南文龍，李 林，鞏明霞，陸 游，2，吳曉東，陳義平

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的家豬和野豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，是我國一類動物疫病，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）法定報(bào)告動物疫病。我國自2018 年8月確診首起疫情以來，該病已擴(kuò)散蔓延至除臺灣、澳門外全國所有的其他省（直轄市、自治區(qū)），給我國養(yǎng)豬業(yè)及相關(guān)行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，甚至影響到肉品市場供應(yīng)。

目前，本病尚無有效疫苗可以預(yù)防，疫病防控主要依靠實(shí)施嚴(yán)格的生物安全措施。實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速的病原學(xué)檢測是ASF 防控的基礎(chǔ)，可為各項(xiàng)防控措施的制定、實(shí)施及評估提供有效支持。本文就相關(guān)病源學(xué)檢測方法進(jìn)行簡要綜述，以期為我國ASF 防控和診斷技術(shù)研發(fā)提供參考。

1 病毒分離

采集豬血液、脾臟、淋巴結(jié)等組織樣本，接種豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophages，PAM）等原代細(xì)胞。ASFV 會在易感細(xì)胞中復(fù)制并產(chǎn)生細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）。在細(xì)胞培養(yǎng)中加入豬紅細(xì)胞后，多數(shù)ASFV 毒株會產(chǎn)生紅細(xì)胞吸附反應(yīng)（hemadsorption，HAD），即在感染的白細(xì)胞周圍吸附豬紅細(xì)胞形成“玫瑰花環(huán)”。由于部分ASFV 毒株并不產(chǎn)生HAD，若分離培養(yǎng)物中出現(xiàn)CPE 而沒有出現(xiàn)HAD，則需采用免疫熒光或PCR 等方法確認(rèn)細(xì)胞中是否存在ASFV；如果未出現(xiàn)CPE，免疫熒光和PCR 檢測也為陰性，需傳代3～5 次，方可確認(rèn)為陰性。在首次暴發(fā)ASF的地區(qū)，經(jīng)PCR、免疫熒光等方法檢測為陽性的樣品，建議采用HAD 方法進(jìn)行病毒鑒定[1-2]。

2 抗原檢測

2.1 免疫熒光法

免疫熒光法是OIE推薦的ASF檢測方法之一。通過異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記抗ASFV 特異性抗體，實(shí)現(xiàn)臟器涂片或薄層冷凍切片、細(xì)胞培養(yǎng)物中的ASFV 抗原的檢測。免疫熒光法是鑒別不產(chǎn)生HAD 的ASFV 毒株感染，以及區(qū)分ASFV 與其它病毒（如偽狂犬病毒）產(chǎn)生CPE 的重要手段。免疫熒光法檢測對于急性ASF 感染高度敏感，但在亞急性和慢性感染中，敏感性顯著下降，可能與感染組織中已形成抗原抗體復(fù)合物，阻斷了ASFV 抗原與檢測用抗體的結(jié)合有關(guān)[1-2]。

2.2 ELISA 法

Wardley 等[3]采用抗ASFV 的特異性血清IgG作為包被蛋白，建立了間接ELISA 方法，檢測ASFV 抗原濃度為50～500 HAD50/mL。Vidal 等[4]采用抗ASFV VP72 蛋白的單克隆抗體，建立了夾心ELISA 方法，檢測VP72 抗原濃度為0.05 μg/mL，全病毒為2.3×102PFU/mL。Hutchings 等[5]研究發(fā)現(xiàn)采用抗ASFV 的多克隆抗體，比采用抗VP72 蛋白單克隆抗體包被蛋白時(shí)，檢測ASFV 抗原稍敏感。

目前，已有商品化ASFV 抗原ELISA 檢測試劑盒出售，與熒光定量PCR 方法相比，具有設(shè)備要求低、成本低、操作方便等優(yōu)勢，但敏感性和特異性有待提高?；诖?，已有學(xué)者和公司將化學(xué)發(fā)光技術(shù)應(yīng)用于ELISA 檢測結(jié)果判定，建立了ASFV 化學(xué)發(fā)光ELISA，其檢測敏感性顯著提升。與免疫熒光法相似，在亞急性和慢性感染中，抗原ELISA 的檢測敏感性顯著降低。糧農(nóng)組織（FAO）建議ELISA 方法用于“群體”樣本大規(guī)模篩查，并需輔助以其他檢測方法[1]。

2.3 免疫層析試紙條法

Sastre 等[7]應(yīng)用抗VP72 蛋白單克隆抗體研制免疫層析試紙條。對實(shí)驗(yàn)感染豬的ASFV 血液樣品的檢測結(jié)果表明，該試紙條可檢測病毒含量超過104HAU 的樣本；臨床樣品檢測結(jié)果顯示，PCR方法陽性檢出率最高，試紙條陽性檢測率（60%）高于商品化的抗原檢測ELISA 試劑盒（48%）。吳海濤等[8]以抗VP72 蛋白單克隆抗體作為金標(biāo)抗體，以ASFV 多克隆抗體作為檢測線，制備了膠體金試紙條，針對重組VP72 蛋白的最低檢出限在20 ng/mL 左右。劉波[9]以抗K205 蛋白單克隆抗體作為金標(biāo)抗體，用兔抗K205R 蛋白抗體作為檢測線，制備的膠體金試紙條針對重組K205R 蛋白的最低檢出限為30～40 ng/mL。

經(jīng)過多年發(fā)展，目前膠體金免疫層析試紙條仍是最成熟，也是普遍應(yīng)用于ASF 檢測的方法，其臨場使用簡便、快速，但也存在敏感性低的不足。近年，一些免疫學(xué)新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，市面已出現(xiàn)基于乳膠凝集、熒光微球技術(shù)研發(fā)的非洲豬瘟病原檢測用免疫層析試紙條，新方法的運(yùn)用顯著提升了檢測敏感性，具有良好應(yīng)用前景。

3 分子生物學(xué)檢測方法

與免疫學(xué)檢測技術(shù)相比，分子生物學(xué)方法通常更加敏感、特異，且同樣適宜于高通量檢測。OIE 在《陸生動物診斷實(shí)驗(yàn)和疫苗手冊》中推薦了PCR 檢測法，并常作為ASFV 檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。此外，國內(nèi)外學(xué)者還進(jìn)行了線性指數(shù)PCR、數(shù)字PCR、重組酶聚合酶擴(kuò)增等方法的探索。

3.1 常規(guī)PCR 檢測法

基于凝膠電泳的常規(guī)PCR 檢測方法，其ASFV 最低檢出限多為幾十到上百拷貝的DNA。Agüero 等[10]基于VP72基因設(shè)計(jì)建立了常規(guī)PCR檢測方法，可以檢測到0.12 HAU50的ASFV 且具有良好的特異性，是目前OIE 推薦的PCR 檢測方法。羅玉子等[12]建立了改良的常規(guī)PCR 方法，其最低檢出限可達(dá)到60 拷貝，比OIE 推薦PCR 方法更加敏感。崔尚金等[11]建立了新型納米PCR 檢測方法，最低檢出限可達(dá)10 拷貝DNA。

除了單獨(dú)檢測ASFV 病原的PCR 方法，也有同時(shí)檢測多種豬病的多重PCR 方法的報(bào)道。Hu 等[14]建立了同時(shí)檢測鑒別ASFV、豬瘟病毒、高致病性藍(lán)耳病病毒、藍(lán)耳病病毒、偽狂犬病病毒的多重PCR 方法，其中ASFV 最低檢出限為1.50×103拷貝DNA。

3.2 熒光定量PCR 檢測法

與常規(guī)PCR 相比，熒光定量PCR 擴(kuò)增的基因片段更短，通常更加快速、敏感，最低檢出限可達(dá)幾個(gè)到幾十拷貝的DNA 模板；同時(shí)不需開蓋，可減少擴(kuò)增產(chǎn)物污染的可能，是目前生產(chǎn)實(shí)踐中ASFV 檢測應(yīng)用最多的一類方法。

King 等[15]依據(jù)VP72基因建立了基于TaqMan探針的熒光定量PCR 方法，最低檢出限約為40 拷貝DNA，是目前OIE 推薦的檢測方法。Mckillen等[16-17]根據(jù)9GL基因設(shè)計(jì)引物，建立了基于MGB探針和分子信標(biāo)探針的熒光定量PCR 檢測方法，最低檢出限均達(dá)到20 拷貝DNA。Ronish 等[18]依據(jù)VP72基因建立了基于線性指數(shù)的PCR（linearafter-the-exponential PCR，LATE-PCR），最低檢出限可達(dá)到1～10 拷貝DNA。Fernández-Plinero 等[13]采用商品化通用探針庫中探針，結(jié)合VP72基因特異性引物，建立熒光定量PCR 方法，同時(shí)設(shè)置豬β-actin 作為內(nèi)參對照，發(fā)現(xiàn)該方法最低檢出限為18 拷貝DNA。

根據(jù)探針標(biāo)記熒光基團(tuán)的不同，采用熒光定量PCR 方法也可實(shí)現(xiàn)多病原的同時(shí)檢測。Grau 等[19]建立了可從豬唾液樣品中同時(shí)檢測ASFV、豬瘟病毒、口蹄疫病毒3 種病原的熒光定量PCR 方法。

3.3 恒溫?cái)U(kuò)增檢測法

恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)是近年分子診斷研究熱點(diǎn)，具有兩方面突出優(yōu)勢：一是可以使用水浴設(shè)備在單一溫度下進(jìn)行等溫反應(yīng)，無需昂貴的熱循環(huán)設(shè)備，且反應(yīng)時(shí)間短；二是可通過在體系中添加的顏料色彩變化或是在試紙條上形成檢測線，直接肉眼判別結(jié)果，適合現(xiàn)場檢測。

Hjertner 等[20]最早建立了ASFV 侵染檢測（invader assay）恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)能夠精確地定量DNA 和RNA 靶基因片段，檢測ASFV 最低檢出限為2 500 拷貝DNA，與豬瘟病毒無交叉反應(yīng)。雖然此技術(shù)敏感性低于其他分子檢測方法，但能夠檢測含有大量ASFV 的病死豬樣品。

James 等[21]建立了ASFV 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification method，LAMP），其最低檢出限為330 拷貝DNA。國內(nèi)學(xué)者江彥增等[22]、王彩霞等[23]、楊吉飛等[24]也建立了LAMP 檢測方法，最低檢測限可達(dá)10 拷貝DNA。除了通過專用濁度儀生成曲線判定結(jié)果之外，LAMP 方法可通過在體系中添加鈣黃綠素等顏料，擴(kuò)增后利用顏色變化方便肉眼判讀結(jié)果。

李林等[25]建立了實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）方法。該方法在20 min 內(nèi)即可檢測16 拷貝DNA，且與豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒II 型、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病病毒均無交叉反應(yīng)，為我國ASFV 臨床鑒別診斷、檢驗(yàn)檢疫和病原監(jiān)測提供了技術(shù)支持。Miao 等[26]結(jié)合應(yīng)用試紙條判定RPA 檢測結(jié)果，該方法可在10 min 內(nèi)檢測150 拷貝ASFV 的DNA，且與其他豬病無交叉反應(yīng)。

Fraczyk 等[27]建立了交叉引物擴(kuò)增方法（crosspriming amplication method，CPA），對VP72基 因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒最低檢出限達(dá)7.2 拷貝，同時(shí)可通過在反應(yīng)體系中添加SYBR Green I 染料，陽性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)紫外光照射產(chǎn)生明亮的綠色熒光，肉眼判定結(jié)果。Gao 等[28]將CPA 技術(shù)與試紙條聯(lián)用，建立了ASFV 檢測方法，可檢測200 拷貝DNA，在臨床樣品的檢測中，與熒光定量PCR 方法符合率達(dá)97.4%（44/45）。

Wozniakowski 等[29]利用一種新型的聚合酶交叉螺旋反應(yīng)（polymerase cross-linking spiral reaction，PCLSR），檢測豬血中的ASFV 核酸，該方法可檢測7.2×102拷貝/μL 的VP72 質(zhì)粒模板，與豬瘟病毒、藍(lán)耳病病毒、豬流行性腹瀉病毒無交叉反應(yīng)。

3.4 數(shù)字PCR 法

數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是第三代PCR 技術(shù)，具有高靈敏度、高精確性、高耐受性、絕對定量等特點(diǎn)。鄔旭龍等[30]根據(jù)ASFVK205R基因設(shè)計(jì)1 對特異性引物和TaqMan 探針，建立了ASFV 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 和微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）檢測方法。經(jīng)檢測，建立的ASFV 熒光定量PCR 和ddPCR 檢測方法線性關(guān)系較好（R2≥0.998），ddPCR 的最低檢出限可達(dá)到0.36 拷貝DNA，在20 μL 反應(yīng)體系中約為10 拷貝/反應(yīng)，具有很高的特異性和重復(fù)性，且不與其他常見豬病病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。

3.5 生物傳感器法

Biagetti 等[31]基于DNA/LNA 探針與VP72靶基因保守區(qū)互補(bǔ)配對，建立了ASFV 生物傳感器檢測方法。該方法最低檢出限為178 拷貝/μL 基因組DNA，定量限為245 拷貝/μL DNA，可一次性檢測40 份樣品，單次測試時(shí)間僅需要5 min。在ASFV 臨床感染樣品檢測中，與OIE 推薦的熒光定量PCR 方法具有極好的相關(guān)性。

3.6 原位雜交法

Ballester 等[32]使用原位雜交技術(shù)，用地高辛標(biāo)記的探針檢測福爾馬林固定、石蠟包埋組織中的ASFV 基因組DNA，并取得較好的檢測效果。

4 小結(jié)

目前，根據(jù)我國ASF 防控政策，ASFV 分離、鑒定工作僅能在許可的實(shí)驗(yàn)室中開展。膠體金試紙條、ELISA等免疫學(xué)病原檢測方法，使用方便、快速，但受限于敏感性和特異性，目前主要應(yīng)用于急性發(fā)病或病死豬的快速診斷及群體篩查；分子生物學(xué)檢測方法仍是ASFV 病原檢測的主要手段，特別是熒光定量PCR 方法以其敏感、特異、快速、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)在我國實(shí)踐中廣泛應(yīng)用。

應(yīng)用ASFV 分子生物學(xué)檢測方法時(shí)，應(yīng)注意如下兩方面：（1）分子檢測方法是對ASFV 基因組DNA 進(jìn)行檢測，因此當(dāng)檢測結(jié)果為陽性時(shí)，僅表示檢測樣品中存在病毒核酸，并不能說明樣品中是否具有感染性的病毒粒子，如火腿、肉腸、血粉等產(chǎn)品檢測結(jié)果為陽性時(shí)，應(yīng)綜合考慮其加工工藝，也就是通過高溫煮熟、熏制等是否足以殺滅病毒。（2）應(yīng)注意分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，在檢測過程中適當(dāng)增加對照及質(zhì)控樣品。分子檢測方法靈敏度較高，當(dāng)樣品處理時(shí)出現(xiàn)樣品間交叉污染，或是由于擴(kuò)增產(chǎn)物造成環(huán)境污染等，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果；當(dāng)樣品腐敗變質(zhì)，或是在反應(yīng)體系中存在擴(kuò)增反應(yīng)抑制成分時(shí)，易造成結(jié)果的假陰性。

當(dāng)前，微流控、化學(xué)發(fā)光、基因芯片等新技術(shù)開始不斷應(yīng)用于動物疫病檢測領(lǐng)域，各種自動化、一體化、便攜式或高通量設(shè)備不斷被研發(fā)，未來ASFV 病原學(xué)檢測將更加快速、準(zhǔn)確及自動化，必會進(jìn)一步為ASF 防控提供有效支持。