魏愛民，姚 堯，劉 楠，車?yán)杳?，魏盼盼，韓毅科，陳正武，杜勝利

(1.天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司黃瓜研究所 蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市蔬菜研究中心，天津 300192； 2.南開大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071)

單倍體技術(shù)是現(xiàn)代商業(yè)化育種的重要手段之一，對作物遺傳育種具有重要意義[1]。黃瓜未受精子房培養(yǎng)是獲得單(雙單)倍體植株的重要途徑，已在育種實(shí)踐中規(guī)模化應(yīng)用，但在應(yīng)用中存在基因型差異大、胚胎誘導(dǎo)率及植株再生率較低的問題。研究黃瓜未受精子房培養(yǎng)(離體雌核發(fā)育)胚胎發(fā)育的分子機(jī)制，獲得黃瓜未受精子房培養(yǎng)胚胎發(fā)育的關(guān)鍵基因，可以為進(jìn)一步優(yōu)化完善黃瓜未受精子房培養(yǎng)技術(shù)提供理論依據(jù)。有關(guān)黃瓜未受精子房培養(yǎng)的研究報(bào)道，較多圍繞基因型、激素種類及濃度、培養(yǎng)方法等影響因素對黃瓜離體雌核胚胎發(fā)育的影響，旨在建立相應(yīng)的培養(yǎng)技術(shù)體系。波蘭學(xué)者Gémes-Juhász等[2]對6種不同基因型的黃瓜進(jìn)行了取材時(shí)期和預(yù)處理方式的研究，發(fā)現(xiàn)熱處理可以提高最適發(fā)育階段雌核發(fā)育的頻率，最高單倍體植株再生頻率為7.1%。杜勝利等[3]通過對子房大小、激素種類及濃度等影響因素進(jìn)行系統(tǒng)研究，成功研制華北刺瘤型黃瓜未受精子房培養(yǎng)技術(shù)，已規(guī)模化應(yīng)用。王燁等[4]通過黃瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)獲得單倍體植株。有關(guān)黃瓜未受精子房培養(yǎng)胚胎發(fā)育分子機(jī)制研究較少：杜勝利等[5]在雌核發(fā)育與非雌核發(fā)育過程中，未受精子房培養(yǎng)早期POD酶活性急劇上升，IAA和ABA含量明顯下降[5]；Wei等[6]對不同基因型多胺含量變化進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)離體雌核發(fā)育高頻材料游離態(tài)spd+spm、結(jié)合態(tài)spd+spm含量均較高，總多胺含量較高，多胺組分及含量變化是離體雌核發(fā)育啟動(dòng)過程的重要特征；韓毅科等[7]應(yīng)用IEF-SDS-PAGE技術(shù)對雌核發(fā)育早期蛋白表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)11個(gè)特異多肽點(diǎn)，其可能在胚胎啟動(dòng)階段對細(xì)胞功能或組織的形態(tài)建成起重要作用。應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片，從轉(zhuǎn)錄組水平研究黃瓜未受精子房培養(yǎng)胚胎發(fā)育早期基因表達(dá)，揭示黃瓜離體雌核發(fā)育的分子機(jī)制，相關(guān)研究內(nèi)容未見報(bào)道。本研究應(yīng)用黃瓜未受精子房培養(yǎng)胚胎發(fā)育高頻基因型材料與低頻基因型材料，分別提取胚珠部位總RNA，采用基因芯片方法，從基因表達(dá)方面研究與黃瓜未受精子房培養(yǎng)胚胎發(fā)育早期緊密相關(guān)的基因，揭示黃瓜離體雌核胚胎發(fā)育機(jī)制，為進(jìn)一步優(yōu)化提高黃瓜未受精子房培養(yǎng)技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以未受精子房培養(yǎng)過程中胚胎發(fā)生率差異篩選極端材料：高頻基因型材料W7(未受精子房離體培養(yǎng)胚胎發(fā)生率為50%，華北刺瘤類型材料)和低頻基因型材料D03-3(未受精子房離體培養(yǎng)胚胎發(fā)生率為0，荷蘭光滑型材料)為供體材料，進(jìn)行未受精子房培養(yǎng)。

1.2 黃瓜未受精子房的離體培養(yǎng)與胚珠剝離

采集開花前1～2 d的黃瓜雌花，去掉果柄和花冠，75%乙醇和次氯酸鈉溶液對子房表面進(jìn)行滅菌，子房橫/縱切后，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于25 ℃培養(yǎng)室、光照/黑暗16 h/8 h條件下培養(yǎng)。在培養(yǎng)的0，2，4，6 d，在體式顯微鏡下分別剝?nèi)〔煌蛐筒牧系呐咧?，放?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA提取

采用TRIzol法提取總RNA。取混合材料約100 mg，在裝有液氮的研缽中并于冰上研磨，加入1 mL TRIzol繼續(xù)研磨，待TRIzol融化后振蕩并離心；取上清液加入氯仿，振蕩、靜置、離心；取上清液加入等體積的高鹽和異丙醇，混勻離心；吸出殘液，75%乙醇洗滌沉淀，再用RNase-free水溶解沉淀；加入DNaseⅠ、RRI等置于37 ℃水浴鍋中30 min；加入氯仿、水飽和酚反復(fù)抽提2次；取上清液加入醋酸鈉、無水乙醇沉淀置于-20 ℃冰箱沉淀過夜；次日，用75%乙醇洗滌沉淀，再用RNase-free水溶解沉淀備用。

1.4 基因芯片雜交及數(shù)據(jù)分析

1.4.1 基因芯片雜交 以高頻基因型W7為材料，分別剝?nèi)∥词芫臃颗囵B(yǎng)0，2，4，6 d的胚珠，提取總RNA，每一時(shí)期隨機(jī)選擇20個(gè)子房，基因表達(dá)譜所用芯片為定制的規(guī)格為12×135 K的 ArrayRoche NimbleGen芯片，芯片探針的標(biāo)準(zhǔn)長度為60 mer，依據(jù)美國能源部在Phytozome網(wǎng)站上公布的基因序列設(shè)計(jì)。芯片雜交試驗(yàn)及數(shù)據(jù)處理由北京博奧生物技術(shù)有限公司完成主要雜交過程如下：

①用 RNA clean-up試劑對各樣品總RNA進(jìn)行過柱純化，用分光光度計(jì)定量，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢；②用SuperScriptⅡ 反轉(zhuǎn)錄酶將總RNA反轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的單鏈cDNA，并在DNase Polymerase Ⅰ的作用下合成雙鏈DNA；③以cDNA為模板，利用T7 Enzyme Mix體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA，然后純化定量；④取5 μg cRNA，用CbcScript酶，Random Primer 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用PCR NucleoSpin Extract Ⅱ Kit(MN) 純化；⑤取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以Random Primer 為引物進(jìn)行Klenow 酶標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物用PCR NucleoSpin Extract Ⅱ Kit(MN) 純化；⑥將標(biāo)記好的樣品與雜交Buffer(3×SSC，0.2%SDS，50×Denhart′s，25%甲酰胺)混勻后，注到已經(jīng)與相應(yīng)mixer黏合的芯片上，采用Roche NimbleGen Hybridization System 12 雜交儀42 ℃雜交14～16 h。雜交結(jié)束后，去除mixer，分別用不同洗液清洗芯片，甩干，掃描；⑦使用Roche-NimbleGen MS200掃描儀掃描芯片；采用NimbleScan進(jìn)行圖像分析，將圖像信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。

1.4.2 數(shù)據(jù)分析 差異基因表達(dá)分析采用SAM軟件，對相鄰離體培養(yǎng)時(shí)期差異基因數(shù)量進(jìn)行兩兩對比分析，① 離體培養(yǎng)2 d(試驗(yàn)組UP2)和離體培養(yǎng) 0 d(對照組UP0)，以下表示方法相同；② UP4和 UP2；③ UP6和 UP4。

差異基因篩選采用倍數(shù)變化比較，倍數(shù)計(jì)算以離體培養(yǎng)0 d為起點(diǎn)，將3個(gè)不同培養(yǎng)時(shí)期基因表達(dá)量作兩兩對比(即UP2和 UP0， UP4和 UP2， UP6和 UP4)分析，分別得出倍數(shù)(Ratio)變化，數(shù)據(jù)經(jīng)log2處理，分析3組之間的倍數(shù)變化及變化模式。

差異基因的富集分析應(yīng)用在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行，差異基因功能注釋參照擬南芥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、GenBank中非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫以及Phytozome網(wǎng)站。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量分析

分別提取高頻基因型和低頻基因型材料4個(gè)離體培養(yǎng)時(shí)期未受精子房胚珠總RNA，在MLV-RTase和引物Oligo(dT)的作用下合成單鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄程序采用二步法，反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 5 min，25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，80 ℃ 20 min，所用PCR儀為Bio-Rad S1000。qPCR采用20 μL體系，反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，58～60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線溫度為：55～95 ℃ 10 s，81個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)選擇TUA作為內(nèi)參基因。qPCR引物設(shè)計(jì)使用軟件Primer primer 5.0，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。qPCR儀為Bio-Rad CFX connect。每個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。qPCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，對得到的2-ΔΔCt數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜離體雌核發(fā)育轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因分析

應(yīng)用基因芯片對26 147個(gè)基因的表達(dá)量進(jìn)行測定，應(yīng)用SAM軟件對相鄰離體培養(yǎng)時(shí)期基因表達(dá)量進(jìn)行差異分析，基因表達(dá)量的對比分析采用倍數(shù)(Ratio)關(guān)系表示，上調(diào)基因?yàn)镽atio≥2，表達(dá)量差異大于2倍，試驗(yàn)組的表達(dá)量高于對照組；下調(diào)基因?yàn)镽atio≤0.5，即表達(dá)量差異大于2倍，試驗(yàn)組的表達(dá)量小于對照組；無差異表達(dá)基因?yàn)?.5≤Ratio≤2。共有8 858個(gè)基因發(fā)生了差異變化，其中上調(diào)表達(dá)基因4 366個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因4 492個(gè)。

UP2 vs UP0 差異基因數(shù)目為5 760個(gè)，無差異基因數(shù)目為20 387個(gè)；UP4 vs UP2 差異基因數(shù)目為2 405個(gè)，無差異基因數(shù)目為23 472個(gè)；UP6 vs UP4 差異基因數(shù)目為693個(gè)，無差異基因數(shù)目為25 454個(gè)。對每一組差異表達(dá)的基因數(shù)量根據(jù)上調(diào)表達(dá)與下調(diào)表達(dá)進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，如圖1所示。

圖1 不同離體培養(yǎng)時(shí)期兩兩對比 的差異表達(dá)基因數(shù)目比較Fig.1 Number comparison of differentially expressed genes among different stages of culture

對3組差異分析數(shù)據(jù)中所有的上調(diào)表達(dá)基因和下調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行維恩圖解，由圖2可以看出，在所有上調(diào)基因中，有2 644，1 135，205個(gè)基因分別在某一個(gè)離體培養(yǎng)時(shí)期特異表達(dá)；有51，65，63個(gè)基因分別在某2個(gè)離體培養(yǎng)時(shí)期特異表達(dá)；有8個(gè)基因在連續(xù)3個(gè)離體培養(yǎng)時(shí)期特異表達(dá)。在所有的下調(diào)基因中，有2 805，1 062，171個(gè)基因分別在某一個(gè)離體培養(yǎng)時(shí)期特異表達(dá)；有45，39，140個(gè)分別在某2個(gè)離體培養(yǎng)時(shí)期特異表達(dá)；有2個(gè)基因在連續(xù)3個(gè)離體培養(yǎng)時(shí)期特異表達(dá)。

8個(gè)連續(xù)上調(diào)的基因，其功能主要包括白細(xì)胞介素-1受體激酶、大亞基核糖體蛋白、木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、水通道蛋白、細(xì)胞色素P450、三磷酸酶、過氧化物酶等，涉及的主要代謝途徑有嘌呤代謝，苯丙氨酸代謝，物質(zhì)跨膜運(yùn)輸、細(xì)胞凋亡、Toll-like信號(hào)代謝通路、苯并惡嗪類物質(zhì)合成等。

2.2 差異表達(dá)基因的GO功能注釋及分類

2.2.1 所有差異表達(dá)基因的GO功能注釋及分類 對所有的差異表達(dá)基因做了GO功能注釋和分類統(tǒng)計(jì)，生物過程一類共有2 263個(gè)差異表達(dá)基因被注釋上了GO功能，進(jìn)一步對所有被注釋上GO生物過程功能的差異基因進(jìn)行了分類(圖3)。涉及物質(zhì)運(yùn)輸、磷酸化與脫磷酸化代謝過程差異表達(dá)基因最多；其次為響應(yīng)刺激類的差異表達(dá)基因，占13%，主要包括響應(yīng)信號(hào)、物質(zhì)刺激的差異表達(dá)基因，約占6%，響應(yīng)脅迫刺激的差異表達(dá)基因，約占4%，響應(yīng)激素刺激的差異表達(dá)基因，約占3%。這幾類刺激的響應(yīng)有可能是關(guān)系到黃瓜離體雌核發(fā)育過程中的重要途徑，是影響離體雌核胚胎發(fā)育的關(guān)鍵因素。

A表示3組中所有上調(diào)基因在不同離體培養(yǎng)時(shí)期的數(shù)目；B表示所有下調(diào)基因在不同離體培養(yǎng)時(shí)期的數(shù)目。 A indicates the number of up regulated genes among groups of different stages of culture; B indicates the number of down regulated genes among groups of different stages of culture.

圖3 差異表達(dá)基因生物過程GO功能分類Fig.3 GO functional analysis of differentially expressed genes

2.2.2 激素相關(guān)的差異表達(dá)基因的GO功能注釋及分類 進(jìn)一步對與激素相關(guān)的116個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行分類分析(圖4)，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)脫落酸刺激的基因最多，占24.1%，其次是參與生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的差異表達(dá)基因占20.7%，而響應(yīng)生長素刺激、水楊酸刺激以及其他激素刺激的差異表達(dá)基因也比較多。表明這些差異表達(dá)基因在黃瓜離體雌核發(fā)育的不同時(shí)期發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

圖4 激素相關(guān)的差異表達(dá)基因的GO功能分類Fig.4 GO functional analysis of hormone related differentially expressed genes

2.2.3 激素代謝途徑相關(guān)的差異基因代謝通路富集分析 針對激素相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行了代謝通路富集分析(圖5)，找出了2條與激素相關(guān)的代謝路徑，即植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和玉米素合成途徑。其中植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其合成、細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、乙烯合成、水楊酸及茉莉酸代謝和植物激素油菜類內(nèi)酯的代謝等途徑，而玉米素合成途徑涉及萜類化合物的生物合成，參與其代謝途徑的差異表達(dá)基因大多涉及相關(guān)糖代謝中反應(yīng)酶，如脫氫酶、轉(zhuǎn)移酶等。

圖5 激素代謝途徑差異表達(dá)基因KEGG Pathway分析圖Fig.5 KEGG Pathway analysis of differentially expressed hormone metabolism genes

從3個(gè)方面對黃瓜離體雌核發(fā)育早期差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析和篩選：①所有上調(diào)基因的維恩圖解中，篩選出連續(xù)在3個(gè)不同離體培養(yǎng)時(shí)期都上調(diào)表達(dá)的8個(gè)差異基因；②從響應(yīng)刺激類相關(guān)的差異表達(dá)基因中，分析并篩選了與響應(yīng)激素刺激相關(guān)的差異表達(dá)基因116個(gè)，與響應(yīng)脅迫刺激相關(guān)的差異表達(dá)基因194個(gè)，與響應(yīng)信號(hào)及物質(zhì)刺激的差異表達(dá)基因88個(gè)；③還有針對性的研究了GO生物過程中與胚胎發(fā)育有特異性關(guān)系的50個(gè)差異表達(dá)基因。共篩選出456個(gè)差異表達(dá)基因。

2.3 倍數(shù)變化模式角度進(jìn)一步分析差異表達(dá)基因

黃瓜離體雌核發(fā)育在培養(yǎng)的前6 d已經(jīng)啟動(dòng)，在此階段重點(diǎn)關(guān)注兩類基因：基因表達(dá)倍數(shù)變化總體成上調(diào)趨勢；無顯著差異表達(dá)基因中有重要功能的基因。UP6 和 UP0這2組對比后的倍數(shù)經(jīng)log2處理后，篩選出其倍數(shù)(Ratio)大于0的所有差異表達(dá)基因，此次篩選從456個(gè)差異表達(dá)基因中共得到192個(gè)差異表達(dá)基因，且在第6天時(shí)基因的表達(dá)與0 d相比呈上調(diào)趨勢。對這192個(gè)差異表達(dá)基因的倍數(shù)變化模式進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，共得出8種變化模式，如圖6差異表達(dá)基因的倍數(shù)變化可劃分為以下3種：

存在明顯拐點(diǎn)：模式圖type A、type B、 type E、 type F，其中type A、type E差異表達(dá)基因倍數(shù)變化為先上升再下降，type B、type F差異表達(dá)基因倍數(shù)變化呈現(xiàn)先下降再上升。無明顯拐點(diǎn)：模式圖type C、type D、 type G，其中type C差異表達(dá)基因倍數(shù)變化呈上升趨勢，type D、type G差異表達(dá)基因倍數(shù)變化呈下降趨勢。倍數(shù)變化不大：模式圖type H，即在不同培養(yǎng)時(shí)期基因表達(dá)量變化無顯著差異。

與離體培養(yǎng)0 d的基因表達(dá)相比，模式圖type A、type B、type C在某單個(gè)離體培養(yǎng)時(shí)期上調(diào)表達(dá)的基因；模式圖type D、type E、type F在某2個(gè)培養(yǎng)時(shí)期上調(diào)表達(dá)的基因；模式圖type G在連續(xù)3個(gè)培養(yǎng)時(shí)期都上調(diào)表達(dá)的基因；模式圖type H無顯著差異表達(dá)的基因。

根據(jù)基因表達(dá)倍數(shù)變化分類圖，以及重點(diǎn)挑選上調(diào)表達(dá)顯著的基因以及無顯著差異表達(dá)基因中有重要功能的基因，做進(jìn)一步表達(dá)分析，最終確定了47個(gè)基因，見表1。

圖6 差異表達(dá)基因的倍數(shù)變化模式圖Fig.6 Variation pattern of magnification ratio of differential expressed genes

表1 篩選出的各類差異表達(dá)基因Tab.1 Selected deferentially expressed genes of different types

表中所列基因主要為：激素相關(guān)基因，主要包括玉米素合成途徑中的細(xì)胞分裂素脫氫酶、細(xì)胞分裂素羥化酶相關(guān)基因，與脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的脫落酸受體蛋白相關(guān)基因，乙烯合成途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶-ACC合酶相關(guān)基因以及與生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的生長素信號(hào)蛋白及生長素運(yùn)輸?shù)鞍子嘘P(guān)的基因等；編碼轉(zhuǎn)錄因子，主要包括2個(gè)MYC2家族成員；其他酶類，包括與生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的絲氨酸蘇氨酸激酶，與氧化脅迫相關(guān)的過氧化物酶以及相關(guān)代謝中的轉(zhuǎn)移酶、聚合酶類；離子通道蛋白、水通道蛋白等。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量分析

2.4.1 總RNA提取 從上述47個(gè)基因中挑選了與激素、響應(yīng)脅迫、響應(yīng)信號(hào)刺激、胚胎發(fā)育等相關(guān)的22個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證。以離體雌核發(fā)育高頻、低頻基因型材料為供體材料，分別在培養(yǎng)0，2，4，6 d時(shí)剝?nèi)∨咧檫M(jìn)行總RNA提取。RNA提取的電泳結(jié)果如圖7，從電泳圖中可以看出，8個(gè)樣品的RNA中28S的亮度約為18S的2倍，且條帶清晰無明顯拖尾和彌散，其質(zhì)量和完整性較好，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.4.2 數(shù)據(jù)驗(yàn)證 本次試驗(yàn)總共對22個(gè)相關(guān)基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證，從中篩選出不同離體培養(yǎng)時(shí)期高頻型和低頻型在倍率變化上有較大差異的8個(gè)基因。如圖8所示，8個(gè)基因在離體培養(yǎng)2，4，6 d與0 d對比后的芯片數(shù)據(jù)與qPCR數(shù)據(jù)的對比結(jié)果。

從左至右分別為高頻型0，2，4，6 d，低頻型0，2，4，6 d。 From left to right indicates RNA from ovules of 0, 2,4 and 6 d of culture both high and low efficiency genotypes respectively.

圖8 芯片數(shù)據(jù)與qPCR數(shù)據(jù)對比驗(yàn)證結(jié)果Fig.8 Contrast test on the qPCR results with chip data

所選出的8個(gè)基因整體都呈上調(diào)表達(dá)趨勢，與相應(yīng)天數(shù)的芯片數(shù)據(jù)對比顯示，qPCR數(shù)據(jù)與芯片數(shù)據(jù)的基因倍數(shù)變化趨勢基本一致，說明芯片數(shù)據(jù)結(jié)果真實(shí)有效。

2.4.3 差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量分析 對篩選出的8個(gè)關(guān)鍵基因，分別以高、低頻基因型為材料，進(jìn)行未受精子房胚珠部位不同培養(yǎng)時(shí)期的差異表達(dá)分析。采用離體培養(yǎng)2，4，6 d與0 d對比后的qPCR倍數(shù)變化進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)log2處理，見圖9。

從圖中可以看出：與激素相關(guān)的3個(gè)基因Cucsa.255650.1、Cucsa.063630.1、Cucsa.155270.1在高頻型和低頻型之間有較大差異?；駽ucsa.255650.1與響應(yīng)茉莉酸、水楊酸和脫落酸刺激有關(guān)，其在高頻型胚珠中的表達(dá)量總體上升，而在低頻型中除在4 d時(shí)有所上升外，在2,6 d均為下降，并且總體呈下降趨勢。Cucsa.063630.1表達(dá)產(chǎn)物是一種與植物生長素誘導(dǎo)相關(guān)的蛋白，其在高頻型中也是呈總體上升的趨勢，與低頻型的主要差異是在第6天。Cucsa.155270.1與玉米素合成途徑相關(guān)，其主要表達(dá)產(chǎn)物是細(xì)胞分裂素脫氫酶，其在高頻型中一直處于高量表達(dá)，而在低頻型中呈逐漸下降的趨勢。與POD酶相關(guān)的基因有2個(gè)，分別是Cucsa.153420.1和Cucsa.153430.1。結(jié)果顯示，這2種基因在高頻型離體培養(yǎng)的前6 d表達(dá)量都比較高，尤其在前2 d的表達(dá)量急劇上升，而在低頻型中呈下調(diào)表達(dá)或表達(dá)量低。另外KEGG通路分析顯示，這2種酶還參與了苯丙氨酸代謝途徑、甲烷代謝途徑、苯丙素合成途徑，GO分子功能還表明其參與亞鐵血紅素結(jié)合以及金屬離子的結(jié)合。另外3個(gè)相關(guān)基因：Cucsa.193180.1基因在高頻型中前6 d連續(xù)上調(diào)表達(dá)，而在低頻型中第6天下調(diào)表達(dá)，此基因?yàn)樗ǖ赖鞍譔IP家族的NIP Ⅱ亞家族基因NIP 5-1，GO生物過程功能顯示其主要響應(yīng)含硼酸鹽、亞砷酸鹽等含硼、砷物質(zhì)。Cucsa.058080.1基因在高頻型前6 d中連續(xù)上調(diào)表達(dá)，而在低頻型中第6天呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，此基因與蘇氨酸-絲氨酸蛋白激酶(STK)相關(guān)。Cucsa.141570.1基因在高頻型的前6 d上調(diào)表達(dá)，而低頻型中除第4天上調(diào)表達(dá)外，第2天和第6天均為下調(diào)表達(dá)，總體上為下調(diào)表達(dá)，此基因主要參與機(jī)械敏感性離子通道過程，與感受和傳遞細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)有關(guān)。

縱坐標(biāo)大于0代表基因上調(diào)表達(dá)，縱坐標(biāo)小于0代表基因下調(diào)表達(dá)。 Longitudinal axis value greater than 0 indicates gene up regulation whereas longitudinal axis value less than 0 indicates gene down regulation.

3 結(jié)論與討論

本研究以黃瓜未受精子房培養(yǎng)高頻基因型與低頻基因型胚珠部位為材料，進(jìn)行離體雌核發(fā)育早期基因的表達(dá)差異研究，獲得早期差異表達(dá)基因8 858個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因4 366個(gè)，被注釋上GO生物過程功能的差異基因2 263個(gè)，主要涉及物質(zhì)運(yùn)輸、磷酸化與脫磷酸化等代謝過程，說明離體雌核胚胎發(fā)育過程與體細(xì)胞胚胎發(fā)育過程類似，需要糖、蛋白、核酸等物質(zhì)參與，胚胎建成過程中與細(xì)胞功能、組織形態(tài)建成及生理生化密切相關(guān)[8]。

體細(xì)胞胚胎發(fā)生被認(rèn)為是研究植物早期發(fā)育調(diào)控和形態(tài)發(fā)生的模式系統(tǒng)，已通過胡蘿卜、紫花苜蓿、菊苣、松柏等體外培養(yǎng)體系對體細(xì)胞胚發(fā)生途徑的分子發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了深入研究，鑒定了在體細(xì)胞胚發(fā)生不同階段表達(dá)的基因，主要包括響應(yīng)脅迫應(yīng)答基因(熱激蛋白基因[9-10]、抗氧化酶類[11-12])、響應(yīng)激素刺激基因(受生長素調(diào)控的基因[13]、ABA誘導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)基因[14-17])、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因(鈣調(diào)素蛋白[18]、蛋白激酶[19-20]、應(yīng)答激酶[21-23])等。植物游離小孢子培養(yǎng)在農(nóng)作物單倍體育種中已成為研究的熱點(diǎn)之一，研究者從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、代謝組分及分子水平對小孢子胚胎發(fā)生的機(jī)制進(jìn)行了研究，分離鑒定了多個(gè)與胚胎發(fā)育相關(guān)的基因，主要包括在胚性小孢子時(shí)期表達(dá)的基因，EcMt[24]、NtEPc[25]、熱激蛋白基因[26]等；多細(xì)胞結(jié)構(gòu)過程中表達(dá)的基因，BBM[27]、AGL15[28]、SERK[29]等。

本研究重點(diǎn)針對響應(yīng)激素刺激、脅迫應(yīng)答、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選。篩選出的重要基因包含：生長素和細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)合成相關(guān)的2個(gè)基因Cucsa.063630.1和Cucsa.155270.1，在離體培養(yǎng)過程中在高頻型胚珠中表達(dá)量高，呈總體上升的趨勢，而在低頻型胚珠中表達(dá)量低，基本呈下降趨勢，推測其可能為黃瓜離體雌核早期胚胎發(fā)育中與激素代謝相關(guān)的重要基因。

參與過氧化物酶表達(dá)的2個(gè)基因，其在前6 d處于上調(diào)表達(dá)，而且在離體培養(yǎng)的第2天表達(dá)量急劇升高，代謝通路分析顯示這2個(gè)基因參與苯丙氨酸代謝途徑、甲烷途徑以及苯丙素合成途徑。這幾類代謝過程是植物代謝中的次生代謝，其產(chǎn)物是細(xì)胞生命活動(dòng)或植物生長發(fā)育正常運(yùn)行的非必需的小分子化合物，苯丙氨酸代謝途徑中的限速酶苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PAL)研究較早、較多，在植物響應(yīng)機(jī)械損傷過程中誘導(dǎo)表達(dá)，切口部位PAL活性增加、切口褐化，激素刺激也可誘導(dǎo)其表達(dá)[26]。本研究中參與苯丙氨酸代謝途徑的基因在胚胎發(fā)育早期高表達(dá)，推測其與機(jī)械損傷及激素誘導(dǎo)有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)與水通道蛋白相關(guān)的基因，屬于NIP家族成員。研究表明，NIPⅡ家族中的AtNIP 5；1和AtNIP6；1具有運(yùn)輸硼的功能[30-31]。推測本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的NIP基因可能與含硼物質(zhì)的運(yùn)輸有關(guān)。在植物代謝方面，硼作為生長素調(diào)節(jié)的輔助因子，對生長素代謝途徑有一定影響[32]。此基因在黃瓜離體雌核發(fā)育的早期過程中表達(dá)活躍，可能與胚胎發(fā)育過程中含硼物質(zhì)參與細(xì)胞組分構(gòu)建、相關(guān)激素代謝以及抵抗脅迫環(huán)境等因素有關(guān)。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)一個(gè)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)育受體蛋白激酶類基因，為受體蘇氨酸-絲氨酸蛋白酶(STK)類基因。此類蛋白激酶的一個(gè)關(guān)鍵作用就是參與抵抗外界環(huán)境脅迫，如低溫、干燥、鹽脅迫等[33]。除此之外，在擬南芥的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了20多個(gè)與STK相關(guān)的基因，不僅參與脅迫環(huán)境應(yīng)答，還響應(yīng)脫落酸、水楊酸等激素刺激相關(guān)的代謝[34]。此基因在高頻型前6 d中一直呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，而低頻型在第6天則呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，因此，推測此基因在胚胎發(fā)育早期過程中，參與STK對外界脅迫的應(yīng)答方面有一定聯(lián)系。

本研究篩選到的重要基因還包含與蛋白質(zhì)的合成、磷酸化等相關(guān)基因：Cucsa.058850.10為線粒體3-羥基異丁?；?CoA水解酶、Cucsa.063630.1為大亞基核糖體蛋白L15e、Cucsa.302870.1為三磷酸酶基因；與淀粉合成相關(guān)基因：Cucsa.112800.1為木葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、與細(xì)胞分裂相關(guān)基因Cucsa.273170.1為黏連蛋白SCC2、與病原體相關(guān)蛋白Cucsa.218880.1。在對不同作物游離小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生的分子機(jī)理研究中，均有同類基因被發(fā)現(xiàn)，這些基因與小孢子胚胎發(fā)生中蛋白質(zhì)降解、淀粉合成、啟動(dòng)孢子體途徑的細(xì)胞分裂等過程相關(guān)。