要有，直接將精子樣本投入液氮中和經(jīng)液氮熏蒸后再投入液氮中。丁露等[13]使用改良麥管法和凍存管法比較了液氮熏蒸和不經(jīng)液氮熏蒸的精子玻璃化冷凍復(fù)蘇效果，發(fā)現(xiàn)前者的精子復(fù)蘇率和活動(dòng)率顯著高于后者(P<0.05)。這可能與精子樣本直接投入液氮時(shí)，液氮被加熱引起沸騰產(chǎn)生氮?dú)庥嘘P(guān)，因?yàn)榇藭r(shí)產(chǎn)生的氮蒸汽將圍繞精子細(xì)胞形成一層蒸汽薄膜將精子與液氮隔離,從而減慢了溫度的傳遞速度,降低了冷凍速率。而經(jīng)液氮熏蒸后，精子樣本已被大大降溫，再浸入液氮時(shí)可避免液氮沸騰，從而避免蒸汽薄膜在精子細(xì)胞表面形成。理論上,要獲得更高的冷凍速率最好是經(jīng)液體導(dǎo)熱而不是蒸汽,液體的熱傳導(dǎo)要比蒸汽快得多。

（二）冷凍載體的選擇

降低液體樣本體積和增大表面積/體積比，主要通過(guò)冷凍載體來(lái)實(shí)現(xiàn)。理論上，只要我們能找到承載樣本量最少、表面積與體積比最大的載體，就可以通過(guò)超快的冷卻速率實(shí)現(xiàn)無(wú)冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍。根據(jù)精子是否與液氮直接接觸，冷凍載體可分為開(kāi)放性載體和封閉性載體。目前報(bào)道的開(kāi)放性載體主要有冷凍環(huán)、冷凍薄膜、微滴載體等，而封閉性載體主要有封閉式薄片、一些新發(fā)明的載體等。就冷凍效果而言，開(kāi)放性載體的降溫效果更好，但會(huì)存在污染風(fēng)險(xiǎn)。如果確保液氮內(nèi)或冷凍容器表面無(wú)菌，可選用開(kāi)放性載體。

運(yùn)用冷凍環(huán)和冷凍薄膜的表面張力，可將精子附著在環(huán)或膜的表面。將其直接投入到液氮中時(shí)，可使降溫速率從傳統(tǒng)麥管的2500℃/min提高到20000℃/min，易于實(shí)現(xiàn)玻璃化。研究發(fā)現(xiàn)[14]，采用冷凍環(huán)進(jìn)行無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍，在降低冷凍損傷和縮短耗時(shí)方面有著常規(guī)慢速冷凍法難以實(shí)現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)，且復(fù)溫后精子染色質(zhì)的凝聚和DNA完整性與新鮮精子相當(dāng)。微滴載體冷凍精子樣本的體積稍大于冷凍環(huán)，研究表明[15]，微滴法可以替代常規(guī)慢速冷凍管法冷凍附睪微量精子，在沒(méi)有明顯增加精子核DNA損傷的同時(shí)能回收較多可利用的精子。

馬超等[16]采用封閉式薄片為載體，發(fā)現(xiàn)有、無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑玻璃化冷凍的人類(lèi)精子解凍后，精子回收率、活動(dòng)率及存活率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，從而證實(shí)添加滲透性冷凍保護(hù)劑并不能改變解凍后的精子相關(guān)指標(biāo)。羅樹(shù)偉等[17]通過(guò)對(duì)普通胚胎冷凍麥管進(jìn)行改造（下端3cm區(qū)域采用細(xì)砂紙將外側(cè)面打磨粗糙，并將麥管打磨區(qū)域沿麥管軸線剪一1/8圓周的細(xì)縫，然后選擇大小合適的輸液針套將麥管打磨區(qū)域套住）后，制備了一種新型無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍載體。與開(kāi)放性精子載體相比，冷凍前后精子存活率及活力無(wú)明顯差異，但液體承載量明顯增加 （從1μl增加至5μl）。 另外，空透明帶、電鏡銅網(wǎng)(EMG)、微麥管、ICSI針、極體活檢針、Cryoleaf、Cell Sleeper、Cryopiece 等，理論上也可進(jìn)行無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍，但相關(guān)報(bào)道較少。

（三）冷凍稀釋液的改善

為了進(jìn)一步提高冷凍復(fù)蘇后的精子質(zhì)量，盡可能保護(hù)精子避免冷凍損傷，許多研究者嘗試在精子冷凍稀釋液中添加一些組分，其中以抗氧化劑、避免精子膜損傷的物質(zhì)最常見(jiàn)。通過(guò)在冷凍稀釋液中添加某些組分以改善冷凍復(fù)蘇后精子活動(dòng)率、保護(hù)精子正常受精率是目前精子冷凍保存的研究熱點(diǎn)之一。

除了在冷凍稀釋液中添加一般的非滲透性冷凍保護(hù)劑如卵黃、白蛋白、蔗糖或海藻糖等外，海帶多糖、枸杞多糖、紅景天多糖、益母草多糖、絞股藍(lán)多糖、丹參多糖等亦被報(bào)道[18-19]，這些多糖除了可增加精子活動(dòng)率和存活率外，亦可保護(hù)精子質(zhì)膜完整性、線粒體活性、頂體完整性，并提高超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶等抗氧化酶活性，從而抑制活性氧的產(chǎn)生。另外，由于多糖類(lèi)有一定的粘性，能夠粘附于精子外圍，在冷凍過(guò)程中亦可減少因冰晶產(chǎn)生而對(duì)精子細(xì)胞造成的破壞。

除此之外，目前已報(bào)道的冷凍稀釋液中添加的組分還有：1.抗氧化劑類(lèi)，可分為非酶類(lèi)抗氧化劑和酶類(lèi)抗氧化劑，前者包括維生素C、維生素E、L-半胱氨酸、谷胱甘肽、蛋氨酸、谷氨酰胺、肉堿、麥角硫因、?；撬帷喤；撬?、亞油酸、褪黑素、丙酮酸、二硫赤鮮醇、鋅、硒、白藜蘆醇、蘋(píng)果多酚、葡萄籽原花青素、番茄紅素、線粒體靶向肽Elamipretie等物質(zhì)[20-25]；后者包括過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、輔酶Q10及其衍生物等[26-28]。以前者研究較多，這些抗氧化劑一般可提高精子活動(dòng)率、存活率、頂體完整性、質(zhì)膜完整性、線粒體活性、SOD及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性等，降低精子畸形率、DNA損傷和丙二醛（MDA）水平。2.黃嘌呤衍生物：包括咖啡因、己酮可可堿、可可堿等，它們可增加細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度,從而增強(qiáng)精子的活動(dòng)能力，促進(jìn)精子獲能和頂體反應(yīng)等。但有研究發(fā)現(xiàn)[29]，精子長(zhǎng)時(shí)間接觸咖啡因或己酮可可堿后，形態(tài)和膜完整性受到損害，可能會(huì)由于能量耗盡而影響生育潛力。3.三磷酸腺苷(ATP)：其不僅能提高精子活力，也可增強(qiáng)精子頂體反應(yīng)，從而提高卵子受精力[30]。4.血小板活化因子（PAF）：其與精子表面的受體結(jié)合后可誘導(dǎo)三磷酸肌醇形成，進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度。已有研究證實(shí)[31]，PAF可通過(guò)影響精子的運(yùn)動(dòng)能力、獲能和頂體反應(yīng)來(lái)影響精子生育能力。5.自體精漿：如果通過(guò)梯度離心法等去除精漿中部分有害物質(zhì)如活性氧、白細(xì)胞等，而保留有利于精子的成分，自體精漿可能有助于提高精子質(zhì)量和活動(dòng)精子回收率[32]。6.抗凍蛋白Ⅲ（AFPⅢ）：可通過(guò)降低冰點(diǎn)來(lái)抑制冰晶的形成。Saeed等研究發(fā)現(xiàn)[33]，在人精子冷凍培養(yǎng)液中添加1μg/ml AFPⅢ（最佳劑量）可以提高精子冷凍后的活動(dòng)率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、存活率和質(zhì)膜完整性。7.其他：包括脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞（Ad-MSCs）[34]、L-肉堿[35]、二甲雙胍[36]等。

三、無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍所面臨的問(wèn)題及可能的應(yīng)對(duì)策略

盡管目前已有報(bào)道[37]，使用無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑進(jìn)行玻璃化冷凍復(fù)蘇后的精子，通過(guò)卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（ICSI）后成功獲得健康嬰兒，但這樣的報(bào)道畢竟是個(gè)案，且基本為稀少精子冷凍，其是否適合精子庫(kù)常規(guī)冷凍精液以及卵子和胚胎的冷凍，以及其操作的標(biāo)準(zhǔn)化、具體的保存機(jī)制及未來(lái)對(duì)嬰兒健康的影響如何，尚不清楚。目前，無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍仍面臨諸多問(wèn)題。

一是術(shù)語(yǔ)的規(guī)范化。目前一些文獻(xiàn)報(bào)道中均是以“無(wú)冷凍保護(hù)劑（cryoprotectant-free）”來(lái)描述精子的玻璃化冷凍，可在實(shí)際冷凍時(shí)冷凍稀釋液中均存在一些非滲透性冷凍保護(hù)劑[38]，故標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)應(yīng)為“無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍”。

二是缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的冷凍流程。目前文獻(xiàn)報(bào)道的玻璃化冷凍程序包括液氮熏蒸或直接投入液氮中，液氮熏蒸時(shí)距離液氮面的距離和熏蒸時(shí)間均有差異，而直接投入液氮時(shí)不同的冷凍載體，由于接觸液氮時(shí)產(chǎn)生的液氮蒸汽的影響不同，結(jié)果可能有很大差異。未來(lái)應(yīng)對(duì)大家比較認(rèn)可的冷凍程序，經(jīng)過(guò)多中心研究后，建立標(biāo)準(zhǔn)化的冷凍流程。另外，不同類(lèi)型冷凍載體的標(biāo)準(zhǔn)化冷凍流程亦應(yīng)建立。

三是冷凍組分的添加應(yīng)有大量實(shí)驗(yàn)依據(jù)后方可應(yīng)用于臨床。目前，關(guān)于添加組分的研究存在如下問(wèn)題：1.同一組分在不同研究中有不同結(jié)論；2.一些研究是針對(duì)不同動(dòng)物精子進(jìn)行的，其是否適用于人類(lèi)精子尚缺少依據(jù)；3.一些組分是在常規(guī)精子冷凍中進(jìn)行的，其是否適合玻璃化冷凍亦需證實(shí)；4.一些添加組分并非人體或細(xì)胞內(nèi)固有成分，其雖然能改善精子活力，但對(duì)精子代謝、未來(lái)受精卵及胚胎的發(fā)育是否有影響尚需驗(yàn)證；5.文獻(xiàn)報(bào)道的如此多的組分，可否篩選出一個(gè)最優(yōu)化的適合人類(lèi)精子的組分組合，經(jīng)多中心研究驗(yàn)證后，以應(yīng)用于臨床。

四、結(jié)語(yǔ)

理論上，卵母細(xì)胞、胚胎、睪丸及卵巢組織以及其它細(xì)胞組織也適合無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的玻璃化冷凍，但相關(guān)研究極少。無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍技術(shù)雖有一些正常妊娠和分娩的案例，但要走向臨床常規(guī)使用仍需大量研究驗(yàn)證。未來(lái)有關(guān)無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍的研究應(yīng)集中在：1.探索無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的精子玻璃化冷凍過(guò)程中的精子損傷機(jī)制；2.篩選并確定對(duì)精子功能有保護(hù)作用、對(duì)未來(lái)胚胎發(fā)育無(wú)害的非滲透性冷凍保護(hù)劑及添加組分，及其最佳劑量、組合及最佳添加時(shí)間；3.進(jìn)一步優(yōu)化和開(kāi)發(fā)適合稀少精子冷凍和常規(guī)精液精子冷凍的載體，并將三維打印技術(shù)應(yīng)用于冷凍載體的制備[39]。4.建立包括精液處理、冷凍、復(fù)蘇等全過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)化冷凍程序；5.開(kāi)發(fā)新的可以提供極高降溫速率的自動(dòng)化的冷凍設(shè)備，為實(shí)現(xiàn)大容量的無(wú)滲透性冷凍保護(hù)劑的玻璃化冷凍提供物質(zhì)基礎(chǔ)。