王素春,孫亞偉,樊擎瑩,黃保續(xù),康京麗,汪 洋,劉華雷,張?jiān)葡?,王楷宬
(1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島 266032;2.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471023;3.臨朐縣職業(yè)教育中心學(xué)校,山東臨朐 262605)
新城疫(Newcastle disease,ND)是由副黏病毒科腮腺炎病毒屬的禽副黏病毒I 型引起的高度接觸性禽類烈性傳染病,以呼吸道癥狀為主要特征,同時(shí)伴發(fā)神經(jīng)癥狀、胃腸道病變和頭部腫大。ND于1926 年首次暴發(fā)于印度尼西亞的爪哇和英國(guó)的新城,次年Doyle 才首次分離到病原并定名為新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)[1-2]。ND傳播迅速、傳染性極強(qiáng)、遍布五大洲,發(fā)病率和死亡率有時(shí)可高達(dá)100%,給養(yǎng)禽業(yè)造成了難以估計(jì)的經(jīng)濟(jì)損失[6-7],因此被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為須通報(bào)動(dòng)物疫病。在我國(guó),ND 流行狀況也較為嚴(yán)重[3-5]。
NDV 基因組為單股負(fù)鏈RNA,其結(jié)構(gòu)模式為3'-NP-P-M-F-HN-L-5',分別編碼6 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白,包括核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)和RNA 聚合酶(L)。M、F、HN 蛋白參與病毒囊膜的合成。M 蛋白是一種多功能蛋白,主要成分為糖蛋白。該蛋白參與病毒裝配,因而既能促進(jìn)病毒因子感染,也可控制病毒致病性;不僅能抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成,還能抑制RNA 轉(zhuǎn)錄[8-10]。根據(jù)病毒基因組長(zhǎng)度、F基因和L基因序列,NDV 可分為兩大分支:Class I 和Class II[11]。Class I一般為低毒力或無(wú)毒力毒株,多從水禽中分離到;Class II 到目前為止共發(fā)現(xiàn)有18 個(gè)基因型,分別為基因 I—XVIII 型。我國(guó)已發(fā)現(xiàn)Class II NDV 的11個(gè)基因型(I—IX 型和XII 型、XV 型)。VIId 基因亞型毒株是我國(guó)流行最廣的強(qiáng)毒株,所占比例超過(guò)60%。我國(guó)ND 流行情況比較復(fù)雜,以VIId 基因亞型毒株為主,多種基因型毒株并存,既有疫苗無(wú)法完全保護(hù)的變異株,又有重組株,還有水禽、鴿、候鳥(niǎo)等攜帶的潛在威脅毒株[12-14],因此需要研究適合我國(guó)流行毒株的高通量快速檢測(cè)方法。為此,本研究建立了NDV 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)方法,以期為該病監(jiān)測(cè)與防控提供技術(shù)支持。
Qubit 核酸濃度測(cè)定儀及配套試劑:購(gòu)自Life Technologies 公司;超凈工作臺(tái):美國(guó)Forma Scientific 公司;移液器:Eppendorf 公司;孵化器:德州誠(chéng)信孵化設(shè)備有限公司;高速臺(tái)式離心機(jī):德國(guó)Heraeus Biofuge primoR;熒光定量PCR 儀:Bio-Rad CFX96 Real-time PCR System。
PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit(Perfect Real Time)、Primescript One step RT-PCR Kit Ver.2:寶生物工程(大連)有限公司;QIAamp Viral RNA Mini Kit 核酸提取試劑盒:德國(guó)QIAGEN 公司;Low-Profile PCR Tubes 8-tube strip:BIO-RAD;Optically clear flat 8 Cap Strips:Thermo Scientific。異丙醇、無(wú)水乙醇、RNaseA 等,均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>
NDV、各亞型甲型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)、傳染性喉氣管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)等毒株:由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心禽病監(jiān)測(cè)室保存,毒株詳細(xì)信息見(jiàn)表1。按照說(shuō)明書(shū)操作,使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取病毒RNA,并使用Qubit 核酸濃度測(cè)定儀及配套試劑測(cè)定RNA 濃度。
從GenBank 中下載不同亞型、不同國(guó)家、不同分離時(shí)間的NDV 毒株的M基因序列,采用MEGA 6.0[15-16]進(jìn)行序列比對(duì)分析,選取保守區(qū)域進(jìn)行熒光檢測(cè)引物和探針設(shè)計(jì),并對(duì)多條引物、探針進(jìn)行組合、篩選與檢驗(yàn),以篩選出最優(yōu)引物和探針。
配制實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 反應(yīng)液,每管25 μL,含有2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5 μL、5U/μL TaKaRa ExTaqHS 0.5 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL,以 及10 pmol/μL NDV forward、NDV reverse 和NDV probe 各0.5 μL,RNase Free dH2O 8.0 μL,待檢測(cè)樣品RNA 模板2 μL。
檢測(cè)反應(yīng)條件設(shè)置為:第1 階段,42 ℃/5 min;第2 階段,95 ℃/10 s;第3 階段,95 ℃/5 s,60 ℃/20 s(收集熒光),40 個(gè)循環(huán)。無(wú)Ct 值并且無(wú)擴(kuò)增曲線,樣品判為陰性;Ct≤36,且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,樣品判為陽(yáng)性。
表1 NDV 毒株信息統(tǒng)計(jì)
采用上述反應(yīng)體系與反應(yīng)條件,檢測(cè)表1 中的病毒RNA 和DNA,以評(píng)估該檢測(cè)方法的特異性。提取的核酸經(jīng)Qubit 核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定RNA 濃度后,將此病毒RNA 稀釋成1 ng/μL,再10 倍梯度依次稀釋成10-1~10-6ng/μL;各取2 μL 作為反應(yīng)模板,按照前述加樣方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 核酸擴(kuò)增。
采集分布在13 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)的各類家禽的咽拭子樣品共480 份,將其置于含有10%甘油和抗生素(含青霉素2 000 IU/mL、鏈霉素2 000 IU/mL、制霉菌素1 000 IU/mL、BSA 5 mg/mL)的PBS(pH7.2)緩沖液中,-80 ℃保存。將采集的樣品渦旋混勻后,4 ℃ 10 000 r/min 離心5 min;取上清,使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取病毒核酸[17],-80 ℃保存。使用96 孔反應(yīng)管加入上述反應(yīng)體系,分別加入待檢樣品RNA 進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí),參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《新城疫診斷技術(shù)》(GB/T 16550—2008),對(duì)480 份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)比檢測(cè)結(jié)果,分析本試驗(yàn)建立方法在臨床檢測(cè)中的適用性。
最終篩選出最適合引物(正向引物NDV forward、反向引物NDV reverse)和探針(NDV probe)。其序列已申請(qǐng)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)枺?01910124943.8)。對(duì)探針5'端進(jìn)行羧基熒光素FAM 標(biāo)記,3'端進(jìn)行淬滅基團(tuán)BHQ1 標(biāo)記(表2)。其中NDV probe 為T(mén)aqMan 熒光探針。
表2 最適引物及探針序列
結(jié)果顯示,除各亞型NDV RNA 模板對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)組出現(xiàn)了正常熒光檢測(cè)曲線外,其他非特異性病毒試驗(yàn)組及陰性對(duì)照組均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。結(jié)果表明,此方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)NDV 的特異性檢測(cè),且不與其他相關(guān)病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。
本研究篩選的引物和探針組合能夠保證檢測(cè)時(shí)的靈敏性,檢測(cè)靈敏度為RNA 終濃度10-4ng/μL(圖1)。
用本試驗(yàn)建立的NDV 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)方法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《新城疫診斷技術(shù)》(GB/T 16550—2008)中的RT-PCR 檢測(cè)方法,同時(shí)對(duì)13 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)的480 份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,25 份樣品在FAM 通道中有熒光信號(hào),判定此25 份樣品為NDV 陽(yáng)性。國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果與該方法一致,κ值為1(P<0.001)。結(jié)果表明,本試驗(yàn)篩選的引物和探針通過(guò)熒光RT-PCR 方法檢測(cè)NDV 的準(zhǔn)確可信度高,可用于臨床樣品檢測(cè)。
圖1 NDV 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)靈敏度試驗(yàn)結(jié)果
ND 目前是我國(guó)主要的家禽疫病之一。在本研究所做的臨床樣品檢測(cè)中,檢測(cè)的13 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)中有8 個(gè)感染了NDV,場(chǎng)群陽(yáng)性率達(dá)到了61.5%(8/13);480 份樣品中,共檢出25 份陽(yáng)性,個(gè)體陽(yáng)性率達(dá)到了5.21%(25/480)。NDV 可感染240 多種禽類,其中雞、火雞等對(duì)NDV 最易感,包括各個(gè)品種、年齡的雞,并且一年四季皆可發(fā)病[18-21]。除禽類之外,我國(guó)曾在病死的豬、牛、羊體內(nèi)也分離到了NDV。由此可見(jiàn),NDV 的宿主范圍在擴(kuò)大,這加大了ND 的防控難度[22-25]。NDV 不同分離株的毒力差異很大,導(dǎo)致該病的發(fā)病率、死亡率和臨床癥狀、病理變化也有所差異,因而給診斷工作帶來(lái)了很大困難。
目前,用于NDV 檢測(cè)的方法主要有病毒分離、HA/HI 試驗(yàn)及普通PCR 等。但是這些方法都有一定的局限性,不適于該病的快速檢測(cè)[26]。1991 年,Jestin 等[27]首先建立了NDV RT-PCR 檢測(cè)方法。在我國(guó),2000 年謝芝勛等[28]建立了對(duì)NDV 快速檢測(cè)的RT-PCR 方法。本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 是在PCR 反應(yīng)體系中加入了熒光基團(tuán),通過(guò)熒光信號(hào)積累,實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR 進(jìn)程,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析[29]。這種方法可快速、準(zhǔn)確、定性地檢測(cè)出NDV。
本研究在分析NDV 流行毒株基因序列后,以M基因?yàn)槟康男蛄?,設(shè)計(jì)了多個(gè)引物和探針,最終篩選出了一組最佳的引物和探針,建立了實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)方法,并將其運(yùn)用于臨床樣本檢測(cè)。結(jié)果顯示,該引物和探針特異性好、靈敏度高。本研究使用的TaqMan 熒光探針?lè)ㄊ怯蒐ivak 等[30]于1995 年首先報(bào)道的。這種方法實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)積累與PCR 產(chǎn)物形成的完全同步,不僅避免了傳統(tǒng)SYBR Green I 染色法造成的污染,而且特異性強(qiáng),避免了出現(xiàn)假陽(yáng)性[23]。
有研究表明,M 蛋白序列與其他副黏病毒M蛋白同源性較小[10]。因此,本研究根據(jù)NDVM基因篩選引物探針而建立的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)方法特異性好,不與AIV、IBV、ILTV 等其他病毒發(fā)生交叉反應(yīng),解決了ND 不易與其他禽病區(qū)分的困難。本研究設(shè)計(jì)引物和探針時(shí),選擇比對(duì)分析的M基因序列中,既有比較古老的毒株序列、疫苗毒株序列,也有近年來(lái)我國(guó)新發(fā)的各個(gè)基因型毒株序列,涵蓋范圍較廣。與OIE 推薦方法相比,該方法對(duì)我國(guó)流行的NDV 更有針對(duì)性,特異性更好。該方法可檢測(cè)出Class I 分支的2 型、3 型、7 型和Class II 分支的I 型、II 型、VII 型的NDV。本研究建立的檢測(cè)方法靈敏度高,檢測(cè)下限達(dá)到了10-4ng/μL,與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16550—2008 中的RT-PCR 檢測(cè)方法作比對(duì),發(fā)現(xiàn)樣品符合率達(dá)到100%。
本研究建立的方法特異性好、靈敏度高,可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)NDV,可檢出我國(guó)當(dāng)前流行的多個(gè)NDV 基因型,能夠滿足ND 的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查需要和當(dāng)前NDV 監(jiān)測(cè)的需求。