李魯華 任明見 徐如宏

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 貴陽 550025； 2.國家小麥改良中心貴州分中心， 貴陽 550025)

紫粒小麥(TriticumaestivumL)是一類果皮中富含花青素而使籽粒呈現(xiàn)紫色的小麥品種[1-2]，具有很高的營養(yǎng)價值，是育種家非常關(guān)注的種質(zhì)資源之一。研究發(fā)現(xiàn)，與紅粒和白粒小麥相比，紫粒小麥具有更高的總酚含量和抗氧化活性[3]；而與普通小麥相比，紫粒小麥富含對人體有益的各種微量元素鈣、鐵、鋅、硒等[4]。此外，許多紫粒小麥品種除籽?？梢苑e累花青素，其他器官如胚芽鞘、莖、葉鞘、葉耳、葉片、花藥等也含有花青素而呈現(xiàn)紫色或紅色[5-6]，可以保護植物免受病原體、食草動物和環(huán)境脅迫的侵害[7]。紫粒小麥中參與花青素生物合成過程的基因可以分為兩大類：調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因。調(diào)控基因主要調(diào)節(jié)花青素合成基因的活性，編碼轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花青素的合成，主要包括MYB、bHLH(MYC)和WD 40三類轉(zhuǎn)錄因子[8]；結(jié)構(gòu)基因主要編碼直接參與花青素合成的酶，包括PAL(苯丙氨酸解氨酶基因)、CHS(查爾酮合成酶基因)、CHI(查爾酮-黃烷酮異構(gòu)酶基因)、F3’H(黃烷酮-3’-羥化酶基因)、F3H(黃烷酮-3-羥化酶)、DFR(二氫黃酮醇-4-還原酶基因)、ANS(花青素苷合成酶基因)和UF3GT(類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶)等[9-10]。

針對紫粒小麥中調(diào)控基因的表達，一些學(xué)者進行了探索。Wang等認為，紫粒小麥中調(diào)控花青素生物合成的調(diào)控基因是編碼 MYB 和 bHLH 的轉(zhuǎn)錄因子[11]；Shoeva等研究發(fā)現(xiàn)，TaPpm1(7 D)(紫色果皮-MYB 1)和TaPpb1(2 AL)(紫色果皮-bHLH 1)能夠調(diào)控紫色籽粒的花青素生物合成[12]；劉澤厚等的研究也表明，TaMYB和TabHLH在所有小麥種子發(fā)育過程中呈現(xiàn)相同的表達模式，在深色小麥中的表達水平要高于淺色小麥[13]。而對于紫粒小麥中結(jié)構(gòu)基因的表達，Shen等指出，CHS和ANS是公認的在花青素合成過程中的重要酶類[14]；Trojan等研究也表明，花青素合成結(jié)構(gòu)基因CHS在花青素積累之前就開始表達，其能夠影響花青素的沉積[15]；Tereshchenko等發(fā)現(xiàn)，ANS在普通小麥有色組織中轉(zhuǎn)錄水平表達量較高[16]。國內(nèi)的一些學(xué)者對紫粒小麥中結(jié)構(gòu)基因的表達也開展了一些研究。李海芬等認為，CHS和ANS與花青素的合成密切相關(guān)，它們在前期表達量較低，在種子充實期(R 3時期)表達量達到最高，而且在種皮顏色較深的花生品種中高表達[17]；劉澤厚等以紫色小麥PI 534284為材料開展研究，發(fā)現(xiàn)CHS和ANS在不同材料中呈現(xiàn)不同的表達模式，總體隨著種子發(fā)育時間而表達量逐步增加[13]；董玉秀研究表明，TaCHS和TaANS在授粉后25 d左右表達量達到最高，隨后表達量下降[18]；徐熙等研究表明，變紫后小麥籽粒中花青素合成基因CHS和ANS的表達水平顯著高于變紫前，推測CHS和ANS可能是貴紫麥1號中籽粒變紫的關(guān)鍵基因[19]。

雖然目前已有不少學(xué)者針對小麥籽粒發(fā)育過程中花青素合成相關(guān)基因的表達調(diào)控進行了一些探索，但對這些調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因的表達模式還缺乏全面和系統(tǒng)的研究。本研究以穎果含有大量花青素的紫粒小麥品種貴紫麥1號材料，利用qRT-PCR(實時熒光定量PCR)技術(shù)分析GzANS、GzCHS、GzMYB-7D1和GzMYC-2A1在籽粒形成過程中的表達情況，旨在為進一步研究紫粒小麥花青素合成及其分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料貴紫麥1號系國家小麥改良中心貴州分中心選育的紫粒小麥品種(審定編號：黔審麥 2015003)，其不僅整粒為紫色，而且在產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性(白粉病、條銹病、赤霉病等)、抗旱耐寒、耐瘠薄等方面均表現(xiàn)出較強的優(yōu)勢[22]。將貴紫麥1號種植于貴州大學(xué)教學(xué)實驗場國家小麥改良中心貴州分中心科研基地。田間管理澆水、除草和施肥等按統(tǒng)一方式進行。

貴紫麥1號于2017年3月25日開花，在開花期選取開花一致的麥穗進行掛牌標(biāo)記并連續(xù)觀察記載。花后第9天開始進行取樣，本次試驗分別采取花后第9、13、22、31天和第39天的籽粒作為不同時期的樣品(圖1)，每日各取不同植株的3個麥穗籽粒進行樣品混合，液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于總RNA提取和花青素的測定。

1.2 總RNA的提取及cDNA鏈的合成

將凍存的新鮮小麥籽粒取出，參照EASYspin Plus Complex Plant RNA Kit(艾德萊)試劑盒的說明書提取不同時期籽粒的總RNA, 提取完成后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性；用NanoDrop 2000 spectrophotometer測定其在260/280 nm的吸光值確定其濃度及純度，并測定OD260/230的值。再根據(jù)TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit gDNA Eraser(艾德萊)試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.3 花青素的提取和含量測定

籽?？偦ㄇ嗨靥崛〖昂繙y定采用Abdel-Aal等[20]的方法并作一定修改。提取方法中酸化乙醇配比采用酸化乙醇溶液(V無水乙醇∶VHCl(1 mol·L-1)= 13∶5)，料液比為1∶8。稱取每個時期的新鮮籽粒0.5 g，用液氮冷凍后研磨成粉末，加入4 mL的75%酸化乙醇與樣品混合均勻, 將裝有料液的EP管平放于振蕩儀中，計算不同時期的花青素含量。式中，ρ為樣品中花青素的質(zhì)量濃度，單位：mg·L-1；v為定容體積，單位：mL；m為測試用樣品質(zhì)量，單位：g。

圖1 不同時期的貴紫麥1號籽粒顏色的變化

振動幅數(shù)≤5 mm，轉(zhuǎn)速1 420 r·min-1，常溫振蕩20 min后，6 000 r·min-1離心6 min，取上清液1 mL稀釋至10 mL，用紫外分光光度計在527 nm處測定吸光度值，每個樣品做3次重復(fù)。將矢車菊3-葡糖苷(Cyanidin 3-glucoside)配置成0，1.0，5.0，10.0，20.0，40.0 mg·L-1和60.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)液，測定吸光值后得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.017 844 5x-0.013 460 4(y為吸光度值；x為濃度，單位 mg·L-1，系數(shù)r2=0.999)。根據(jù)公式

花青素含量(mg·kg-1)=(ρ×v)/m

1.4 實時熒光定量PCR分析

把1.2中反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋成統(tǒng)一質(zhì)量濃度后作為熒光定量PCR的模板，根據(jù)本實驗室貴紫麥1號轉(zhuǎn)錄組測序得到的基因序列，在其高度保守的區(qū)域利用Primer Premier 6.0設(shè)計熒光定量PCR的引物(表1)，引物由上海生物工程股份有限公司合成。采用相對定量方法，以小麥18sRNA為內(nèi)參基因(AY 049040.1)，參照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(TAKARA,Japan)試劑盒的說明書，反應(yīng)體系為；TB Green Premix Ex TaqⅡ 12.5μL，上下游引物各1μL，cDNA模板2μL，加水至終體積25μL。采用2步法反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃變性5 s，53～62.5 ℃退火30 s，40個循環(huán)；3次技術(shù)性重復(fù)，采用2-ΔΔCt分析方法計算基因的相對表達量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS Statistics 22.0軟件中(IBM，USA)的單因素方差分析數(shù)學(xué)模型中的 Duncan方法(p<0.05)進行數(shù)據(jù)分析。利用 Photoshop CS 6軟件和 Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA及cDNA的純度鑒定結(jié)果

采用1%的瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，電泳結(jié)果表明28 s和18 s條帶清晰，說明RNA無降解，完整性較好(圖2)；測量OD260/280、OD260/230的值均在1.8～2.0之間，說明RNA無污染，濃度均在1 000 μg·mL-1左右；反轉(zhuǎn)錄的cDNA用內(nèi)參引物檢測，條帶清晰，可用作熒光定量PCR的模板。

表1 熒光定量PCR引物序列

基因名稱引物序列(5′-3′)退火溫度/℃GzMYB-7D1_F5′-ACGAGCAAGGAGGACGAGA-3′56GzMYB-7D1_R5′-GTGGAGCCTGACGATGAGC-3′56GzMYC-2A1_F5′-GTGCCTATCCGACGACAAC-3′53GzMYC-2A1_R5′-ATCTCAAAACACCCACCCA-3′53GzANS-F5′-GATCAACAGGAGGAGGAG-3′56GzANS-R5′-CCTTCTTCACCACCTTGT-3′56GzCHS-F5′-CAACCGAGCTTTTACAG-3′58GzCHS-R5′-ATCACCATTTGCTTTCC-3′5818S-F5′-TCGGGATCGGAGTAATGA-3′50～62.518S-R5′-TTCGCAGTTGTTCGTCTT-3′50～62.5

圖2 不同時期的總RNA電泳結(jié)果

2.2 籽粒發(fā)育不同時期的花青素含量變化

貴紫麥1號不同發(fā)育時期的籽粒表型變化見圖1，其果皮最初為白色，隨著籽粒的生長發(fā)育而逐漸變綠后變紫。觀察發(fā)現(xiàn)籽粒在花后第22天時變綠且飽滿，在花后第31天時籽粒有一半變紫且在花后第39天時全部變紫。對貴紫麥1號不同時期的籽?；ㄇ嗨剡M行了測定，結(jié)果見圖3。花青素的含量從籽粒還沒變紫就有少量積累，說明籽粒一旦灌漿就不斷開始合成花青素，隨著籽粒顏色不斷變紫而遞增，在花后第31天時花青素的含量迅速上升并在花后第39天時達到最高，這時的花青素含量顯著高于前期的積累量，由此可以看出花青素在籽粒變紫之前的積累是很緩慢的，一旦籽粒變紫花青素的含量則迅速上升。

注：小寫字母代表差異顯著，相同的字母表示差異不顯著，不同的字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。圖3 貴紫麥1號在不同時期的花青素含量變化

2.3 不同時期花青素合成相關(guān)基因的表達分析

2.3.1GzANS和GzCHS基因的表達分析

通過對貴紫麥1號中GzANS和GzCHS在不同時期籽粒的qRT-PCR檢測分析，結(jié)果見圖4。GzANS和GzCHS的相對表達量在不同發(fā)育時期均基本呈現(xiàn)出相同的先升高后降低的變化趨勢，均在花后第22天達到最大值。與花后第9天的相對表達量相比，GzANS在花后第13天提高了0.8倍，花后第22天時提高8倍，花后第31天提高5倍，花后第39天提高1.5倍，說明GzANS在不同時期的相對表達量都有提高，而在花后第22天和第31天的相對表達量顯著高于其他時期。而GzCHS的相對表達量在花后第39天最低，在花后第22天最高；與花后第9天相比，GzCHS在花后第13天的相對表達量提高了0.7倍，第22天提高2.1倍，第31天提高1.2倍，但花后第39天下降了0.1倍。

結(jié)果表明，GzANS和GzCHS的相對表達量變化趨勢一致，但GzCHS的相對表達量比GzANS要低3倍。

2.3.2GzMYB-7D1和GzMYC-2A1的表達分析

通過對貴紫麥1號中GzMYB-7D1和GzMYC-2A1在不同時期的qRT-PCR檢測分析，結(jié)果見圖5。GzMYB-7D1和GzMYC-2A1的相對表達量在不同發(fā)育時期均基本呈現(xiàn)出相同的“上升—下降—再上升—再下降”的變化趨勢。

圖4 GzANS和GzCHS在不同時期的相對表達量

圖5 GzMYB-7D1和GzMYC-2A1在不同時期的相對表達量

GzMYB-7D1的相對表達量在花后第39天時最低，在第31天時最高；與花后第9天的相比，GzMYB-7D1在花后第13天的相對表達量下降了0.6倍，第22天提高0.7倍，第31天提高1倍，而到第39天下降0.8倍，GzMYB-7D1的相對表達量在花后第22天和第31天時顯著高于其他時期。GzMYC-2A1的相對表達量在花后第22天時最低，在第31天時最高；與花后第9天的相比，只在第31天表達量有所提高，在第13、22天和第39天時的表達量都分別下降了0.2、0.4倍和0.3倍。

結(jié)果表明，GzMYB-7D1和GzMYC-2A1的相對表達量雖然呈現(xiàn)出相同的上升-下降-再上升-再下降變化趨勢，但GzMYB-7D1的相對表達量比GzMYC-2A1要高出1倍，二者在花后第22天時期的變化趨勢不同，GzMYB-7D1是上升趨勢，而GzMYC-2A1還是呈下降的趨勢。

3 討 論

在本研究中，GzANS和GzCHS的相對表達量均在發(fā)育中后期較早期表達量髙，到花后第22天時達到最大值，這與李海芬[17]、劉澤厚[13]和董玉秀[18]等的研究結(jié)果基本一致。另外，從GzANS和GzCHS的相對表達量水平來看，GzANS在貴紫麥1號籽粒形成中后期的表達水平比GzCHS高許多。由于ANS能催化無色花青素轉(zhuǎn)化為有色花青素，其相對表達量的大量增加很可能促進了有色花青素產(chǎn)物的積累，有利于花青素的合成。

研究表明，不同組織中花青素的產(chǎn)生往往受bHLH(MYC)或MYB蛋白的組織特異性表達調(diào)控[21-22]。Jiang Wenhui 等研究發(fā)現(xiàn)，TaPpb1的表達水平逐漸升高，在花后第22天達到最高值，隨后略有下降，TaPpm1的表達水平也逐漸升高，在花后第28天達到最高值[23]。本研究中，GzMYB-7D1的相對表達量在花后第22天開始上升，在第31天達到最高值，與Jiang Wenhui等[23]的研究結(jié)果基本一致。但GzMYC-2A1的相對表達量在花后第22天時下降，到第31天又升高并達到最高值，這與Jiang Wenhui等[23]的研究結(jié)果不同。這可能是研究材料不同的原因，也有可能是品種在不同環(huán)境下基因表達差異所致。從本研究結(jié)果看，GzMYC-2A1在籽粒形成早期和后期有較高表達，中期表達水平相對較低，推測其在種子發(fā)育早期的表達水平高可能是由于參與調(diào)節(jié)類黃酮合成途徑上游基因的表達，利用底物進行生物合成，而后期的表達高可能有利于色素物質(zhì)的合成及種子顏色的形成。

對比不同發(fā)育時期貴紫麥1號籽?；ㄇ嗨睾康淖兓虶zANS、GzCHS、GzMYB-7D1和GzMYC-2A1四個基因表達量的變化發(fā)現(xiàn)，GzANS和GzCHS的表達高峰是早于花青素含量的，這與Trojan等[15]的研究結(jié)果相同，表明這二個結(jié)構(gòu)基因提前表達并轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的活性酶，為花青素的積累作準(zhǔn)備，進一步證明GzCHS和GzANS可能是促使籽粒著色的最重要結(jié)構(gòu)基因之一。同樣，GzMYB-7D1和GzMYC-2A1的表達高峰也是略早于花青素含量的，特別是GzMYB-7D1的相對表達量在花后第22天和第31天時顯著高于其他時期，說明其對籽粒形成過程中花青素的合成起著重要的調(diào)控作用，在以后的研究中應(yīng)重點關(guān)注和開展研究。

植物花青素的合成代謝具有復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制，許多調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因的表達模式和相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制還需要進一步探索，且不同的物種也可能會存在部分甚至較大差異，需要進一步開展研究，以深入了解紫粒小麥花青素合成及其分子機制。