王 雙，楊 瑞，白 薇

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物逆境生理與分子生物學(xué)自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018; 2.內(nèi)蒙古賽科星繁育生物技術(shù)(集團(tuán))股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

WRKY蛋白家族是植物中所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在其N(xiāo)端一般存在由60個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合域，其中包含有WRKYGQK保守序列(因此被稱為WRKY結(jié)構(gòu)域)和一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域(CX4-5CX22-23HXH或CX7CX23HXC)[1]。在對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)行調(diào)控時(shí)，WRKY蛋白與順勢(shì)作用元件中的W-box(C/T)TGAC(C/T)或W盒(TGAC(C/T))進(jìn)行特異性識(shí)別和結(jié)合，來(lái)調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄，從而實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能[2-3]。WRKY蛋白可參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝物的合成及生物與非生物脅迫的過(guò)程[4-8]。在水稻的基因組中鑒定出100多個(gè)WRKY基因的存在[9]，發(fā)現(xiàn)它們參與調(diào)控了水稻對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)，水稻的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成，與SA、JA、GA、ET等激素信號(hào)途徑的相互作用[10]。為了探明OsWRKY76是否參與調(diào)控水稻系統(tǒng)獲得抗性，闡明OsWRKY76的功能，本試驗(yàn)根據(jù)其cDNA序列，構(gòu)建了發(fā)夾型結(jié)構(gòu)的RNA干擾(RNA interference, RNAi)載體，并轉(zhuǎn)化水稻，獲得了沉默株系，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以粳稻品種 Kitaake(Kit)為試驗(yàn)材料，溫室中種植，27～32 ℃的自然光下生長(zhǎng)。

1.2 載體與試劑

試驗(yàn)中所用的克隆載體為改造的pENTR-D TOPO 載體(Invitrogen)-L16，即在pENTR-D TOPO載體的attL1后人為加入一段多克隆位點(diǎn)。所用雙元表達(dá)載體GVG-TA7002的啟動(dòng)子為受地塞米松誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，Ubi C1300為組成型表達(dá)載體，均與pENTR載體兼容，可通過(guò)LR反應(yīng)將目的片段重組到雙元表達(dá)載體中。

LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix 購(gòu)自Invitrogen公司；TRIzol試劑、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Ex Taq DNA Polymerase、T4DNA ligase、限制性內(nèi)切酶、堿性磷酸酶 SAP、RNase A 等均購(gòu)自TaKaRa 公司; 質(zhì)粒提取試劑盒及瓊脂糖凝膠回收試劑盒等購(gòu)自天根生化科技有限公司; pEASY-T1克隆載體購(gòu)自全式金生物科技有限公司；卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)等抗生素均購(gòu)自美國(guó)Amerisco公司；其他藥品及試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 剪取水稻葉片，用TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3.2OsWRKY76-300片段的克隆 根據(jù)OsWRKY76的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，OsWRKY76-5′(TGAATTCTG CCTCGACCTCTGCGTC)和OsWRKY76-3′(TCTGCAG CCGTCTCCATGCTCTCCCT)，以cDNA為模板擴(kuò)增長(zhǎng)度為300 bp的片段。引物上分別添加EcoRⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)，用于后續(xù)克隆。將OsWRKY76-300片段克隆到pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取單克隆鑒定。

1.3.3GUS片段的克隆GUS片段的克隆以實(shí)驗(yàn)室已有的含GUS基因的載體GUS-Ubi-AH27為模板，用引物GUS-5′(TGAATTCATGAAGATGACTTA CG)，GUS-3′(TGAATTCGGTTCAGGCACAGCACA)擴(kuò)增長(zhǎng)度為500 bp的GUS片段(GUS500)，引物上均添加EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，方便后續(xù)克隆。將GUS500片段克隆到pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，選取單克隆進(jìn)行鑒定。

1.3.4OsWRKY76-300RNAi載體的構(gòu)建 將OsWRKY76-300-pEASY T1克隆載體用EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切，膠回收酶切產(chǎn)物；將GUS-pEASY T1克隆載體用EcoRⅠ酶切，膠回收酶切產(chǎn)物，用于后續(xù)RNA干擾載體中OsWRKY76-3002個(gè)反向重復(fù)片段之間的連接物。再用PstⅠ單酶切pENTR L16，用堿性磷酸酶SAP處理，去除5′末端的磷酸基團(tuán)，防止載體自連。將OsWRKY76-300分別與GUS500、L16載體連接，構(gòu)建dsWRKY76pENTR L16克隆載體。dsWRKY76pENTR L16轉(zhuǎn)化DH10B，選取陽(yáng)性單克隆進(jìn)行鑒定。

利用Gateway重組技術(shù)，將dsWRKY76pENTR L16載體中的插入片段(由GUS片段連接的OsWRKY76-300反向重復(fù)片段)通過(guò)LR反應(yīng)重組到誘導(dǎo)型雙元表達(dá)載體GVG-TA7002和組成型雙元表達(dá)載體Ubi-C1300中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，挑取單克隆鑒定。

1.3.5 誘導(dǎo)型RNAi載體轉(zhuǎn)化水稻 采用凍融法將誘導(dǎo)型RNAi載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻Kit獲得轉(zhuǎn)基因株系。

1.3.6 轉(zhuǎn)化株系OsWRKY76表達(dá)量檢測(cè) 用100 μmol/L的地塞米松葉面噴施水稻，8 h后取樣，提取水稻總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用引物OsWRKY76-R(CCGGACCTCAAGGAGGTGTG)和OsWRKY76-L(CTAGAATTCGGGCAGCTTCTGGA)通過(guò)RT-qPCR分析OsWRKY76表達(dá)量，反應(yīng)程序如下：94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsWRKY76序列分析

OsWRKY76基因cDNA序列全長(zhǎng)984 bp，編碼327個(gè)氨基酸，預(yù)計(jì)分子量34.8 ku，預(yù)計(jì)等電點(diǎn)8.26。根據(jù)NCBI網(wǎng)站上預(yù)測(cè)并分析OsWRKY76具有明顯的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，位于165-225個(gè)氨基酸，見(jiàn)圖1。

圖1 WRKY76結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of rice WRKY76

2.2 OsWRKY76-300的克隆與鑒定

PCR擴(kuò)增OsWRKY76-300片段，獲得了預(yù)期大小的條帶(圖2),將目的片段克隆到pEASY T1載體，測(cè)序結(jié)果顯示獲得了正確的片段。

M.DL5000分子量標(biāo)記；1.擴(kuò)增的OsWRKY76-300片段。 M．DL5000 molecular weight marker; 1.The amplified fragment of OsWRKY76-300.

2.3 GUS片段的克隆與鑒定

以含GUS基因的載體GUS-Ubi-AH27為模板，擴(kuò)增GUS500片段，結(jié)果顯示獲得了預(yù)期大小的片段(圖3-A)。將目的片段克隆到pEASY T1載體，用EcoR Ⅰ 進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖3-B，產(chǎn)生3 928 bp (pEASY T1載體)和500 bp左右的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.4 OsWRKY76 RNAi載體的構(gòu)建

用EcoRⅠ和PstⅠ將OsWRKY76-300片段從OsWRKY76-300-pEASY T1載體中切出，用EcoRⅠ將GUS500片段從GUS-pEASY T1載體中切出，pENTR L16載體用PstⅠ酶切后進(jìn)行脫磷酸處理，將OsWRKY76-300、GUS500與pENTR L16載體連接，構(gòu)建dsWRKY76pENTR L16克隆載體，見(jiàn)圖4。構(gòu)建好的載體用EcoRⅠ和PstⅠ酶切鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖5，產(chǎn)生了2 628(L16)，500,300 bp左右的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。

M． DL5000分子量標(biāo)記；A.GUS500片段PCR擴(kuò)增電泳圖:1.GUS500的擴(kuò)增片段；B.GUS500-pEASY T1酶切鑒定結(jié)果:1.GUS500-pEASY T1質(zhì)粒載體經(jīng)過(guò)EcoR Ⅰ單酶切鑒定圖譜。

M．DL5000 molecular weight marker; A.PCR amplification result ofGUS500fragment: 1.Amplified fragment ofGUS; B.Enzyme digestion result ofGUS500-pEASY T1: 1.Result ofGUS500-pEASY T1 vector after digestion withEcoR Ⅰ.

圖3GUS500片段的PCR擴(kuò)增與鑒定結(jié)果
Fig.3 PCR amplification and identificationresults ofGUS500fragment

圖4 dsWRKY76 pENTR L16干擾載體的構(gòu)建Fig.4 Construction of RNAi vector for dsWRKY76 pENTR L16

M.DL5000分子量標(biāo)記；1,2.dsWRKY76pENTR L16經(jīng)EcoR Ⅰ和PstⅠ酶切后產(chǎn)生的2 628，500,300 bp大小的片段.

M.The molecular weight marker of DL5000; 1,2.The 2 628,500，300 bp fragments ofdsWRKY76pENTR L16 after digestion withEcoR Ⅰ andPstⅠ, respectively.

圖5dsWRKY76pENTR L16酶切鑒定圖譜
Fig.5 Enzyme digestion result ofdsWRKY76pENTR L16

利用Gateway重組技術(shù)，將dsWRKY76pENTR L16中的插入片段重組到誘導(dǎo)型雙元載體GVG-TA7002和組成型雙元載體Ubi-C1300中，用SpeⅠ和XhoⅠ對(duì)dsWRKY76-GVG-TA7002進(jìn)行雙酶切鑒定；用PstⅠ對(duì)dsWRKY76-Ubi-C1300進(jìn)行酶切鑒定。結(jié)果見(jiàn)圖6，重組質(zhì)粒dsWRKY76-GVG-TA7002酶切后產(chǎn)生2條帶,1條為GVG-TA7002載體片段，大小為10 kb，由于WRKY76序列中在170 bp左右有XhoⅠ的酶切位點(diǎn)，所以產(chǎn)生第2條帶大小約為800 bp。重組質(zhì)粒dsWRKY76-Ubi-C1300酶切后產(chǎn)生3條帶，第1條為Ubi-C1300載體片段，Ubi-C1300載體在2 kb處有PstⅠ酶切位點(diǎn)，所以產(chǎn)生了第2條帶，大小約為2 kb，第3條帶為dsWRKY76片段，大小約為1 kb。說(shuō)明2種載體都構(gòu)建成功。

M.DL10000分子量標(biāo)記；1.未經(jīng)酶切的WRKY76-GVG-TA7002質(zhì)粒；2.酶切后的WRKY76-GVG-TA7002；3.未經(jīng)酶切的WRKY76-Ubi-C1300；4.酶切后的WRKY76-Ubi-C1300。

M.The molecular weight marker of DL10000; 1.WRKY76-GVG-TA7002 plasmid; 2.WRKY76-GVG-TA7002 after enzyme digestion; 3.WRKY76-Ubi-C1300 plasmid; 4.WRKY76-Ubi-C1300 after enzyme digestion.

圖6WRKY76-GVG-TA7002和WRKY76-Ubi-C1300酶切鑒定圖譜
Fig.6 Enzyme digestion results ofWRKY76- GVG-TA7002 andWRKY76-Ubi-C1300

2.5 OsWRKY76沉默株系的獲得

將WRKY76-GVG-TA7002轉(zhuǎn)化水稻，得到7個(gè)轉(zhuǎn)化株系，對(duì)其進(jìn)行OsWRKY76基因表達(dá)水平檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖7)，其中dsWRKY76-2和dsWRKY76-7株系中OsWRKY76的表達(dá)量與未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照相比具有顯著差異，表達(dá)量分別為對(duì)照組的16.2%,20.2%，表明成功獲得了2個(gè)沉默株系。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。 Lowercase letters indicate significant difference(P<0.05).

3 討論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物防御病原體的攻擊中起到了非常重要的作用。在對(duì)水稻白葉枯病菌Xoo(Xanthomonasoryzaepv.)的免疫應(yīng)答中，OsWRKY45和OsWRKY72能夠直接結(jié)合SRWD1(Salt responsive WD40 protein 1)的啟動(dòng)子W-box，并分別通過(guò)與DELLA SLR1蛋白的相互作用激活或抑制SRWD1，調(diào)節(jié)水稻對(duì)Xoo病原菌的抗性[11]。OsWRKY68可以直接結(jié)合PR1bW-box啟動(dòng)子來(lái)促進(jìn)免疫應(yīng)答[12]。過(guò)表達(dá)OsWRKY51可增強(qiáng)對(duì)Xoo的抗性[13]。在稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)感染下，OsWRKY13和OsWRKY45-2通過(guò)與其啟動(dòng)子W-box和類W-box序列結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)彼此的表達(dá)以應(yīng)對(duì)生物脅迫[14]。過(guò)量表達(dá)OsWRKY67可以增強(qiáng)對(duì)葉瘟(Leaf blast)、穗瘟(Panicle blast)和細(xì)菌性枯萎病(Bacterial blight)的抗病性[15]。水稻中的OsNH3(NPR1 homologue 3)是系統(tǒng)獲得抗性中的關(guān)鍵因子NPR1的旁系同源物，過(guò)量表達(dá)OsNH3可以大幅提高PR基因的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)水稻白葉枯病Xoo的抗性[16-17]。對(duì)于OsWRKY76是否直接與OsNH3結(jié)合，激活相關(guān)抗病基因的表達(dá)，還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

大多數(shù)關(guān)于WRKY家族的研究中，較常用的手段是構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植株，得到過(guò)表達(dá)植株進(jìn)行研究，如辣椒CaWRKY1過(guò)表達(dá)可加速超敏反應(yīng)[18]；棉花GhWRKY15在煙草中過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)對(duì)真菌以及病毒的抗性[19]；將楊樹(shù)的PtrWRKY73在白楊中過(guò)表達(dá)可提高對(duì)黑斑病菌(M.brunneaf.sp.multigermtubi)的抗性[20]；過(guò)表達(dá)OsWRKY76可導(dǎo)致對(duì)稻瘟病的易感性急劇增加，對(duì)冷脅迫的耐受性提高[21]。對(duì)于利用RNA干擾技術(shù)驗(yàn)證WRKY相關(guān)功能的試驗(yàn)卻鮮有報(bào)道。

RNAi作為反向遺傳學(xué)研究的一種手段，有著特異的機(jī)制和簡(jiǎn)單的試驗(yàn)操作過(guò)程，在多個(gè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[22]。本研究在構(gòu)建RNAi載體時(shí)選用了組成型表達(dá)和誘導(dǎo)型表達(dá)2種不同的載體，用組成型表達(dá)的載體將會(huì)持續(xù)沉默相關(guān)基因，若此基因?yàn)樯L(zhǎng)發(fā)育所必需，則一般情況下不容易得到轉(zhuǎn)化沉默植株。因此，筆者又同時(shí)構(gòu)建了誘導(dǎo)型表達(dá)的載體，只有用誘導(dǎo)物處理后才會(huì)誘導(dǎo)相關(guān)基因的沉默。因誘導(dǎo)物具有高度專一性，可以人為調(diào)控基因的表達(dá)狀態(tài)，并且對(duì)植物本身來(lái)說(shuō)是低毒或無(wú)毒的[23]，能夠比較容易地獲得轉(zhuǎn)化沉默株系。在本研究中，通過(guò)RNA干擾技術(shù)獲得了OsWRKY76的誘導(dǎo)型沉默株系，為進(jìn)一步研究該基因是否參與調(diào)控系統(tǒng)獲得抗性提供了前期基礎(chǔ)。