梁志偉， 謝秀儀， 羅國楨， 吳苑芳， 鄭怡， 鄧專紅， 梁佩珍

開平市中心醫(yī)院血液科(廣東江門 529300)

慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種起源于多能造血干細胞的惡性克隆性疾病，是常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，以9號染色體和22號染色體易位并產生BCR-ABL融合基因為主要特征[1]。世界衛(wèi)生組織調查研究發(fā)現(xiàn)慢性髓系白血病的發(fā)病率為(3.5～5.5)/10萬，且呈逐年上升的趨勢[2]。以伊馬替尼為代表的酪氨酸激酶抑制劑(TKI)可靶向抑制BCR-ABL蛋白激酶的活性，促進克隆性白血病細胞凋亡，顯著提高CML患者的緩解率和生存率[3]。隨著TKIs藥物的使用，部分患者出現(xiàn)耐藥，大量的研究證據(jù)提示BCR-ABL依賴途徑和BCR-ABL非依賴途徑是導致耐藥的主要原因[4-5]。BCR-ABL異常擴增和ABL激酶區(qū)點突變是BCR-ABL依賴途徑耐藥的主要原因，激酶區(qū)發(fā)生T315I突變時對第1代和第2代的TKI藥物均不敏感[6]。泊那替尼作為第3代TKI藥物，可有效治療出現(xiàn)T315I突變的慢性髓系白血病患者[7]，Breccia等[8]研究認為泊那替尼可通過多種途徑調節(jié)骨髓微環(huán)境，促進白血病細胞凋亡，進一步清除CML細胞。Linder等[9]研究發(fā)現(xiàn)三氧化二砷可通過Notch通路，產生氧化應激反應，促進神經膠質瘤干細胞樣細胞的凋亡。泊那替尼對Notch通路的影響及對T315I突變細胞株增殖和凋亡的影響的相關報道較少。2017年9月至2019年5月期間，本研究通過體外實驗研究泊那替尼對T315I突變細胞株Notch信號通路的影響，為進一步揭示CML患者耐藥機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 T315I突變CML細胞株KBM5R(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院血液病研究所惠贈)、DMSO(美國sigma公司)、泊那替尼原料藥(上海翰香生物制品有限公司)、重組人核轉錄因子-κB(rhNF-κB)(美國Promega公司)、DMEM低糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、噻唑藍(MTT)(美國sigma公司)、Hoechst33258試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)、RIPA裂解液(武漢博士德生物科技有限公司)、抗體均購于美國Abcam公司、酶標儀(德國Bio-Tek公司)、共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)、電泳儀(美國 Corning 公司)、移液器(德國 Eppendorf 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 KBM5R細胞經復蘇后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d傳代1次，待細胞長至對數(shù)生長期后用于實驗。設立對照組(C組)，泊那替尼組(P組)：加入泊那替尼處理細胞，泊那替尼+rhNF-κB組(Pr組)：加入泊那替尼和rhNF-κB共同處理細胞。

1.2.2 MTT檢測細胞的增殖能力 選擇對數(shù)生長期的KBM5R細胞，調整細胞密度為2×104，接種于96孔板中，設立對照組，加入不同濃度的泊那替尼進行處理，濃度分別為：0.5、1、2、5、10、20和50 μmol/L，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄去孔板內液體，每孔加入100 μL含5 mg/mL MTT的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育4 h后棄去上清，加入150 μL的DMSO，震蕩混勻，采用全自動酶標儀檢測各組細胞在570 nm處的吸光度值，計算各組細胞的增殖情況，并計算半數(shù)抑制濃度(IC50)，確定適宜的泊那替尼濃度用于后續(xù)實驗。

選擇對數(shù)生長期的KBM5R細胞，調整細胞密度為2×104，接種于96孔板中，P組加入泊那替尼，Pr組加入泊那替尼和1 μg/mL的rhNF-κB[10]，C組加入等量的DMEM培養(yǎng)基，處理細胞48 h，MTT法檢測各組細胞的增殖情況。

1.2.3 Hoechst染色法檢測細胞的凋亡數(shù)量 采用Hoechst 33258染色檢測細胞的凋亡數(shù)量：選擇對數(shù)生長期的KBM5R細胞，調整細胞密度為5×105，接種于6孔板中，P組加入泊那替尼，Pr組加入泊那替尼和1 μg/mL的rhNF-κB，C組加入等量的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，加入適量的新鮮配置的4%多聚甲醛，固定細胞30 min，用PBS清洗3次，每孔加入50 μL的Hoechest33258染色劑，室溫條件下避光孵育10 min，用熒光顯微鏡觀察細胞的狀態(tài)，記錄各組細胞的凋亡情況：若細胞的胞核出現(xiàn)高亮的藍色則表明細胞出現(xiàn)凋亡，記為凋亡細胞。

1.2.4 DCFH-DA檢測細胞的活性氧(ROS)水平 采用DCFH-DA檢測細胞的ROS水平：選擇對數(shù)生長期的KBM5R細胞，調整細胞密度為5×105，接種于6孔板中，P組加入泊那替尼，Pr組加入泊那替尼和1 μg/mL的rhNF-κB，C組加入等量的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μmol/L的DCFH-DA，37℃避光孵育20 min，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗，調節(jié)共聚焦顯微鏡的激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm，檢測各組細胞的熒光強度，評價細胞內ROS的水平。

1.2.5 Western blot檢測相關蛋白的表達水平 采用Western blot檢測各組細胞凋亡相關蛋白和Notch通路相關蛋白的表達水平：選擇對數(shù)生長期的KBM5R細胞，調整細胞密度為5×105，接種于6孔板中，P組加入泊那替尼，Pr組加入泊那替尼和1 μg/mL的rhNF-κB，C組加入等量的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，每孔加入適量的RIPA裂解液，加入1%的蛋白酶抑制劑和1%的磷酸酶抑制劑，提取各組細胞的總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定各組細胞蛋白的濃度，制備等濃度的上樣緩沖液后，用15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳、轉膜、新鮮配置的5%脫脂奶粉封閉蛋白條帶1 h。按目的條帶大小切下條帶，4℃孵育兔(Rabbit)-胱天蛋白酶3(Caspase3)、Rabbit-B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Rabbit-Bcl-2相關X蛋白(Bax)、Rabbit-Notch1、Rabbit-發(fā)狀分裂相關增強因子1(Hes1)、Rabbit-血管內皮生長因子(VEGF)和Rabbit-GAPDH過夜，TBST清洗3次，室溫下用辣根過氧化物酶共軛的二抗孵育1 h，TBST清洗3次。配置ECL顯影液，于暗室內曝光、顯影，計算各個蛋白的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，各組間數(shù)據(jù)資料運用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，經方差齊性檢驗，若方差齊性則兩兩比較采用Bonferronic法，若方差不齊將采用Welch法分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 泊那替尼對細胞增殖的影響 10 μmol/L的泊那替尼即可抑制KBM5R細胞的增殖(P<0.01)，IC50=16.07 μmol/L，見圖1。本實驗選擇20 μmol/L的泊那替尼用于后續(xù)實驗。P組加入20 μmol/L的泊那替尼處理細胞，Pr組加入20 μmol/L泊那替尼和1 μg/mL rhNF-κB共同處理細胞，C組加入等量的DMEM培養(yǎng)基，P組的細胞增殖能力顯著低于C組(P<0.01)，Pr組細胞的增殖能力顯著高于P組(P<0.01)，見圖2、表1。

*P<0.01 vs C組

*與C組比較P<0.01; #與P組比較P<0.01

表1 MTT檢測各組細胞的增殖能力

*與C組比較P<0.01；△與P組比較P<0.01

2.2 泊那替尼對細胞凋亡的影響 Hoechst 33258染色結果提示P組細胞的凋亡數(shù)量顯著高于C組(P<0.01)，加入rhNF-κB干預后，Pr組KBM5R細胞的凋亡數(shù)量顯著低于P組(P<0.01)，見圖3～4、表2。

2.3 泊那替尼對細胞內ROS水平的影響 DCFH-DA結果提示P組細胞中ROS的水平顯著高于C組(P<0.01)，加入rhNF-κB干預后，Pr組KBM5R細胞中ROS的水平顯著低于P組(P<0.01)，見圖5～6、表3。

箭頭所指為Hoechst33258染色中呈高亮藍色的細胞

*與C組比較P<0.01；#與P組比較P<0.01

表2 各組細胞的凋亡水平

*與C組比較P<0.01；△與P組比較P<0.01

2.4 泊那替尼對細胞內凋亡相關蛋白的影響 P組細胞內Caspase3的表達水平顯著高于C組(P<0.01)，Bcl-2/Bax的表達水平顯著低于C(P<0.01)，給予rhNF-κB干預可顯著降低Pr組細胞內Caspase3的表達水平，增加Bcl-2/Bax(P<0.01)，見圖7～8、表4。

2.5 泊那替尼對細胞內Notch信號通路的影響 P組細胞內Notch1、Hes1和VEGF的表達均顯著低于C組(P<0.01)，給予rhNF-κB干預后，Pr組細胞內Notch1、Hes1和VEGF的表達均顯著增加(P<0.01)，見圖9～10、表5。

3 討論

TKIs可特異性地抑制BCR-ABL激酶，從而靶向治療CML，大大延長患者的生存期，BCR-ABL激酶區(qū)突變是導致CML患者對TKIs產生耐藥的主要原因。Mat等[11]研究發(fā)現(xiàn)T315I突變可有效降低伊馬替尼、達沙替尼等與BCR-ABL蛋白的結合位點，使得ABL激酶與藥物的結合被阻斷，進而出現(xiàn)耐藥。T315I突變導致蘇氨酸315突變至異亮氨酸，破壞氫鍵，進而使得蛋白的結構和構象發(fā)生改變[12]。泊那替尼作為第3代TKIs類藥物，Ⅱ期臨床研究結果提示T315I突變的CML患者使用泊那替尼可達到70%以上的細胞遺傳學緩解，可有效治療T315I突變的難治性CML[13]。本研究選擇T315I突變的CML細胞株KBM5R進行實驗，結果發(fā)現(xiàn)泊那替尼可有效抑制細胞的增殖，促進細胞的凋亡。

圖5 DCFH-DA檢測細胞內ROS的顯微圖

*與C組比較P<0.01；#與P組比較P<0.01

表3 各組細胞的ROS水平

*與C組比較P<0.01；△與P組比較P<0.01

圖7 Western blot檢測凋亡相關蛋白的表達水平(蛋白條帶圖)

A：Caspase3蛋白統(tǒng)計圖；B：Bcl-2/Bax統(tǒng)計圖;*與C組比較P<0.01；#與P組比較P<0.01

圖8Westernblot檢測凋亡相關蛋白的表達水平

組別Caspase 3/GAPDHBcl-2/BaxC組0.98±0.080.94±0.04P組1.54±0.17*0.42±0.09*Pr組1.28±0.10△0.73±0.06△

*與C組比較P<0.01；△與P組比較P<0.01

圖9Westernblot檢測Notch信號通路相關蛋白的表達水平(蛋白條帶圖)

A：Notch1蛋白統(tǒng)計圖；B：Hes1蛋白統(tǒng)計圖；C：VEGF蛋白的統(tǒng)計圖；*與C組比較P<0.01；#與P組比較P<0.01

圖10Westernblot檢測Notch信號通路相關蛋白的表達水平

組別Notch1/GAPDHHes1/GAPDHVEGF/GAPDHC組0.91±0.070.66±0.080.98±0.07P組0.39±0.10*0.28±0.06*0.49±0.04*Pr組0.81±0.04△0.86±0.05△0.84±0.05△

*與C組比較P<0.01；△與P組比較P<0.01

Notch信號通路是存在于多種生物體內的高度保守的信號通路，參與調控細胞的多個生理過程，與細胞的增殖、凋亡和分化等密切相關[14]；相鄰細胞間的Notch受體與配體相互結合可啟動Notch信號通路，進而激活下游靶蛋白Hes1的表達，發(fā)揮生物學作用[15]。值得注意的是，Notch信號通路在不同的組織中發(fā)揮的調節(jié)作用并不完全相同，Butko等[16]研究認為Notch信號通路可有效促進正常造血干細胞的自我更新，發(fā)揮維持干性的作用，有效抑制干細胞向其他細胞分化；同時，大量的研究證據(jù)提示抑制Notch信號的激活可有效抑制急性髓系白血病細胞的增殖，使得急性髓系白血病細胞生長停滯、凋亡[17-18]；Sengupta等[19]發(fā)現(xiàn)Notch信號通路在急性期的CML患者中被激活的比例增加，急性期CML患者體內Hes1的表達顯著增加；上述的結果均提示Notch信號通路及靶基因Hes1可調控髓系白血病進展。本研究發(fā)現(xiàn)泊那替尼可有效降低KBM5R細胞中Notch1和Hes1的表達，抑制Notch信號通路的激活，進而促進凋亡蛋白的表達，增加細胞內ROS的水平，增加細胞凋亡。同時采用Notch信號通路激動劑rhNF-κB激活Notch后，細胞的增殖顯著增加，凋亡的數(shù)量顯著降低。Kannan等[20]研究認為激活骨髓中Notch信號通路的激活會顯著增加高危急性髓系白血病患者不良預后的風險。本研究還發(fā)現(xiàn)抑制Notch信號通路可顯著降低VEGF的表達，該結果提示泊那替尼通過抑制Notch信號通路，進而減少腫瘤細胞內VEGF的表達，進而發(fā)揮促進KBM5R細胞凋亡的作用。Ikram等[21]研究認為血管發(fā)育及新生與多種血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤細胞對化療藥物的敏感性密切相關。

綜上所述，泊那替尼通過抑制Notch信號通路，降低VEGF的表達，增加T315I突變的CML細胞中ROS的水平，增加凋亡蛋白的表達，促進細胞凋亡，發(fā)揮治療T315I突變CML患者的作用。本研究結果進一步揭示CML細胞出現(xiàn)T315I突變的機制，為T315I突變CML患者的治療藥物選擇提供理論依據(jù)。