盛振扉，張春光*，邱澤龍，王 號, 2*，張小發(fā)，黃 晞，談志偉，邱偉杰，王鵬沖, 2*，劉文耀，段茂強(qiáng), 4，黃曉莉, 5，黃祖芳，劉憶平，邢鈺煒，林彬彬

1. 福建師范大學(xué)光電與信息工程學(xué)院，醫(yī)學(xué)光電科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省光電傳感應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，福建省光子技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350007 2. 中國科學(xué)院光譜成像技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710119 3. 福建師范大學(xué)醫(yī)院，福建 福州 350007 4. 中國科學(xué)院沈陽自動化研究所, 遼寧 沈陽 110016 5. 遼寧省科學(xué)技術(shù)情報研究所, 遼寧 沈陽 110168

引 言

聲光可調(diào)諧濾波器(AOTF)作為一種新型的分光器件，相較傳統(tǒng)的分光器件具有體積小、全固態(tài)構(gòu)造、穩(wěn)定性高、調(diào)諧范圍寬、調(diào)諧速度快、再現(xiàn)性好、光譜分辨率高等一系列優(yōu)點(diǎn)。AOTF的工作原理主要是基于各向異性雙折射晶體的反常Bragg衍射效應(yīng)[1]； AOTF主要由聲光晶體及鍵合在其上的壓電換能器構(gòu)成，加載到壓電換能器上的電信號被轉(zhuǎn)換成相同頻率的超聲波，并在晶體中與入射光產(chǎn)生非線性效應(yīng)； 在滿足Bragg衍射條件時，入射光發(fā)生Bragg衍射，衍射光中心波長與驅(qū)動電信號頻率為一一對應(yīng)關(guān)系，故通過改變驅(qū)動電信號頻率即可實(shí)現(xiàn)衍射光中心波長的改變，達(dá)到可調(diào)諧濾波的目的。

光譜成像是一種同時具備光譜分辨和空間分辨能力的圖像采集與分析技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)在不同領(lǐng)域?qū)Σ煌瑢ο筮M(jìn)行全面且細(xì)致的研究。生物醫(yī)學(xué)作為光譜成像技術(shù)的重要應(yīng)用領(lǐng)域之一，依托于AOTF較高的光譜分辨率，可實(shí)現(xiàn)對生物組織的聲光濾波超光譜顯微成像，快速、無損地進(jìn)行基于組織內(nèi)部成分的光譜分析與圖像分析，對于輔助檢測生物組織的生理、病理狀態(tài)具有重要科學(xué)意義[1-5]。

皮膚鱗狀細(xì)胞癌是一種常見的非黑色素瘤皮膚癌，其發(fā)病率日益升高, 逐漸引起醫(yī)學(xué)家及學(xué)者們的關(guān)注； 隨著環(huán)境惡化導(dǎo)致的地表紫外線輻射量升高，使得皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率陡然增長，故進(jìn)一步研究該疾病的快速無損檢測及分析等技術(shù)顯得尤為關(guān)鍵。

本研究利用非共線AOTF與光學(xué)倒置顯微鏡搭建超光譜顯微成像系統(tǒng)，在可見光波段內(nèi)大量采集了對非染色皮膚鱗狀細(xì)胞癌切片進(jìn)行聲光濾波后的準(zhǔn)單色光譜及對應(yīng)顯微成像信息，本研究旨在為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的快速光學(xué)檢測與診斷提供一種有力的技術(shù)手段。

1 基本原理

TeO2是一種典型的反常聲光器件所使用的聲光晶體，在其內(nèi)部，沿[110]方向傳播的超聲波是純切變波，聲速非常慢，僅為0.613×103m·s-1； 評價聲光相互作用工作模式優(yōu)良與否的聲光優(yōu)值與聲速的三次方成反比，故TeO2聲光優(yōu)值相當(dāng)大，衍射效率也較高[3]。

圖1 非共線聲光相互作用矢量布局圖

(1)

在式(1)中，超聲波波速為Va，ni-nd是由聲光晶體雙折射特性引起的折射率差(ni和nd分別為材料對應(yīng)入射和衍射光波的折射率)，θi為入射光極角。從式(1)不難看出，通過改變超聲波頻率可以實(shí)現(xiàn)對調(diào)諧衍射光波長的目的[4, 7]。

2 結(jié)果與討論

將非共線AOTF與光學(xué)倒置顯微鏡相結(jié)合，建立了一套超光譜顯微成像系統(tǒng)。系統(tǒng)的主要器件及光路如圖2所示。

圖2 基于AOTF的超光譜顯微成像系統(tǒng)

尼康光學(xué)倒置顯微鏡(TE2000-U)頂部的鹵素?zé)糇鳛閷拵О坠夤庠?，光線經(jīng)由載有實(shí)驗(yàn)組織切片的載物臺，通過其下方的顯微物鏡繼續(xù)向下傳播，而后由底部的反射鏡將光線從倒置顯微鏡中輸出； 此時，通過連續(xù)多倍可變透鏡將光線進(jìn)行縮束，使其通過并由透鏡雙膠合透鏡L1會聚，后方的偏振片P1其偏振方向與主平面平行，使得線偏振方向與主平面平行的部分光線得以通過； 光線入射到AOTF并在其中發(fā)生反常Bragg衍射，出射的兩條光線中一條為衍射光，另一條為零級光； 位于AOTF后方的偏振片P2其偏振方向與主平面垂直，故線偏振方向與主平面平行的零級光被阻擋，而線偏振方向與主平面垂直的衍射光繼續(xù)向后傳播，由雙膠合透鏡L2會聚后，分束鏡BS將其分成兩部分，一部分由Nikon CCD承接進(jìn)行圖像采集，另一部分則由Avaspec-Mini-VIS光譜儀接收，以采集實(shí)驗(yàn)對象的光譜信息[8-9]。

為了測試所搭建的超光譜顯微成像系統(tǒng)的性能，在110～180 MHz的超聲頻率區(qū)間內(nèi)以一定頻率間隔對衍射光譜信息進(jìn)行采集。當(dāng)超聲頻率為120，130，140，150，160和170 MHz時，其對應(yīng)的衍射光光譜如圖3所示?？梢钥吹剑苌涔夤庾V帶寬很窄，達(dá)到了nm級別； 超聲頻率為170 MHz時，對應(yīng)衍射光中心波長為467.11 nm，其光譜帶寬僅為1.48 nm，這體現(xiàn)出AOTF具有很高的光譜分辨率。同時，本系統(tǒng)采用更高質(zhì)量的TeO2晶體、高質(zhì)量的雙膠合透鏡、以及優(yōu)化的射頻驅(qū)動源，有效地抑制了衍射光光譜的旁瓣，進(jìn)而大幅度減小旁瓣對光譜成像所造成的不利影響，為實(shí)現(xiàn)生物組織結(jié)構(gòu)超光譜顯微成像提供有利條件。

圖3 不同超聲頻率下測得的衍射光光譜信息圖

圖4 AOTF超光譜顯微成像系統(tǒng)性能曲線

圖4給出了在超聲頻率110～180 MHz區(qū)間內(nèi)的聲光濾波超光譜顯微成像系統(tǒng)性能曲線。圖4中，黑色圓點(diǎn)為采集點(diǎn)處的實(shí)測數(shù)據(jù)，彩色曲線為理論數(shù)據(jù)生成的調(diào)諧關(guān)系曲線。圖4(a)為超聲頻率調(diào)諧關(guān)系，實(shí)測的超聲頻率及其對應(yīng)的衍射光中心波長能夠很好地與理論調(diào)諧曲線契合。圖4(b)給出了不同超聲頻率下測得的衍射光譜帶寬，實(shí)測數(shù)據(jù)仍能夠較好地符合理論預(yù)期； 在110～180 MHz內(nèi)，測得的光譜帶寬范圍為1.28～2.84 nm，充分反映了該超光譜成像系統(tǒng)良好的光譜分辨性能。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在可見光范圍內(nèi)，系統(tǒng)可達(dá)到102個光譜通道量級，能夠滿足對生物組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確的識別與成像的需要。

圖5 不同衍射光中心波長下皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織的超光譜顯微圖像

(a)： 未濾波圖像； (b)：fa=115 MHz，λ0=626.08 nm； (c)：fa=125 MHz，λ0=586.25 nm； (d)：fa=135 MHz，λ0=551.29 nm； (e)：fa=145 MHz，λ0=522.52 nm； (f)：fa=155 MHz，λ0=497.87 nm； (g)：fa=165 MHz，λ0=476.62 nm； (h)：fa=175 MHz，λ0=458.26 nm

Fig.5Thehyperspectralimagesofcutaneoussquamouscellcarcinomatissuewithdifferentcenterwavelength

(a)： Unfiltered image； (b)：fa=115 MHz，λ0=626.08 nm； (c)：fa=125 MHz，λ0=586.25 nm； (d)：fa=135 MHz，λ0=551.29 nm； (e)：fa=145 MHz，λ0=522.52 nm； (f)：fa=155 MHz，λ0=497.87 nm； (g)：fa=165 MHz，λ0=476.62 nm； (h)：fa=175 MHz，λ0=458.26 nm

圖5(a)—(h)分別給出了非染色皮膚鱗狀細(xì)胞癌切片的未濾波顯微圖像以及中心光波長為626.08，586.25，551.29，522.52，497.87，476.62和458.26 nm超光譜顯微圖像(對應(yīng)的超聲頻率為115，125，135，145，155，165和175 MHz)。從圖5中可以看出，在不同中心光波長下，病變部位內(nèi)部的組織結(jié)構(gòu)清晰可辨，表明該系統(tǒng)可用于皮膚鱗狀細(xì)胞癌病變部位結(jié)構(gòu)的細(xì)致研究。此外，在實(shí)驗(yàn)中所采集的超光譜顯微圖像幾乎沒有明顯的漂移現(xiàn)象，這表明建立的超光譜顯微成像系統(tǒng)具有優(yōu)異的圖像穩(wěn)定性。

在圖5(a)未經(jīng)過濾波的圖像中，圈定了A作為觀察標(biāo)記區(qū)域，B，C，D，E為四個參考區(qū)域； 其中，A區(qū)域?yàn)槠つw鱗狀細(xì)胞癌已成型合胞體樣中的一部分，B區(qū)域與E區(qū)域均為與A區(qū)域毗鄰的皮膚鱗狀細(xì)胞癌已成型癌變胞團(tuán)，C區(qū)域與D區(qū)域均為與A區(qū)域毗鄰的非癌變胞團(tuán)組織區(qū)域。在圖5(b)中，超聲頻率為115 MHz，對應(yīng)衍射光中心波長為626.08 nm，各標(biāo)記區(qū)域亮度較高，但其四周的邊界并不明顯，此時僅憑肉眼很難清晰的辨別出各區(qū)域的具體形態(tài)，隨著超聲頻率的增加，對應(yīng)衍射光中心波長不斷減小，各標(biāo)記區(qū)域的邊界開始變得逐漸清晰，當(dāng)其超聲頻率調(diào)至145 MHz，對應(yīng)衍射光中心波長為522.52 nm時，如圖5(e)所示，此時各標(biāo)記區(qū)域視野清晰，可直接憑肉眼觀察到其具體的形態(tài)。

圖6(a)給出了整體觀察區(qū)域透射光強(qiáng)變化曲線，可以看出波長在509.69～527.59 nm時，成像透射光強(qiáng)均處于較強(qiáng)的水平，且在光波長為522.52 nm附近達(dá)到最大值(對應(yīng)超聲頻率為145 MHz)，與肉眼觀察結(jié)果基本吻合，這表明在522.52 nm中心波長處更有利于對皮膚鱗狀細(xì)胞癌的整體微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)及樣貌進(jìn)行深入細(xì)致的研究。

為了對皮膚鱗狀細(xì)胞癌在不同衍射光中心波長下的成像結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步地比對和研究，分析了標(biāo)記區(qū)域A以及其周圍的四個參考區(qū)域B，C，D和E的透射強(qiáng)度，并定義了透射差異系數(shù)，用以分別描述在不同中心波長衍射光下，四個參考區(qū)域相對于相鄰標(biāo)記區(qū)域A的透射光強(qiáng)差異大小； 透射差異系數(shù)為標(biāo)記區(qū)域A的透射光強(qiáng)與四個參考區(qū)域透射光強(qiáng)的差值除以標(biāo)記區(qū)域透射光強(qiáng)數(shù)值所得，具體的透射強(qiáng)度差異系數(shù)曲線如圖6(b)所示。從圖6(b)中可以看出，B和E區(qū)域的透射差異系數(shù)整體較低，且曲線的整體走向趨勢較為平緩，說明B和E區(qū)域的透射光強(qiáng)與A區(qū)域的透射光強(qiáng)差異較小，即在同一中心波長衍射光下的成像亮度較為相近。對于C和D區(qū)域，其透射差異系數(shù)整體偏高，說明C和D區(qū)域的透射光強(qiáng)與A區(qū)域相比差異較大，C和D區(qū)域的透射差異系數(shù)曲線分別在512.18和514.71 nm處出現(xiàn)極值，其位于整體透射光強(qiáng)較高的光波長區(qū)間內(nèi)，但C和D區(qū)域透射光強(qiáng)相對較低； 這說明在整體觀察區(qū)域亮度較高的情況下，仍然不易較為準(zhǔn)確的界定出C和D組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)邊緣。

圖像邊緣提取可以更直觀地對比非染色皮膚鱗狀細(xì)胞癌切片在不同中心光波下的顯微成像差異，處理結(jié)果如圖7(a)—(h)所示。圖7(e)中C和D兩個區(qū)域在整體視野較為明亮的衍射光波長下，仍然不能觀察到完整的組織圖像邊緣，且亮度較低； 圖7(h)中，在整體視野較暗的衍射波長下也幾乎很難觀察到C和D兩區(qū)域組織圖像的邊緣。圖7(e)對應(yīng)的衍射光中心波長為522.52 nm，從該圖中可以明顯的觀察到A，B和E三個區(qū)域較為明亮的組織圖像邊緣，且組織圖像的邊緣較為完整。圖7(d)和(f)中也可明顯地觀察到A，B和E三個區(qū)域較為完整的組織圖像邊緣，但其亮度相對較弱； 除上述三幅圖，在其余的圖7(a)，(b)，(c)，(g)和(h)中，A，B和E三個區(qū)域均難以觀察到完整的組織邊緣。綜合圖像邊緣提取與圖像亮度變化分析的結(jié)果表明，衍射光中心波長在497.87～551.29 nm內(nèi)，可在整體視野較為明亮的情況下對皮膚鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)行觀察和研究； 在衍射光中心波長為522.52 nm時，更便于對皮膚鱗狀細(xì)胞癌的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行精細(xì)觀察以及深入識別。

圖6 皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織透射光強(qiáng)數(shù)據(jù)曲線

圖7 皮膚鱗狀細(xì)胞癌超光譜顯微圖像邊緣提取結(jié)果

(a)： 未濾波圖像； (b)：fa=115 MHz，λ0=626.08 nm； (c)：fa=125 MHz，λ0=586.25 nm； (d)：fa=135 MHz，λ0=551.29 nm； (e)：fa=145 MHz，λ0=522.52 nm； (f)：fa=155 MHz，λ0=497.87 nm； (g)：fa=165 MHz，λ0=476.62 nm； (h)：fa=175 MHz，λ0=458.26 nm

Fig.7Resultsofhyperspectralmicroscopicimageedgeextractionforcutaneoussquamouscellcarcinoma

(a)： Unfiltered image； (b)：fa=115 MHz，λ0=626.08 nm； (c)：fa=125 MHz，λ0=586.25 nm； (d)：fa=135 MHz，λ0=551.29 nm； (e)：fa=145 MHz，λ0=522.52 nm； (f)：fa=155 MHz，λ0=497.87 nm； (g)：fa=165 MHz，λ0=476.62 nm； (h)：fa=175 MHz，λ0=458.26 nm

3 結(jié) 論

基于優(yōu)良的分光元器件非共線AOTF建立了一套聲光濾波超光譜顯微成像系統(tǒng)，并對非染色皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織切片進(jìn)行了顯微光譜成像研究，得出如下結(jié)論： 自主搭建的聲光濾波超光譜顯微成像系統(tǒng)具備很高的光譜分辨率和圖像穩(wěn)定性，能夠很好地滿足生物組織超光譜顯微成像需要； 在實(shí)驗(yàn)中獲得了超聲波頻率與衍射光中心波長的調(diào)諧關(guān)系，光譜帶寬與光波長的關(guān)系曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均與理論預(yù)期符合較好。通過調(diào)諧超聲波頻率，得到了不同衍射光中心波長下人體皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織的圖像，在各波段范圍內(nèi)圖像清晰度較高，圖像穩(wěn)定； 定義的透射差異系數(shù)能夠很好地表達(dá)人體皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織在不同組織結(jié)構(gòu)上透射光強(qiáng)的差異，透射差異系數(shù)曲線的整體走勢與經(jīng)圖像邊緣提取分析結(jié)果具有良好的一致性； 在497.87～551.29 nm光波長范圍內(nèi)，可在整體視野較為明亮的情況下對皮膚鱗狀細(xì)胞癌開展高質(zhì)量地觀察研究； 在522.52 nm，更便于對皮膚鱗狀細(xì)胞癌的組織精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行辨別與深入研究。綜上所述，基于AOTF的聲光濾波超光譜顯微成像技術(shù)可為皮膚鱗狀細(xì)胞癌及相關(guān)疾病的無損快速光學(xué)檢測與診斷提供一種有效的技術(shù)手段。