魏靜，李海霞，哈小琴

·綜述·

蛋白組學(xué)在糖尿病腎病診斷及預(yù)測價值中的應(yīng)用

魏靜，李海霞，哈小琴

730030 蘭州，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（魏靜、哈小琴）；730050 蘭州，中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院檢驗科（魏靜、李海霞）；730000 蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（李海霞）

據(jù)統(tǒng)計，有 30% ~ 40% 的 2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患者會發(fā)展成為腎?。╠iabetic nephropathy，DN），其中有一半 DN 患者會發(fā)展為終末期腎臟疾病，需要進(jìn)行透析或移植治療[1]。DN 分為三個階段：微量白蛋白尿、臨床糖尿病腎病和終末期腎損害。微量白蛋白尿可用于糖尿病腎臟損害的早期檢測，在初期腎病階段進(jìn)行干預(yù)可有效防止進(jìn)展為終末期腎損害。但是當(dāng)患者體內(nèi)出現(xiàn)微量白蛋白尿時，腎臟組織已經(jīng)發(fā)生了一些結(jié)構(gòu)破壞。此外，許多晚期腎臟組織病理學(xué)改變的患者顯示正常白蛋白尿[2]。蛋白組學(xué)是對特定組織、不同細(xì)胞或機(jī)體體液中表達(dá)的蛋白質(zhì)的整體研究。通過找到健康受試者與具特定病理改變患者之間的差異蛋白點，可用于識別疾病的特定診斷或預(yù)后生物標(biāo)志物[3]。本文就通過蛋白組學(xué)技術(shù)在 DN 中診斷、預(yù)測等方面的作用作一綜述。

1 蛋白組學(xué)

蛋白組學(xué)即對生物樣品中表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行總體分析，更深入地研究包括檢測蛋白質(zhì)的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等。質(zhì)譜法通常與前期色譜分離技術(shù)，如液相色譜（liquid chromatography，LC）和毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）相結(jié)合，是研究蛋白組學(xué)的主要工具[4]。蛋白組學(xué)技術(shù)包括雙向凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）、表面增強(qiáng)激光解吸/電離、液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜（capillary electrophoresis-mass spectrometry，CE-MS）等[5]。蛋白組學(xué)不僅被廣泛用于發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物，而且還可以更好地了解疾?。ɡ缣悄虿?、癌癥、阿爾茨海默病和腎臟疾病）的潛在機(jī)制，因為該技術(shù)能夠檢測識別細(xì)胞和生物樣品中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平[6]。由于生物樣本中蛋白質(zhì)之間的生化特性和穩(wěn)定性有所不同，蛋白組學(xué)的研究面臨著多重挑戰(zhàn)，例如蛋白質(zhì)的濃度范圍很寬，蛋白組學(xué)檢測技術(shù)取決于樣品的制備、蛋白質(zhì)的初始分離，難以量化低豐度的尿標(biāo)志物及個體之間尿蛋白排泄的巨大差異[7]。盡管蛋白組學(xué)的發(fā)展存在一定的挑戰(zhàn)，但其對于疾病的診斷、預(yù)后及治療靶點的研究仍然具有重要價值。

2 尿蛋白組學(xué)在糖尿病腎病中的應(yīng)用

尋找早期糖尿病腎病的標(biāo)記物成為目前的研究熱點。對于腎臟疾病的研究，尿蛋白組學(xué)已得到迅速發(fā)展并廣泛應(yīng)用于腎臟損害的早期診斷和鑒別，具有無創(chuàng)、簡便、可大量獲取的優(yōu)點[8]。與其他生物液體相比，尿液中包含從全身到局部組織的細(xì)胞外囊泡、蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)。然而，高豐度蛋白（如白蛋白，占總蛋白量的 25%）仍是尿蛋白組學(xué)研究的障礙，因為它可能掩蓋了低豐度的蛋白質(zhì)[9]。同時，尿液也是直接反映腎臟的非侵入性物質(zhì)。因此，尿蛋白組學(xué)的研究對于腎臟疾病具有重要的意義[10]。

等壓標(biāo)記進(jìn)行相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）不僅對鑒定蛋白的數(shù)量和種類有優(yōu)勢，而且組織、細(xì)胞、體液等均可作為檢測樣本，便于探索疾病發(fā)生機(jī)制和篩選標(biāo)志物。有研究通過使用 iTRAQ 及無標(biāo)記蛋白組學(xué)，以鑒定與腎病相關(guān)的潛在尿蛋白標(biāo)記物并通過酶聯(lián)免疫吸附測定進(jìn)行交叉驗證?？偣餐ㄟ^ iTRAQ 和無標(biāo)記蛋白組學(xué)分析分別鑒定出 341 和 396 種蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)觸珠蛋白（haptoglobin，HPT）可以作為腎病相關(guān)的候選生物標(biāo)志物，用于區(qū)分健康個體和腎病患者以及糖尿病患者的標(biāo)志物，具有最高的識別能力。因此，HPT 與肌酐之比（HPT-to-creatinine ratio，HCR）被評估為早期腎功能下降（early renal functional decline，ERFD）的獨立預(yù)測因子。這些數(shù)據(jù)表明，HCR 可能是比尿微量白蛋白更敏感的生物標(biāo)志物，可以用作腎功能下降的早期檢測指標(biāo)，同時也是臺灣糖尿病患者中與 ERFD 相關(guān)的標(biāo)志物[11]。

動力蛋白在 DN 的發(fā)生及發(fā)展過程中起到重要作用。它可通過促使線粒體的分裂、加劇氧化損傷和細(xì)胞凋亡，造成腎小管上皮細(xì)胞受損。另一方面，動力蛋白還可以引起足細(xì)胞的損傷。有研究發(fā)現(xiàn)采用蛋白組學(xué) 2-DE 和質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)動力蛋白在氣陰兩虛證中高表達(dá)、肝腎陰虛證中低表達(dá)、在脾腎陽虛證中不表達(dá)，表明氧化應(yīng)激損傷在氣陰兩虛證中較為明顯[12]。

Lindhardt 等[13]通過 CE-MS 在慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease，CKD）患者尿樣中發(fā)現(xiàn)了尿液生物標(biāo)記物，稱為 CKD273 分類器，并在幾個 CKD 隊列中得到驗證。Schanstra 等[14]對 T2DM 患者進(jìn)行隨訪，主要考察患者從正常蛋白尿到微量蛋白尿以及到大量蛋白尿的改變。研究發(fā)現(xiàn) CKD273 分類器對預(yù)測 DN 進(jìn)展比蛋白尿和 eGFR 的水平更具價值。

Betz 等[15]通過慢性高血糖和高血壓腎損害大鼠模型來模擬 DN，通過尿蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，DN 大鼠尿液中有 297 種多肽表達(dá)增加、15 個多肽表達(dá)減少。研究發(fā)現(xiàn)大鼠尿表皮生長因子（urinary epidermal growth factor，uEGF）表達(dá)較對照組少。同時，在腎功能正常的 T2DM 患者中研究發(fā)現(xiàn)，uEGF 與肌酐比值的降低和正常量蛋白尿 T2DM 患者腎功能的下降密切相關(guān)，提示 uEGF 與肌酐比值可能是預(yù)測 DN 發(fā)生的新型尿液標(biāo)志物。

3 血漿及血清蛋白組學(xué)在糖尿病腎病中的應(yīng)用

除了尿液外，血漿也被廣泛應(yīng)用于研究各種疾病的生物標(biāo)志物[16]。然而，血液中的蛋白組學(xué)由于采樣后的可變性而難以檢測，并且許多高豐度的蛋白質(zhì)，例如免疫球蛋白、白蛋白可以掩蓋低豐度的潛在生物標(biāo)記物。因此，早期的血漿蛋白組學(xué)研究并未顯示出探討生物標(biāo)志物的能力，因為循環(huán)肽可能反映的不僅僅局限于腎臟的一般病變過程。但是，蛋白組學(xué)的進(jìn)步正在推動這一領(lǐng)域的發(fā)展[17]。

有研究首次使用蛋白組學(xué) iTRAQ 技術(shù)通過 Q-Exactive質(zhì)譜儀鑒定早期糖尿病腎病中差異表達(dá)的血漿蛋白；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，實驗組共鑒定出 57 種蛋白質(zhì)，其中上調(diào) 32 種、下調(diào) 25 種。同時，通過 ROC 分析和蛋白印跡技術(shù)證實了明膠蛋白、膠凝素-11、PTPRJ 和 AKAP-7 蛋白是早期糖尿病腎病的候選生物標(biāo)志物[18]。

國內(nèi)學(xué)者通過應(yīng)用血清蛋白組學(xué)技術(shù)篩選 III ~ IV 期 DN 患者氣陰兩虛證的差異蛋白，研究發(fā)現(xiàn)所鑒定出的差異蛋白質(zhì)質(zhì)核比大多在 1000 ~ 20000 Da 的肽段內(nèi)，從而為臨床應(yīng)用 DN 氣陰兩虛證的研究提供客觀參考依據(jù)，從中醫(yī)的角度為 DN 的研究提供新的思路[19]。

4 組織蛋白組學(xué)

組織蛋白組學(xué)的研究對病理生理的研究具有重要意義。在臨床中腎活檢并不作為 DN 患者的常規(guī)檢查，而且經(jīng)活檢分離的腎小球數(shù)量少，因此腎組織蛋白組學(xué)研究少有報道。人體腎臟組織不容易獲得，目前組織蛋白組學(xué)的研究在動物模型中應(yīng)用較多。

衰老標(biāo)志物蛋白-30（senescence marker protein-30，SMP-30）是一種多功能蛋白，與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、抗壞血酸的生物合成和氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)有關(guān)，同時也與 β 細(xì)胞功能有關(guān)。此外，SMP-30 的缺乏會影響胰島素分泌[20]。有研究通過二維差異凝膠電泳（2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE）和質(zhì)譜對早期 DN 大鼠模型的腎組織蛋白組學(xué)進(jìn)行了差異分析，發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，DN 組 SMP-30 在腎組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，對照組和 DN 大鼠尿中分離的外泌體也有相同的趨勢，并在人體中得到驗證。表明 SMP-30 對于 DN 的診斷具有重要價值[21]。

5 腎小球蛋白組學(xué)

DN 由多種因素導(dǎo)致，包括葡萄糖代謝紊亂、氧化應(yīng)激、腎血液動力學(xué)的改變和遺傳傾向等。為了更全面地了解 DN 的發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)已將各種蛋白組學(xué)應(yīng)用于病理生理研究。通過使用 2D-DIGE 和基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間（MALDI-TOF）質(zhì)譜分析，觀察了早期 DN 腎小球蛋白的變化。研究發(fā)現(xiàn)在 KKAy 小鼠和 C57BL/6 小鼠之間獲得了 19 種差異表達(dá)的腎小球蛋白。KKAy 小鼠中有 17 種上調(diào)，有 2 種下調(diào)，其中包括抑制素和膜聯(lián)蛋白 A2 的上調(diào)。抑制素可能與膜聯(lián)蛋白 A2 相互作用并受 Ca2+依賴性方式的調(diào)節(jié)[22]。有研究認(rèn)為抑制素可能是治療與氧化應(yīng)激增加和線粒體功能障礙有關(guān)的疾病的潛在治療靶點，例如胰島素抵抗、T2DM、肥胖癥和癌癥等[23]。因此，對抑制素和膜聯(lián)蛋白 A2 的進(jìn)一步研究可能會為 DN 的發(fā)病機(jī)制提供新的見解。從長遠(yuǎn)來看，來自單個腎小球的綜合數(shù)據(jù)可以用來精確定位腎臟疾病動物模型或蛋白尿和腎小球疾病患者的新靶點。

有研究對有較長的糖尿病病史卻不出現(xiàn) DN 的患者和 DN 患者的腎小球進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有發(fā)展為 DN 患者腎小球中丙酮酸激酶 M2 的表達(dá)和活性上調(diào)。丙酮酸激酶 M2 激活可以通過增加葡萄糖代謝流出，抑制毒性葡萄糖代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生以及誘導(dǎo)線粒體生物合成以恢復(fù)線粒體功能從而保護(hù)腎臟[24]。

6 小結(jié)與展望

目前 DN 尿液蛋白組學(xué)研究已有所收獲，發(fā)現(xiàn)了一些對于 DN 鑒定具有潛在臨床診斷價值的標(biāo)志物，如觸珠蛋白、動力蛋白及 uEGF 等蛋白。蛋白組學(xué)研究仍然處于初級階段，雖然蛋白組學(xué)已經(jīng)在尋找早期 DN 標(biāo)志物方面取得一些成就，但幾乎所有研究結(jié)果均處于基礎(chǔ)研究階段，還沒有完全應(yīng)用到臨床，同時目前還沒有出現(xiàn)一個可以代替尿白蛋白排泄率的尿蛋白組學(xué)的生物標(biāo)志物。然而，隨著蛋白組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，未來我們很可能通過分析尿液、血清、腎組織的蛋白組學(xué)變化獲得足夠的生物信息，通過生物信息學(xué)技術(shù)建立 DN 蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，從而進(jìn)一步探討 DM 患者發(fā)生腎損害的機(jī)制、篩選特異的診斷標(biāo)志物等，給出針對性的預(yù)防和治療方案。同時未來的研究應(yīng)側(cè)重于結(jié)合基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀遺傳學(xué)組和代謝組學(xué)的系統(tǒng)生物學(xué)研究，有望為 DN 患者的早期診斷、早期干預(yù)和精準(zhǔn)治療帶來新依據(jù)和新策略。

[1] Pei F, Li BY, Zhang Z, et al. Beneficial effects of phlorizin on diabetic nephropathy in diabetic db/db mice. J Diabetes Complications, 2014, 28(5):596-603.

[2] Guo Z, Liu X, Li M, et al. Differential urinary glycoproteome analysis of type 2 diabetic nephropathy using 2D-LC-MS/MS and iTRAQ quantification. J Transl Med, 2015, 13:371.

[3]Pejcic M, Stojnev S, Stefanovic V. Urinary proteomics-a tool for biomarker discovery. Ren Fail, 2010, 32(2):259-268.

[4] Lindsey ML, Mayr M, Gomes A, et al. Transformative impact of proteomics on cardiovascular health and disease: a scientific statement from the american heart association. Circulation, 2015, 132(9):852- 872.

[5] Van JA, Scholey JW, Konvalinka A. Insights into diabetic kidney disease using urinary proteomics and bioinformatics. J Am Soc Nephrol, 2017, 28(4):1050-1061.

[6] Mahfouz MH, Assiri AM, Mukhtar MH. Assessment of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) and retinol-binding protein 4 (RBP4) in type 2 diabetic patients with nephropathy. Biomarker Insights, 2016, 11:31-40.

[7] Klein JB. Applying proteomics to detect early signs of chronic kidney disease: where has the magic gone? Expert Rev Proteomics, 2017, 14(5):387-390.

[8] Thomas S, Hao L, Ricke WA, et al. Biomarker discovery in mass spectrometry-based urinary proteomics. Proteomics Clin Appl, 2016, 10(4):358-370.

[9] Nagaraj N, Mann M. Quantitative analysis of the intra- and inter- individual variability of the normal urinary proteome. J Proteome Res, 2011, 10(2):637-645.

[10] Chen H, Lin H, Xu M, et al. Quantitative urinary proteome reveals potential biomarkers for ureteropelvic junction obstruction. Proteomics Clin Appl, 2018, 13(4):e1800101.

[11] Currie G, Delles C. Urinary proteomics for diagnosis and monitoring of diabetic nephropathy. Curr Diab Rep, 2016, 16(11):104.

[12] Chai KF, Ma C, Wang HX. Urinary proteomics research on different syndromes of diabetic nephropathy in early stage. Chin J Traditional Chin Med, 2015, 33(10):2311-2314. (in Chinese)

柴可夫, 馬超, 王宏獻(xiàn). 早期糖尿病腎病不同證候的尿蛋白組學(xué)研究.中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2015, 33(10):2311-2314.

[13] Lindhardt M, Persson F, Zurbig P, et al. Urinary proteomics predict onset of microalbuminuria in normoalbuminuric type 2 diabetic patients, a sub-study of the DIRECT-Protect 2 study. Nephrol Dial Transplant, 2017, 32(11):1866-1873.

[14] Schanstra JP, Zürbig P, Alkhalaf A, et al. Diagnosis and prediction of CKD progression by assessment of urinary peptides. J Am Soc Nephrol, 2015, 26(8):1999-2010.

[15] Betz BB, Jenks SJ, Cronshaw AD, et al. Urinary peptidomics in a rodent model of diabetic nephropathy highlights epidermal growth factor as a biomarker for renal deterioration in patients with type 2 diabetes. Kidney Int, 2016, 89(5):1125-1135.

[16] Greco V, Piras C, Pieroni L, et al. Direct assessment of plasma/serum sample quality for proteomics biomarker investigation. Methods Mol Biol, 2017, 1619:3-21.

[17] Pena MJ, Mischak H, Heerspink HJL. Proteomics for prediction of disease progression and response to therapy in diabetic kidney disease. Diabetologia, 2016, 59(9):1819-1831.

[18] Lu H, Deng S, Zheng M, et al. iTRAQ plasma proteomics analysis for candidate biomarkers of type 2 incipient diabetic nephropathy. Clin Proteomics, 2019, 16:33.

[19] Liu YH, Chen LZ, Su XH, et al. Serum proteomics study on III-IV stage of diabetic nephropathy with Qi-Yin deficiency syndrome. Mod J Integr Traditional Chin West Med, 2019, 28(7):701-704, 735. (in Chinese)

劉垠浩, 陳麗貞, 蘇小惠, 等. III~IV期糖尿病腎病氣陰兩虛證患者的血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2019, 28(7):701- 704, 735.

[20] Senmaru T, Yamazaki M, Okada H, et al. Pancreatic insulin releaseinvitamin C-deficient senescence marker protein-30/ gluconolactonase knockout mice. J Clin Biochem Nutr, 2012, 50(2): 114-118.

[21] Zubiri I, Posada-Ayala M, Benito-Martin A, et al. Kidney tissue proteomics reveals regucalcin downregulation in response to diabetic nephropathy with reflection in urinary exosomes. Transl Res, 2015, 166(5):474-484, e4.

[22] Liu X, Yang G, Fan Q, et al. Proteomic profile in glomeruli of type-2 diabetic KKAy mice using 2-dimensional differential gel electrophoresis. Med Sci Monit, 2014, 20:2705-2713.

[23] Theiss AL, Sitaraman SV. The role and therapeutic potential of prohibitin in disease. Biochim Biophys Acta, 2011, 1813(6):1137- 1143.

[24] Qi W, Keenan HA, Li Q, et al. Pyruvate kinase M2 activation may protect against the progression of diabetic glomerular pathology and mitochondrial dysfunction. Nat Med, 2017, 23(6):753-762.

國家自然基金（81273568）

哈小琴，Email：haxiaoqin2013@163.com

2020-02-06

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.04.017