周 琳，董發(fā)勤，張 偉，唐子涵，熊 鑫，周 磊，李冬坤，霍婷婷，陳曉明，劉金鳳1, ，馮晨旭，李若飛

1. 西南科技大學材料科學與工程學院，四川 綿陽 621010 2. 西南科技大學固體廢物處理與資源化教育部重點實驗室，四川 綿陽 621010 3. 西南科技大學分析測試中心，四川 綿陽 621010 4. 中國工程物理研究院激光聚變研究中心，四川 綿陽 621900 5. 西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010

引 言

從20世紀40年代開始，世界各國就開始著力于核武器和核能發(fā)電的研究與開發(fā)。隨之而來的是大量核廢料的產(chǎn)生，對環(huán)境造成了不可估量的損害，其化學毒性和放射性嚴重危害到了人體健康。鈾作為典型的放射性元素和重要的核燃料，在各種放射性廢物中大量存在，因此，對它的治理研究具有重要意義。

鈾在自然界中主要有四價和六價兩種價態(tài)。四價鈾一般以礦物的形式在自然界中穩(wěn)定存在，六價鈾則一般以具有水溶性的鈾酰離子形式存在，具有易遷移性[1]。因此，鈾對環(huán)境的污染主要表現(xiàn)在鈾污染水體上。對含鈾廢水的傳統(tǒng)處理方法有化學沉淀法、離子交換法、蒸發(fā)濃縮法、膜分離法和電化學方法等[2-3]，但這些方法存在成本高、工藝復雜、去除效率低和易造成二次污染等問題。因此，研究者們將目光投向耗能少且高效的微生物處理方法[4-8]。

作為自然條件下普遍存在的成分，高表面積/體積比的微生物可以直接將鈾固定在細胞內(nèi)外，或者通過改變其周圍的微環(huán)境如釋放磷酸鹽物質(zhì)來間接影響鈾的化學行為[9]。暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)為芽孢桿菌屬，是革蘭氏陽性菌，兼性厭氧，呈棒狀； 最適生長溫度為37 ℃，最適pH為6～7[10]。該菌寬為0.3～0.6 μm，長為1.5～3.5 μm，有較高的表面積/體積比，說明其吸附性能良好。前人對暹羅芽孢桿菌的研究多集中在其降解纖維素淀粉或抗菌方面，關(guān)于暹羅芽孢桿菌與重金屬和放射性核素的作用及機制研究基本未涉及。

因此，選取暹羅芽孢桿菌作為研究對象，利用ICP-OES和ICP-MS檢測分析不同環(huán)境條件(初始pH值、鈾初始濃度、菌體用量)對暹羅芽孢桿菌去除鈾的影響及作用過程中菌體釋放的生物磷與鈾去除的關(guān)系； 結(jié)合FT-IR，SEM-EDS和XPS技術(shù)，探討生物磷參與的暹羅芽孢桿菌對鈾的去除機制。本研究將有助于深入理解微生物與鈾的相互作用過程及其去除機制，以期為微生物原位修復鈾污染水體的應用提供基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

傅里葉變換紅外光譜儀(Spectrum One，美國PE儀器公司)、電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(iCAP6500，美國Thermo Fisher公司)、電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀-質(zhì)譜儀(Agilent7700x，美國安捷倫公司)、X-射線光電子能譜儀(K-ALPHA+，美國Thermo Fisher公司)、場發(fā)射掃描電子顯微鏡(Ultra55，德國蔡司儀器公司)、振蕩培養(yǎng)箱(DQHZ-2001B，太倉市華美生化儀器廠)、真空冷凍干燥機器(FreeZone?，美國Labonco公司)、精密pH計(PHS-3C，上海精密科學儀器有限公司)、電子天平(TP-114，北京丹佛儀器有限公司)。

暹羅芽孢桿菌，由西南科技大學生命科學與工程學院陳曉明課題組提供，硝酸鈾酰為分析純。

1.2 方法

稱取1.655 5 g的硝酸鈾酰加入少量超純水溶解后，加入10 mL濃HNO3，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度線定容即得1 000 mg·L-1的鈾儲備液，根據(jù)實驗需要的濃度進行稀釋。將培養(yǎng)了7 h后一定量的活體暹羅芽孢桿菌加入到裝有40 mL鈾溶液濃度為c0的錐形瓶中，放置在恒溫振蕩培養(yǎng)箱(30 ℃，150 r·min-1)中反應一定時間后，離心(8 000 r·min-1，15 ℃)10 min，取上清液用ICP-MS測試溶液中的剩余鈾濃度； 離心得到的菌體沉淀在-47 ℃下冷凍干燥至恒重，分別進行FTIR，XPS和XRD測試； 吸取反應前后不同時間段的菌懸液滴于蓋玻片上，自然風干后，用2.5%的戊二醛固定12 h，再用乙醇梯度(30%，50%，70%，90%和100%)脫水，自然晾干后作為SEM試樣。

1.3 分析方法

暹羅芽孢桿菌對鈾的去除率R(%)和吸附量Q(mg·g-1)可采用式(1)、式(2)計算，即

(1)

(2)

式中，c0為溶液中鈾初始濃度(mg·L-1)；ct為反應t時刻溶液中鈾濃度(mg·L-1)；M為暹羅芽孢桿菌用量(g·L-1)。

2 結(jié)果與討論

2.1 去除實驗結(jié)果分析

2.1.1 pH值對暹羅芽孢桿菌去除鈾的影響

圖1(a)給出了不同pH條件下暹羅芽孢桿菌對鈾的去除情況?？梢钥闯?，在pH 3.0～5.0時，暹羅芽孢桿菌對鈾的去除率和吸附量逐漸升高； pH>5.0后，去除率和吸附量呈現(xiàn)下降趨勢。在pH 5.0時，去除率和吸附量均達到最大值，分別為77.9%和368.2 mg·L-1。

?鄭板橋:《板橋題畫》，載黃賓虹、鄧實編《中華美術(shù)叢書》(十六卷)，北京古籍出版社1998年版，第125頁。

暹羅芽孢桿菌與鈾作用結(jié)束后，離心取上清液，用ICP-OES測試溶液中磷的含量，以暹羅芽孢桿菌與超純水作用作為空白對照。反應后溶液中磷含量的變化如圖1(c)所示。從圖中可以看出，與對照組相比，與鈾作用后溶液中的磷含量均顯著下降，這可能是由于磷參與了暹羅芽孢桿菌對鈾的去除被消耗造成的。對比作用前后各組磷含量的差值發(fā)現(xiàn)，在pH 5.0時，磷的消耗量最大； 隨著pH值的升高，磷的消耗量呈現(xiàn)減弱的趨勢。這與前面研究得到的pH 5.0時鈾的去除率最大、pH>5.0時鈾的去除率逐步降低的趨勢相匹配。推測生物體釋放的磷參與了鈾的去除過程，這一研究結(jié)果與文獻報道的鈾酰離子能與磷酸鹽結(jié)合形成沉淀的結(jié)論[12-13]相吻合。

圖1 不同pH條件下(a)暹羅芽孢桿菌對鈾的去除率和吸附量，(b)鈾的存在形態(tài)和(c)溶液中磷含量的變化

Fig.1(a)TheremovalefficiencyandtheadsorptioncapacityofU(VI)byB.siamensis, (b)therelativespeciesdistributionofU(VI)species(cNa2CO3=13.96mmol·L-1,cU(VI)=50mg·L-1)and(c)changesofphosphoruscontentunderdifferentpH

2.1.2 菌體用量對暹羅芽孢桿菌去除鈾的影響

圖2(a)給出了菌體用量對暹羅芽孢桿菌去除鈾的情況。從圖中可以看出，隨著菌體用量從0.03 g·L-1增大到0.67 g·L-1，暹羅芽孢桿菌對鈾的去除率逐漸升高(從33.8%升高至96.5%)，吸附量則逐漸降低(從450.3 mg·g-1降低至64.2mg·g-1)。這是因為隨著菌體用量增加，菌體所提供的活性位點數(shù)目亦隨之增加，去除率隨之增大。但由于溶液中鈾總量恒定，單位質(zhì)量的菌體能夠結(jié)合到的鈾離子數(shù)目減少，從而導致吸附量下降。在菌體用量為0.03 g·L-1時，暹羅芽孢桿菌對鈾的吸附量高達450.3 mg·g-1，為本實驗獲得的最大吸附量。前人研究報道了一些常用于鈾處理的芽孢桿菌屬細菌，如膠質(zhì)芽孢桿菌，其對鈾的吸附量為180.0 mg·g-1[12]； 枯草芽孢桿菌為308.3 mg·g-1[14]； 地衣芽孢桿菌約為140.1 mg·g-1； 蠟樣芽孢桿菌448.7 mg·g-1[15]，均低于本文中暹羅芽孢桿菌對鈾的附量，說明該菌對鈾的吸附能力較為突出。

觀察作用后溶液中磷濃度的變化[圖2(b)]發(fā)現(xiàn)，隨著菌體用量的增高，生物磷的消耗量也隨之增加。這與菌體對鈾的去除率變化趨勢相符合，說明隨著生物量的增加，菌體釋放的含磷物質(zhì)增多，生物磷與鈾的作用增強，使得鈾的去除率升高。

圖2 菌體用量對(a)暹羅芽孢桿菌對鈾的去除率和吸附量的影響； (b)磷含量的影響

Fig.2Effectsofbiomassvaluesonresults: (a)TheeffectofbiomassonremovalefficiencyandtheadsorptioncapacityofU(VI)byB.siamensis; (b)Changesofphosphoruscontentunderdifferentbiomassconditions

2.1.3 等溫吸附分析

對不同鈾初始濃度條件下暹羅芽孢桿菌對鈾的去除進行研究[圖3(a)]，結(jié)果表明： 隨著鈾初始濃度的增加，暹羅芽孢桿菌對鈾的去除率先小幅上升后下降，吸附量則先增高而后出現(xiàn)輕微下降。由于在低濃度鈾環(huán)境中，菌體對鈾具有抗吸附能力，因此在鈾初始濃度8.1 mg·L-1時，暹羅芽孢桿菌對鈾的去除率和吸附量均較低。隨著鈾濃度從8.1 mg·L-1升高至44.5 mg·L-1，吸附抗性逐漸被打破，去除率和吸附量菌升高。之后隨著鈾濃度的增加，吸附量隨之增大，當鈾濃度達到179.8 mg·L-1時，吸附容量達到最大值(429.1 mg·g-1)。但由于溶液中菌體總量一定，所提供的活性位點數(shù)目保持不變，隨著鈾濃度的增大，單位體積內(nèi)未被結(jié)合的鈾大幅度增加，導致去除率顯著下降。

采用Langmuir和Freundlich吸附等溫模型對實驗數(shù)據(jù)進行擬合[圖3(b)]，探究暹羅芽孢桿菌對鈾的等溫吸附過程。由圖可看出，單分子層吸附模型Langmuir方程的擬合程度(R2=0.980 36)高于Freundlich方程的擬合系數(shù)(R2=0.707 71)，說明暹羅芽孢桿菌對鈾的吸附在鈾濃度為8.1～448.0 mg·L-1范圍內(nèi)主要以單分子層吸附為主。Langmuir方程擬合得出的qmax=383.1 mg·g-1，低于實驗中最大吸附量qe，c0=179.8 mg·L-1=429.1 mg·g-1，說明暹羅芽孢桿菌吸附鈾的機制可能還包含化學吸附。

圖3 (a)不同鈾初始濃度條件下暹羅芽孢桿菌對鈾的去除率和吸附量； (b) Langmuir吸附等溫式(外)和Freundlich吸附等溫式(內(nèi))擬合曲線

Fig.3(a)TheeffectofU(VI)concentrationonremovalefficiencyandtheadsorptioncapacityofU(VI)byB.siamensisand(b)Langmuirisothermallineofadsorption(external)andFreundlichisothermallineofadsorption(internal)

2.2 與鈾作用前后菌體沉淀FTIR分析

暹羅芽孢桿菌與不同濃度鈾溶液作用前后的紅外光譜如圖4所示，由圖可看出，與鈾作用前后，暹羅芽孢桿菌紅外光譜特征峰發(fā)生了不同程度的變化。

圖4 反應前后暹羅芽孢桿菌紅外光譜圖

綜上所述推斷，蛋白質(zhì)和脂類的特征吸收峰存在，說明與鈾作用后暹羅芽孢桿菌細胞壁的主要成分和結(jié)構(gòu)仍保持完整。磷酸基團和氨基、羥基、羧基活性基團是暹羅芽孢桿菌與鈾作用的主要基團，這些活性基團以配位的方式結(jié)合鈾。

2.3 與鈾作用前后菌體SEM-EDS分析

暹羅芽孢桿菌與鈾作用前后的掃描電鏡圖如圖5所示。對照組中暹羅芽孢桿菌呈長桿狀，菌體表面光滑無雜質(zhì)。與鈾作用后，暹羅芽孢桿菌菌體表面失去原有光滑度，菌體表面附著有鱗片狀沉淀，且附著的片狀沉淀與反應的溶液初始pH密切相關(guān)。在pH 5.0時，菌體表面的鱗片狀沉淀較pH 3.0和7.0明顯增多，這一結(jié)果和前述溶液初始pH對暹羅芽孢桿菌去除鈾的影響結(jié)果吻合。結(jié)合前面的紅外分析，推測鱗片狀沉淀可能是鈾與菌體表面活性基團相互作用后聚集堆積，或部分細胞破損后外泄的胞內(nèi)物質(zhì)與鈾結(jié)合形成。

圖5 與鈾作用前后暹羅芽孢桿菌的SEM圖

EDS能譜[圖6(a和b)]分析顯示，暹羅芽孢桿菌與鈾作用后，在結(jié)合能3.0～3.5 keV附近出現(xiàn)明顯鈾的特征峰，其含量占質(zhì)量分數(shù)的19.71%，摩爾比的1.78%，說明細胞表面的鱗片狀物質(zhì)為含鈾的沉淀。同時發(fā)現(xiàn)，作用后磷的峰強明顯增加，推測有較多的含磷物質(zhì)與鈾作用后被固定至菌體表面。這些磷可能是微生物通過ATP水解、多聚磷酸、有機磷酸鹽釋放的結(jié)果。綜合上述的分析，推測暹羅芽孢桿菌表面的鱗片狀沉淀可能為含磷鈾的物質(zhì)。

2.4 與鈾作用前后菌體XPS分析

為了進一步探索暹羅芽孢桿菌與鈾的相互作用機制，利用XPS對作用前后的菌體進行分析。圖7(a)是對照組和在pH 5.0條件下鈾作用樣品的XPS掃描全譜。從圖7(a)中可看出反應后出現(xiàn)明顯的U4f特征峰，說明暹羅芽孢桿菌在與鈾的作用過程中可將鈾固定至菌體表面。在XPS Peak中對P2p峰和U4f峰進行擬合，擬合參數(shù)見表1。在暹羅芽孢桿菌與鈾作用后，磷的結(jié)合能從133.8 eV位移至133.2 eV，這可能是含磷化合物與鈾相互作用的結(jié)果[15]。同時磷的峰面積增大，說明與鈾作用后樣品中磷含量增加。對U4f峰進行擬合，結(jié)果如圖7(b)所示，380.0和391.0 eV處為四價鈾的特征峰，381.9和392.6 eV為六價鈾的特征峰，說明暹羅芽孢桿菌能將六價鈾還原為四價鈾，推測可能是暹羅芽孢桿菌自身新陳代謝釋放的物質(zhì)將部分六價鈾還原為四價鈾。對比六價鈾與四價鈾峰面積可知，六價鈾的含量更高，說明被固定在暹羅芽孢桿菌表面的鈾主要為六價鈾，推測暹羅芽孢桿菌表面的含磷鈾沉淀可能以鈾的磷酸鹽形式存在。

圖6 暹羅芽孢桿菌(a)對照和(b) pH 5條件下負載鈾的EDS分析

圖7 暹羅芽孢桿菌與鈾作用前后的(a)XPS掃描全譜和(b)P2p光譜及負載鈾后的U4f光譜

Fig.7(a)FullscanofB.siamensisand(b)P2pspectrabeforeandaftertreatmentatpH5.0and(c)U4fspectraofU(VI)-loadB.siamensis

表1 暹羅芽孢桿菌與鈾作用前后的XPS光譜參數(shù)

對反應前后菌體沉淀進行XRD測試分析后，發(fā)現(xiàn)XRD譜圖并無明顯的晶體特征峰出現(xiàn)(并未將XRD圖片放入本文)，推測鈾可能以無定形形態(tài)賦存在菌體表面，或沉淀中形成磷鈾礦晶體的含量太少，XRD分析難以檢出。

3 結(jié) 論

(1)通過ICP-OES，ICP-MS，F(xiàn)TIR，SEM-EDS和XPS等光譜學分析發(fā)現(xiàn)，暹羅芽孢桿菌能夠有效去除水體中的鈾，菌體通過ATP水解、多聚磷酸、有機磷酸鹽釋放的生物磷參與了其對鈾的去除。

(2)暹羅芽孢桿菌對鈾的去除在溶液初始pH 5.0 時去除效果最好。菌體用量增加有利于暹羅芽孢桿菌對鈾的去除。暹羅芽孢桿菌對鈾的去除行為符合Langmuir等溫吸附模型，等溫吸附實驗獲得的最大吸附量(429.1 mg·g-1)高于理論計算的最大吸附量(383.1 mg·g-1)，說明暹羅芽孢桿菌對鈾的去除可能是物理和化學行為的共同作用。本實驗中暹羅芽孢桿菌對鈾的最大去除率為96.5%，最高吸附量為450.3 mg·g-1，高于大部分已報道的用于吸附鈾的芽孢桿菌。

(3)結(jié)合FTIR，SEM，EDS和XPS等光譜學測試表征結(jié)果，推測暹羅芽孢桿菌對鈾的去除機制為： 首先，通過靜電作用鈾被快速吸引到暹羅芽孢桿菌表面，隨后以配位的形式被菌體上的磷酸基團、氨基、羥基、羧基等活性基團吸附，同時與菌體釋放的含磷酸鹽類物質(zhì)相互作用，形成含磷鈾沉淀而被固定至細菌表面。在此過程中，少部分六價鈾被菌體釋放的胞內(nèi)物質(zhì)還原成四價鈾而發(fā)生沉降。推測菌體表面沉淀可能為鈾的磷酸鹽沉淀和含磷化合物與鈾的絡合物形成的混合物。本研究對利用微生物的生物礦化作用處理鈾廢水有所啟示，有助于開發(fā)微生物原位修復技術(shù)。