曹愛玲，陳怡琳，蔡路昀，曹敏杰，沈 立，侯寒黎

（1.錢江海關(guān)，浙江杭州 310007；2.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州 121013；3.浙江大學(xué)寧波研究院，浙江寧波 315100；4.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058）

呋喃西林（nitrofurazone，NFZ）是硝基呋喃類藥物，其代謝產(chǎn)物氨基脲（semicarbazide，SEM）是一種聯(lián)胺類小分子化合物，易與生物細胞膜蛋白結(jié)合生成穩(wěn)定殘留，具有潛在的致癌、致畸和致突變性[1-3]，長期攝入會對人體健康造成嚴(yán)重危害。1995 年，呋喃西林已被歐盟列入禁止在動物源食品中使用的藥物[4]。我國于2002 年公布的《食品動物禁用獸藥及其他化合物清單》公告中也明令禁止呋喃西林用于食品動物的治療[5]。呋喃西林作為一種廣譜抗菌藥，在動物體內(nèi)會迅速代謝，故SEM 常被選定為檢測呋喃西林藥物殘留的標(biāo)志物。

目前，應(yīng)用于檢測動物源食品中SEM 含量的方法主要有高效液相色譜（HPLC）及其聯(lián)用技術(shù)[6-7]和免疫分析法[8-9]兩種。而應(yīng)用于檢測甲殼類水產(chǎn)品中SEM 含量的方法主要是高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）。黃宣運等[10]利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，檢測分析出中華絨螯蟹在室外池塘自然養(yǎng)殖條件下的體內(nèi)SEM 殘留量及其消除規(guī)律。吳旭等[11]采用該法檢測發(fā)現(xiàn)，在淮安地區(qū)的小龍蝦養(yǎng)殖中仍存在違規(guī)使用呋喃西林藥物的現(xiàn)象。宋蓓等[12]優(yōu)化了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，用以檢測日本沼蝦中的SEM 殘留量，發(fā)現(xiàn)蝦殼中的SEM 檢出量最高，且以游離態(tài)形式存在；蝦肉中的SEM 檢出量最低，以結(jié)合態(tài)形式存在。

本研究按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21311—2007[13]，以南美白對蝦和中華鱉為檢測對象，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行檢測，探究不同烘干溫度對甲殼類水產(chǎn)品中SEM 檢出量的影響，以期為后續(xù)更精確快速檢測甲殼類水產(chǎn)品中的SEM 含量提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的南美白對蝦和中華鱉：購買于杭州出境水生動物注冊養(yǎng)殖場；SEM 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度≥99%；內(nèi)標(biāo)物13C15N-SEM：純度≥99%；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷和甲酸：均為色譜純；濃鹽酸、氫氧化鈉、鄰硝基苯甲醛、三水磷酸鉀、乙酸銨、尿素、乙磺酸（HEPES）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、乙二胺四乙酸（EDTA）、二硫蘇糖醇（DTT）、TCA-丙酮和碘乙酰胺：均為分析純。

萬能高速粉碎機：歐凱萊芙（香港）實業(yè)公司；DHG-9055A 鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；QTRAP?5500 LC-MS/MS 系統(tǒng)：上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司；Oasis HLB 固相萃取柱：美國沃特世公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液 準(zhǔn)確稱取適量的SEM 標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容，配置成質(zhì)量濃度為100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，-18 ℃以下避光保存。

1.2.2 混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL 于100 mL 棕色容量瓶中，用乙腈定容，配置成質(zhì)量濃度為1 mg/L 的混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃保存。

1.2.3 內(nèi)標(biāo)儲備液 準(zhǔn)確稱取適量的13C15N-SEM內(nèi)標(biāo)物，用乙腈溶液定容并配置成質(zhì)量濃度為100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，-18 ℃以下避光保存。

1.2.4 混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確移取內(nèi)標(biāo)儲備液1 mL 于100 mL 棕色容量瓶中，用乙腈定容，配置成質(zhì)量濃度為1 mg/L 的中間內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液；準(zhǔn)確移取中間內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL 于10 mL 棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度線，配制成質(zhì)量濃度為0.01 mg/L 的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃下保存。

1.3 儀器分析條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK C18，2.0 mm I.D.×150 mm，5 μm；柱溫：30 ℃；流速：0.2 mL/min；進樣量：10 μL；流動相A：乙腈；流動相B：0.1%甲酸水溶液（含0.000 5 mol/L 乙酸銨）。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.3.2 串聯(lián)質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；噴霧電壓：3 500V；離子源溫度：120 ℃；去溶劑溫度：350 ℃；錐孔氣流：氮氣，流速100 L/h；去溶劑氣流：氮氣，流速600 L/h；碰撞氣：氬氣，碰撞氣壓2.6×10-4Pa；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。監(jiān)測條件見表2。

表2 多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）的條件

1.4 樣品采集及制備

鮮活的南美白對蝦和中華鱉樣品，取自杭州出境水生動物注冊養(yǎng)殖場，整個飼養(yǎng)周期都不添加呋喃西林。樣品低溫運至實驗室后，在-80 ℃的超低溫保存箱中冷凍保存。檢測分析前，將樣品解凍至室溫。對南美白對蝦樣品，將去頭胸甲的頭部組織與蝦殼和蝦肉分剝開，均勻分成3 份，分別在70、100、130 ℃溫度條件下烘干48 h，再用粉碎機粉碎（蝦肉90 s、蝦殼150 s）；對中華鱉樣品，取鱉肉和鱉殼部分，均勻分成3 份，烘干溫度處理與南美白對蝦相同，用粉碎機粉碎（鱉肉90 s、鱉殼10 min）。

1.5 樣品前處理

1.5.1 水解和衍生化 將2 g 烘干粉碎后的樣品（精確至0.01 g）放入50 mL 離心管中，然后加入10 mL 的甲醇-水混合溶液，振蕩10 min，4 000 r/min離心5min，棄上清液；加入10 mL 0.2 mol/L 鹽酸至殘留物中，10 000 r/min 均質(zhì)1 min；依次加入100 μL 混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液、100 μL 鄰硝基苯甲醛溶液，渦動混合30 s、振蕩30 min，最后置于37 ℃恒溫箱中避光反應(yīng)16 h。

1.5.2 提取和凈化 取出離心管冷卻至室溫，加入1 mL 0.3 mol/L 磷酸鉀溶液混勻；用2.0 mol/L 氫氧化鈉調(diào)至pH7.2～7.6，振蕩提取10 min，10 000 r/min 離心10 min；用Oasis HLB 固相萃取柱凈化，控制樣液以2 mL/min 流速通過Oasis HLB 柱；用10 mL 乙酸乙酯洗脫固相萃取柱于50 mL 離心管中，用氮氣在40 ℃下吹干；加入1 mL 0.1%甲酸水溶液溶解，用3 mL 乙腈飽和的正己烷，分兩次進行液液分配；取下層溶液過0.2 μm 微孔濾膜，取10 μL 供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.5.3 混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 取5份陰性樣品，每份約2 g（精確至0.01 g），放入50 mL 離心管中，按1.5.1 洗樣后，分別加入100 μL 混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液、100 μL 混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，之后按1.5.2 進行衍生、提取和凈化，配置成最終定容濃度梯度為1、5、10、50、100 ng/mL 的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.6 數(shù)據(jù)處理

按公式（1）自動計算樣品中SEM 的濃度，計算結(jié)果扣除空白值。

式中：X為樣品中SEM 的檢出量（μg/kg）；R為樣液中的SEM 與12C15N-SEM 峰面積比值；c為混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中SEM 的濃度（ng/mL）；V為樣液最終定容體積（mL）；Rs為混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中的SEM 與12C15N-SEM 峰面積比值；m為樣品質(zhì)量（g）。

采用Excel 2010 對上述計算所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析。

1.7 蛋白含量測定

為探究不同烘干溫度下部分蛋白質(zhì)受熱分解對SEM 檢出量的影響，采用考馬斯亮藍法（Bradford法），選取中華鱉殼樣品進行蛋白質(zhì)定量測定。稱取0.21 g 烘干粉碎后的中華鱉殼樣品放入試管中，加入少量裂解液Buffer（由8 mol/L 尿素、30 mmol/L HEPES、1 mmol/L PMSF、2 mmol/L EDTA 和10 mmol/L DTT 配制而成），20 000g，4 ℃下離心30 min；取上清液，往其中加入4 倍體積預(yù)冷后的TCA-丙酮，-20 ℃條件下沉淀2 h，20 000g，4 ℃條件下離心30 min；加入3 倍體積的純丙酮，-20 ℃條件下沉淀20 min，20 000g，4 ℃條件下離心30 min。重復(fù)此操作3 次，清洗沉淀。往沉淀中加入裂解液Buffer，在pulse on 2 s，pulse off 3 s，power 180 w 超聲條件下，超聲5 min助溶，20 000g，4 ℃條件下離心30 min；取上清液，往上清液中加入DTT 至終濃度為10 mmol/L，56 ℃條件下水浴1 h；取出溶液后，迅速加入碘乙酰胺至終濃度為55 mmol/L；于暗室靜置1 h 后，采用Bradford 法，對中華鱉殼中的蛋白進行定量，用系列蛋白濃度繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定蛋白質(zhì)含量。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010、SAS 和SPSS 軟件，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理和分析，部分結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同烘干溫度下的SEM 檢出量

分別取4 份蝦和鱉的殼與肉組織（空白對照1 份、試驗3 份），置于70、100、130 ℃下烘干48 h；研磨成粉后，按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21311—2007[13]，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對每份試樣中的SEM 進行平行檢測。結(jié)果（表3）顯示：烘干前，蝦肉中的SEM 檢出量明顯高于蝦殼中的（P＜0.05），但鱉肉和鱉殼中的SEM 檢出量幾乎一致，均＜0.5 μg/kg；隨著烘干溫度的升高，各種樣品中的SEM 檢出量均不斷上升，不同烘干溫度下的SEM 檢出量均存在顯著性差異（P＜0.05）；相同烘干溫度條件下，蝦樣品中的SEM 檢出量明顯高于鱉樣品（P＜0.05），蝦肉和鱉肉的SEM 檢出量間普遍高于相對應(yīng)的蝦殼和鱉殼。

表3 不同烘干溫度下的SEM 檢出量 單位：μg/kg

2.2 不同烘干溫度下中華鱉殼中的蛋白含量

采用Bradford 法對中華鱉殼中所含蛋白進行定量檢測分析，用系列濃度蛋白繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的回歸曲線方程為y=0.114 8x+0.005 2，R2=0.994 7（圖1），發(fā)現(xiàn)隨烘干溫度升高，鱉殼中的蛋白含量逐漸下降，其中70 ℃和100 ℃烘干條件下的蛋白含量存在顯著性差異（P＜0.05），而100 ℃與130 ℃差異不顯著（P＞0.05）。具體結(jié)果見表4。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

表4 不同烘干溫度下中華鱉殼中蛋白含量

3 討論

試驗用品南美白對蝦與中華鱉在前期飼養(yǎng)階段均未添加使用呋喃西林藥物，因此研究檢測出的SEM 為內(nèi)源性。檢測發(fā)現(xiàn)，不同烘干溫度下，各樣品中的SEM 檢出量與溫度呈正比，隨著溫度梯度升高，SEM 檢出量明顯增加。檢測還發(fā)現(xiàn)，殼中的SEM 檢出量普遍高于肉中檢出量，這與吳旭等[11]對淮安地區(qū)小龍蝦，宋蓓等[12]對日本沼蝦，McCracken 等[14]對孟加拉國淡水明蝦，Poucke 等[15]對羅氏沼蝦、凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦、挪威海蟹蝦、鋸緣青蟹和遠海梭子蟹，彭婕等[16]對中華絨螯蟹，聞聲等[17]對湖北地區(qū)蝦中各部分的SEM 含量檢測結(jié)果相一致。

對不同烘干溫度下的中華鱉殼蛋白含量進行檢測發(fā)現(xiàn)，隨著烘干溫度的升高，殼中的蛋白含量在逐漸減少，說明蛋白質(zhì)因受熱而逐漸分解。而在蛋白質(zhì)受熱分解過程中可能會產(chǎn)生SEM，使SEM 檢出量增加[18]。當(dāng)然，隨著烘干溫度的提高，樣品得到濃縮，也會導(dǎo)致一定的程度的SEM 含量增加。因此，今后在進行甲殼類水產(chǎn)品中SEM 含量檢測時，對受檢樣品烘干處理的溫度不能高于70℃；在前期提取和凈化過程中，使用氮氣吹干時溫度應(yīng)當(dāng)控制在40℃，高效液相檢測過程中的柱溫箱溫度應(yīng)當(dāng)控制在30℃，避免出現(xiàn)高溫波動，導(dǎo)致受檢樣品中的部分蛋白受熱分解產(chǎn)生SEM，影響SEM 檢出量。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)：烘干溫度對甲殼類水產(chǎn)品中的SEM 檢出量有較大影響，隨著烘干溫度的升高，部分蛋白質(zhì)受熱分解會產(chǎn)生SEM，導(dǎo)致SEM 檢出量增加；同一甲殼類水產(chǎn)品中，殼中的SEM 檢出量普遍高于肉中的檢出量。因此，在檢測甲殼類水產(chǎn)品中的SEM 含量時，對受檢樣品的烘干溫度要控制在70 ℃以下，并且要選擇合適的檢測樣品種類。本研究探明了烘干溫度與SEM 檢出量的關(guān)系、SEM 易殘留的部位以及引起檢出量增加的原因，為后續(xù)更精確快速檢測甲殼類水產(chǎn)品中的SEM 含量提供了依據(jù)。