陳毅華, 程芳, 何選秋, 周元平, 彭雁忠, 李雅琴, 戴璐, 齊明華△

1北京大學深圳醫(yī)院感染性疾病科(廣東深圳 518035)； 2南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院感染性疾病科(廣東廣州 510515)

高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1, HMGB1)作為一種損傷相關(guān)模式蛋白，于1973年被發(fā)現(xiàn)，屬高遷移率族成員。高遷移率蛋白家族還包括高遷移率族蛋白B2(high mobility group box 2, HMGB2)和高遷移率族蛋白B3(high mobility group box 3, HMGB3)，其特點為分子量低，在凝膠電泳中遷移率高。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)在維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)人體的血壓、水分、電解質(zhì)等中起著非常重要的作用，是人體中一個關(guān)鍵的神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)。RAS主要包括血管緊張素原酶、血管緊張素原、血管緊張素Ⅰ(AngiotensinⅠ，AngⅠ)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，AngⅡ)和血管緊張素受體。目前研究表明，AngⅡ和HMGB1都能在促進腫瘤細胞的遷移、侵襲作用上促進肝癌的發(fā)生發(fā)展和遠處轉(zhuǎn)移，但AngⅡ與HMGB1的作用關(guān)系目前尚不明確。因此，我們于2017年6月至2018年6月通過調(diào)控HMGB1的表達，觀察AngⅡ誘導HepG2發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的變化。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及藥物處理 本研究所用肝癌細胞HepG2由北京大學深圳醫(yī)院中心實驗室保存。HepG2細胞的培養(yǎng)方法參照以前的研究[1]，用DMEM 在37℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，[Gibco DMEM培養(yǎng)基(貨號：C11875500BT)加入10%熱滅活Gibco 胎牛血清(貨號：10099-141)，100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素]。臺盼藍染色法評估細胞活性。

用胰酶消化細胞，接種至培養(yǎng)瓶中，每瓶約106個細胞，利用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋AngⅡ至終濃度為10-7nmol/L。分為表達組、SiRNA靜默組和對照組，表達組和SiRNA靜默組加入含有AngⅡ的培養(yǎng)基，對照組細胞用正常的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃，5% CO2的條件下培養(yǎng)細胞12 h。

1.2 HepG2細胞轉(zhuǎn)染并過表達HMGB1基因 從HepG2細胞中提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA模板，擴增HMGB1基因，引物F:5′-CATGGGCAAAGGAGATCCTAAG-3′,R:5′-CTGCGCTAGAACCAACTTATTC-3′，將擴增的HMGB1基因片段克隆至pMD19-T載體。使用EcoRⅠ酶和HindⅢ酶將酶切后的pcDNA3.1載體和pMD19-HMGB1基因片段，回收酶切產(chǎn)物，將HMGB1基因片段克隆至真核表達載體pcDNA3.1+(Invitrogen，美國)中，構(gòu)建HMGB1真核表達載體pcDNA3.1-HMGB1。EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定HMGB1真核表達載體，將構(gòu)建成功的HMGB1真核表達載體送測序進一步驗證，利用Lipofecamine 3000(Invitrogen, 美國)將帶有人HMGB1基因的載體轉(zhuǎn)染HepG2細胞，同時將pcDNA3.1轉(zhuǎn)染HepG2細胞做空白對照，轉(zhuǎn)染方法操作參照說明書。

1.3 HepG2細胞轉(zhuǎn)染siRNA 根據(jù)Genbank中提供的人HMGB1基因序列，利用siRNA在線設計軟件http://sirna.wi.mit.edu/show_oligo.cgi，設計并合成針對HMGB1基因的siRNA，序列為GGA UAU UGC UGC AUA UCG AUU UCG AUA UGC AGC AAU AUC CUU。轉(zhuǎn)染HEK293細胞株，通過熒光定量PCR驗證HMGB1基因表達改變。

1.4 RT-PCR檢測和Western blot分析 實驗步驟參照說明書，使用Trizol試劑(Invitrogen)提取總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)說明書合成單鏈cDNA。SYBR Green法進行樣品定量檢測，2-ΔΔCt計算相對表達量。ΔCt=(目的基因Ct-內(nèi)參Ct)的平均值±標準差；ΔΔCt=(待測樣品中目的基因ΔCt-參照樣品中目的基因ΔCt)的平均值±標準差(選擇“空載”為參照進行計算)；相對表達量=(2-ΔΔCt)的平均值±標準差。QPCR檢測引物為：HMGB1-上游5′-GCC AAG GAA TCC AGC AGT TTG-3′，HMGB1-下游5′-CCA CCA GGA CAG GGC TAT CT-3′；內(nèi)參引物β-actin-F: 5′-CATCACTGCCACCCAGAAGACT-3′，β-actin-R: 5′-GGTAGGAACACGGAAGGCCAT-3′。同時提取總蛋白后，BCA法初步測定蛋白濃度。樣品蛋白在60℃溶解15 min后聚丙烯梯度電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Milipore,美國)上。雜交膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，后用0.2%的TBST緩沖液室溫洗滌4次。兔抗人HMGB1抗體(Santa Cruz,美國)以1∶3 000進行稀釋。室溫孵育約1 h左右， 顯影后用冷CCD成像儀顯影，使用Image J軟件分析各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算各個蛋白相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件，行t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1基因表達 轉(zhuǎn)染過HMGB1表達載體和HMGB1-siRNA后，通過Wester blot檢測HMGB1基因表達改變。結(jié)果顯示，與對照組相比，HepG2-HMGB1-siRNA細胞中，HMGB1基因表達受到顯著抑制，差異有統(tǒng)計學意義(圖1)。

圖1 HMGB1-siRNA表達HepG2細胞中的效果檢測

2.2 AngⅡ誘導EMT標志蛋白在HMGB1穩(wěn)定過表達及干擾的肝癌細胞中表達的改變 通過Image J軟件分析條帶灰度值，對蛋白條帶進行半定量分析后發(fā)現(xiàn)，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的Western blot 結(jié)果顯示如圖2，與正常HepG2細胞相比，經(jīng)AngⅡ處理后，E-cadherin蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)；與陰性對照相比，HMGB1高表達HepG2細胞經(jīng)AngⅡ處理后，E-cadherin蛋白表達水平顯著下降(P<0.001)；與陰性對照相比，HMGB1干擾的HepG2細胞經(jīng)AngⅡ處理后，E-cadherin蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；經(jīng)AngⅡ處理的HMGB1高表達HepG2細胞與AngⅡ處理的正常HepG2細胞相比，E-cadherin蛋白表達水平顯著下降(P<0.01)。

波形蛋白(Vimentin蛋白)的Western blot 結(jié)果顯示如圖2及表1，與正常HepG2細胞相比，經(jīng)AngⅡ處理后，Vimentin蛋白表達水平顯著上升(P<0.01)；與陰性對照相比，HMGB1高表達HepG2細胞經(jīng)AngⅡ處理后，Vimentin蛋白表達水平顯著上升(P<0.001)；與陰性對照相比，HMGB1干擾的HepG2細胞經(jīng)AngⅡ處理后，Vimentin蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；經(jīng)AngⅡ處理的HMGB1高表達HepG2細胞與AngⅡ處理的正常HepG2細胞相比，Vimentin蛋白表達水平顯著上升(P<0.05)。

圖2 Western Blot驗證EMT相關(guān)標志蛋白在肝癌細胞中的變化

表1 肝癌細胞EMT相關(guān)標志蛋白表達

3 討論

肝癌作為一種常見的人類惡性腫瘤，近年來其在人群中的發(fā)病率躍居惡性腫瘤的前5位。全球流行病學統(tǒng)計結(jié)果顯示，每年約有78萬新增的肝癌患者，其中一半的患者在我國[2]。邵海妍等[3]通過對1991—2011年中國15～84歲居民的肝癌死亡趨勢分析發(fā)現(xiàn)，在這期間，我國居民肝癌病死率整體呈上升趨勢，城市、農(nóng)村人群肝癌病死率分別由1991年的19.63/10萬、22.25/10萬上升至2011年的23.61/10萬、27.12/10萬。目前，肝癌的病死率已經(jīng)超過胃癌、結(jié)直腸癌，在所有惡性腫瘤中僅次于肺癌，排第2位[4]。

目前，原發(fā)性肝細胞癌(HCC)發(fā)生轉(zhuǎn)移的機制尚不明確。HCC轉(zhuǎn)移的機制相當復雜，有基礎研究表明腫瘤的生物學特性在很大程度上影響著肝癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，與其有關(guān)的癌基因、抑癌基因、黏附分子、基質(zhì)蛋白酶、細胞因子以及相應的信號轉(zhuǎn)導機制[5-6]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，ETM是肝癌細胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[1]。闡明EMT在HCC中的發(fā)生和調(diào)控機制對研發(fā)新的HCC治療靶點具有重要的現(xiàn)實意義。

高遷移率族蛋白(high mobility group box,HMG)是一組參與復制、轉(zhuǎn)錄、重組和DNA修復，與DNA結(jié)合相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，主要包括HMGB1、HMGB2和HMGB3[7]。

HMGB1的相對分子量為30 kD，是一種基因序列高度保守的非組蛋白核蛋白，在進化中，哺乳動物的HMGB1相似程度高達99%，主要參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，DNA修復及各項細胞的生命功能[8]。HMGB1作為內(nèi)源性分子，BOX B是發(fā)揮促炎反應的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，通過損傷組織釋放到胞外，激活免疫系統(tǒng)，參與靜脈血栓、動脈粥樣硬化、類風濕關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生與發(fā)展[9-10]。HMGB1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)，在肺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、神經(jīng)源性腫瘤等多種實體腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)其表達水平高于正常組織，可能在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用[11-12]。

經(jīng)AngⅡ處理后，HepG2侵襲和遷移能力增強， E-cadherin表達下調(diào)，Vimentin表達上調(diào)；與陰性對照相比，HMGB1高表達的3種肝癌細胞經(jīng)AngⅡ處理后，侵襲和遷移能力增強，E-cadherin蛋白表達下調(diào)，Vimentin表達上調(diào)；與陰性對照相比，HMGB1干擾的3種肝癌細胞經(jīng)AngⅡ處理前后，侵襲和遷移能力無明顯差異，E-cadherin和Vimentin表達無明顯差異。

與我們研究結(jié)果相似，Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與正常肝癌細胞株Huh7和MHCC97H相比，HMGB1基因敲除后遷移和侵襲能力顯著降低，EMT相關(guān)蛋白表達降低；人膽管癌細胞經(jīng)HMGB1基因敲除后，E-Cadherin表達上調(diào)， N-Cadherin、Vimentin 和Snail基因表達下調(diào)，人膽管癌細胞EMT轉(zhuǎn)變受到抑制，進一步體外研究表明HMGB1可能通過促進VEGF-C表達調(diào)節(jié)淋巴結(jié)微血管的生長，促進腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移[14]；Wang等[15]亦發(fā)現(xiàn)，HMGB1在直腸癌中可能起癌基因的作用，抑制內(nèi)源性HMGB1的表達有助于激活caspase 3和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，顯著抑制大腸癌細胞SW620和Colo320細胞的增殖，促進腫瘤細胞凋亡。大多數(shù)研究表明HMGB1有促進肝癌細胞侵襲和遷移的能力，促進肝癌細胞發(fā)生EMT過程，在人肝癌細胞系的生物學行為中HMGB1可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

肝癌細胞和祖細胞均屬于上皮細胞，肝癌細胞部分或整體的EMT轉(zhuǎn)化使肝癌在細胞水平上表現(xiàn)出異質(zhì)性，上皮細胞的可塑性變化增加了細胞異質(zhì)性。在肝細胞肝癌發(fā)展過程中，腫瘤細胞為避免氧化損傷和原發(fā)性腫瘤部位過量活性氧，顯示出與慢性肝損傷“逃逸反應”中類似間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal to epithelial transition，MET)作用情況。因此，肝癌細胞或祖細胞的EMT轉(zhuǎn)化實質(zhì)上是使間充質(zhì)細胞具有抗凋亡和遷移的特性，抵抗細胞死亡刺激，并向細胞因子豐富的微環(huán)境轉(zhuǎn)移。在EMT作用下，肝癌細胞能夠轉(zhuǎn)化為上皮細胞、部分經(jīng)EMT誘導的間充質(zhì)細胞或完全經(jīng)EMT誘導的與纖維化組織中肝星狀細胞衍生的肌成纖維細胞類似的間充質(zhì)細胞，這些表型在腫瘤的任何階段均可以MET逆轉(zhuǎn)，恢復上皮性狀[16]。此外，EMT能夠通過促進促血管生成因子生成，促進肝癌腫瘤內(nèi)部血管生成，為腫瘤提供營養(yǎng)素和氧供支持，逃逸腫瘤細胞通過循環(huán)傳播，EMT對MET的可逆性被認為是遠端定植的又一標志。

本研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在肝癌組織中表達異常升高。進一步功能研究表明，在肝癌細胞中AngⅡ能通過誘導HMGB1表達增強肝癌細胞的侵襲和遷移能力，HMGB1能促進肝癌細胞發(fā)生EMT過程。