萬(wàn)凌云， 裴河歡2， 付金娥， 潘麗梅， 韋 瑩， 何麗麗， 冀曉雯， 韋樹(shù)根

(1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園， 南寧 530023； 2.欽州市中醫(yī)藥研究所， 廣西 欽州 535000)

種子是種質(zhì)資源保存最為理想的材料，但不同種子類(lèi)型的貯藏方式不同?；诜N子貯藏特性的差異，一般可將種子分為2種類(lèi)型，即正常性種子(Orthodox seed)和頑拗性種子(Recalcitrant seed)[1]。正常性種子在成熟時(shí)經(jīng)歷一個(gè)明顯的脫水過(guò)程，因此正常性種子脫落時(shí)含水量較低(可干燥至1%～5%含水量)，在低溫狀態(tài)下可以長(zhǎng)期貯藏[2]。頑拗性種子自然風(fēng)干條件下壽命很短，如黃皮(Clausenalansium)種子采收后壽命只有十多天[3]。這與頑拗性種子在成熟時(shí)并不發(fā)生脫水過(guò)程，脫落時(shí)仍保持相對(duì)較高的含水量和代謝活性密切相關(guān)[4]。頑拗性種子存在一個(gè)含水量臨界值(Critical moisture content)，即種子低于含水量臨界值時(shí)，水分脅迫會(huì)對(duì)種胚造成嚴(yán)重傷害，種子生活力迅速降低[5]，因此，含水量對(duì)于頑拗性種子的生活力和貯藏壽命至關(guān)重要，頑拗性種子生物學(xué)研究中也將種子含水量作為評(píng)價(jià)種子脫水耐性的重要指標(biāo)之一[6]。

對(duì)于正常性種子而言，因?yàn)槠浜康?，一般在低溫條件下有助于種子貯藏[7]。但頑拗性種子不耐干燥，對(duì)脫水敏感，低于脫水臨界值時(shí)其生活力會(huì)迅速下降[8]。大多數(shù)頑拗性種子屬于溫?zé)釒е参?，適應(yīng)高溫環(huán)境，不耐低溫，如荔枝(Lichichinensis)、龍眼(Dimocarpuslongyan)、黃皮(Clausenalansium)等[9]。這可能與其成熟時(shí)仍保持較高的含水量，且所含水分多為自由水[10]，低溫可能會(huì)對(duì)頑拗性種子造成冷害和凍害[11]。所以頑拗性種子不僅對(duì)脫水敏感，也可能表現(xiàn)對(duì)低溫敏感[12]。

種子頑拗性特征與其獨(dú)特的發(fā)育模式密切相關(guān)[13]。頑拗性種子在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中一直處于旺盛代謝狀態(tài)，一旦胚發(fā)育成熟即自然進(jìn)入萌發(fā)階段，因此，頑拗性種子在發(fā)育和萌發(fā)之間并不存在一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，而是一個(gè)自然的過(guò)渡[12]。這種自然過(guò)渡過(guò)程中，ABA水平下降被認(rèn)為與頑拗性種子頑拗性的關(guān)系最為密切[14]。

桑寄生(Taxilluschinensis(DC.) Danser)為桑寄生科鈍果寄生屬植物。桑寄生是傳統(tǒng)的常用大宗中藥材，具有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎元等功效[15]。種子繁殖是桑寄生繁殖的唯一方式，桑寄生種子成熟過(guò)程中不經(jīng)歷脫水過(guò)程，成熟脫落時(shí)種子含水量高達(dá)50.70%以上[16]，對(duì)脫水、低溫敏感性，具有頑拗性種子生物學(xué)特性，嚴(yán)重阻礙了桑寄生種子的貯藏保存[17]。但有關(guān)其種子頑拗性及貯藏保存方面仍缺乏系統(tǒng)的研究，本文將探討桑寄生種子生活力和萌發(fā)率間的相關(guān)性，桑寄生種子脫水、低溫臨界值以及植物激素脫落酸(ABA)處理對(duì)桑寄生種子保存的作用。初步確定桑寄生種子頑拗性生物學(xué)特征并為延長(zhǎng)保存時(shí)間提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)所需材料采集于廣西藥用植物園內(nèi)寄生于桑樹(shù)(MorusalbaL.)的桑寄生種子，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所馬小軍研究員鑒定為桑寄生植物的種子。試驗(yàn)期間，將成熟的桑寄生漿果采集后及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室，去除果皮和果膠，挑選成熟度、健康大小一致的種子備用。

1.2 方 法

1.2.1桑寄生種子生活力TTC(2，3，5-三苯基氯化四氮唑)測(cè)定法的條件篩選

采用L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法考察TTC濃度、染色溫度(培養(yǎng)箱的溫度)和染色時(shí)間3種因素對(duì)桑寄生種子生活力測(cè)定結(jié)果的影響，各因素水平具體見(jiàn)表1。

表1 TTC測(cè)定因素和測(cè)定水平

水平因素TTC濃度/%時(shí)間/h溫度/℃10.442520.883031.21235

TTC測(cè)定具體操作參考雷慧霞等[18]方法。每組試驗(yàn)取桑寄生種子100粒，記錄染色種子數(shù)，以染色種子數(shù)占總種子數(shù)的百分比表示種子生活力。最終確定桑寄生種子生活力TTC測(cè)定法各因素的最適水平組合，并進(jìn)行種子生活力測(cè)定驗(yàn)證。

1.2.2常溫存放時(shí)桑寄生種子生活力和種子萌發(fā)率變化

將桑寄生種子在室內(nèi)常溫(25 ℃)環(huán)境下自然存放。每天取桑寄生種子600粒，平均分成2組分別進(jìn)行生活力和萌發(fā)率測(cè)定，每100粒種子作為1次重復(fù)，重復(fù)3次。分別統(tǒng)計(jì)染色種子數(shù)和萌發(fā)種子數(shù)，以其占總種子數(shù)的百分比分別代表種子生活力和種子萌發(fā)率。

1.2.3桑寄生種子頑拗性測(cè)定

脫水敏感性試驗(yàn)：每100粒新鮮干凈的桑寄生種子為一份，然后放置于裝有硅膠的密閉干燥容器中，每隔4 h取6份種子分為2組，每組3份作為3次重復(fù)，分別用TTC法測(cè)定種子生活力和烘干干燥法測(cè)定種子含水量。

低溫敏感性試驗(yàn)：將新鮮干凈的桑寄生種子分別放到2 ℃，0 ℃，-2 ℃，-20 ℃的冰箱內(nèi)保存。前5 d，每處理每天取出300粒種子用于種子生活力測(cè)定，每100粒種子作為1次重復(fù)，重復(fù)3次；5 d后，每隔5 d測(cè)定一次種子生活力；30 d后，間隔15 d測(cè)定1次種子生活力。

1.2.4桑寄生種子保存方法

種子保存溫度篩選：將新鮮干凈的桑寄生種子分別存放于2 ℃，4 ℃，6 ℃，25 ℃ 4個(gè)溫度條件下。方法同1.2.3中低溫敏感性試驗(yàn)。

ABA浸泡：將新鮮干凈的桑寄生種子在2 mg·L-1的ABA溶液中浸泡30 min，然后存放于上述篩選的最佳保存溫度中進(jìn)行保存。種子生活力測(cè)定時(shí)間與上述種子保存溫度篩選試驗(yàn)一致。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-way ANOVA方差分析、Duncan多重比較和Pearson相關(guān)性分析，采用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 桑寄生種子生活力與種子萌發(fā)率的關(guān)系

2.1.1桑寄生種子生活力TTC法測(cè)定條件篩選

種子生活力反映了種子的發(fā)芽潛在能力和種胚所具有的生命力，是判斷種子質(zhì)量的重要指標(biāo)。TTC染色法是測(cè)定種子生活力的常用方法。

表2 TTC法測(cè)定桑寄生種子的生活力

序號(hào)ATTC濃度/%B染色溫度/℃C染色時(shí)間/h生活力/%10.425417.0020.430868.0030.4351263.0040.825882.0050.8301288.0060.835466.0071.2251272.0081.230453.0091.235875.00K149.3357.0045.33—K278.6769.6775.00—K366.6768.0074.33—分析較優(yōu)水平A2B2C2極差分析29.3312.6729.67主次因素C>A>B

注：K 1，K 2，K 3代表每個(gè)處理的3個(gè)水平數(shù)據(jù)的綜合平均。

從表2可知，TTC濃度為0.4%、0.8%和1.2%時(shí)種子生活力綜合平均值分別為49.33%、78.67%和66.67%，可見(jiàn)TTC濃度為0.8%時(shí)桑寄生種子生活力最高。而染色溫度以30 ℃種子生活力最高，染色時(shí)間以8 h種子生活力最高。而通過(guò)極差分析表明，影響桑寄生種子生活力測(cè)定的主要因素染色時(shí)間>TTC濃度>染色溫度。所以TTC法測(cè)定桑寄生適宜條件是染色時(shí)間8 h，TTC濃度0.8%，染色溫度30 ℃。

因?yàn)樵谏鲜稣辉囼?yàn)中未出現(xiàn)過(guò)染色時(shí)間8 h，TTC濃度0.8%，染色溫度30 ℃的試驗(yàn)組，為此設(shè)置了對(duì)TTC測(cè)定篩選條件的驗(yàn)證試驗(yàn)。從表3可知，篩選的TTC法測(cè)定條件下的桑寄生種子生活力平均值為92.75%，高于正交試驗(yàn)中的任意試驗(yàn)組，且標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為1.50，表明篩選的TTC法測(cè)定條件穩(wěn)定。

表3 桑寄生種子生活力TTC法測(cè)定適宜條件驗(yàn)證

組數(shù)試驗(yàn)種子數(shù)染色種子數(shù)生活力/%11009292.0021009494.0031009494.0041009191.00平均92.75±1.50

2.1.2常溫存放下桑寄生種子生活力和萌發(fā)率變化

將桑寄生種子采摘后在室內(nèi)常溫(25 ℃)存放。從圖1可知，采摘當(dāng)天(0 d)桑寄生種子生活力和萌發(fā)率最高，分別為95.00%和82.00%，存放第1天桑寄生種子生活力和萌發(fā)率略有下降，分別為94.00%和79.00%。但存放第2天開(kāi)始，桑寄生種子生活力和萌發(fā)率開(kāi)始顯著下降，存放第3天桑寄生種子生活力和萌發(fā)率已分別下降至52.00%和39.00%。存放到第7天時(shí)，桑寄生種子生活力僅為6.00%，基本失去萌發(fā)能力。可見(jiàn)桑寄生種子生活力一直高于萌發(fā)率，但生活力和萌發(fā)率隨存放時(shí)間的變化趨勢(shì)十分相似。

圖1 常溫存放下桑寄生種子生活力和萌發(fā)率變化

將桑寄生種子生活力與其對(duì)應(yīng)的種子萌發(fā)率進(jìn)行相關(guān)性分析。從圖2可知，二者呈極顯著的線性相關(guān)(R2=0.990,p<0.001)，以桑寄生種子生活力為X，以桑寄生種子萌發(fā)率為Y，進(jìn)行線性方程擬合得到Y(jié)=0.936X-8.956，因此，可依據(jù)此方程中的桑寄生種子生活力推算出桑寄生種子的理論萌發(fā)率。

2.2 桑寄生種子的頑拗性

2.2.1桑寄生種子的脫水敏感性

從圖3可知，脫水處理4 h和8 h脫水速率較快，脫水4 h的脫水速率分別為9.15%和3.13%，變化達(dá)到了顯著水平。8 h之后脫水速率減緩，每脫水4 h桑寄生種子脫水速率約2.00%，每脫水8 h桑寄生種子脫水率變化才達(dá)到顯著水平。隨著桑寄生種子含水量的下降，其種子生活力也相應(yīng)下降。脫水4 h，桑寄生種子含水量為41.55%，種子生活力受到的影響較??；脫水8 h，桑寄生種子生活力顯著下降；脫水16 h，桑寄生種子含水量為35.17%，種子生活力迅速下降，為66.00%；脫水28 h，桑寄生種子含水量已降至30.00%，為29.17%，種子生活力呈線性迅速下降，之后每脫水4 h桑寄生種子生活力變化均達(dá)到顯著水平。當(dāng)桑寄生種子含水量在25.00%以下時(shí)，種子生活力很低，根據(jù)上述桑寄生種子生活力與種子萌發(fā)率線性方程可知，當(dāng)桑寄生種子生活力低于10%時(shí)，種子萌發(fā)率為0.00%，因此，脫水40 h，桑寄生種子含水量?jī)H為23.47%，種子生活力僅為9.00%，此時(shí)桑寄生種子基本無(wú)萌發(fā)能力。

圖2 桑寄生種子生活力與種子萌發(fā)率的相關(guān)性

圖3 脫水處理對(duì)桑寄生種子生活力的影響

2.2.2桑寄生種子的低溫敏感性

從表4可知，桑寄生種子在-20 ℃、-2 ℃的溫度下存放1 d即完全喪失生活力；而在0 ℃下存放1 d，生活力迅速下降到12%，存放4 d完全喪失了生活力。桑寄生種子在2 ℃溫度下雖隨著存放時(shí)間增加，生活力逐漸下降，但其在存放前5 d生活力下降幅度不大，存放第10天時(shí)才開(kāi)始顯著地快速下降，并直到存放75 d才完全喪失生活力。

表4 低溫處理下的桑寄生種子生活力

存放時(shí)間/d溫度/℃20-2-20182.00a12.00a——284.00a6.00b——378.00ab2.00c——478.00ab———575.00b———1067.00c———1554.00d———2038.00e———2532.00f———3025.00g———4511.00h———605.00i———75————

2.3 桑寄生種子的保存

2.3.1保存溫度對(duì)桑寄生種子生活力的影響

從圖4可知，不同溫度條件下桑寄生種子生活力隨存放時(shí)間的變化是不同的。在25 ℃條件下存放，桑寄生種子生活力每一天都在顯著地下降，存放第5天時(shí)，種子生活力降至26%。在2 ℃、4 ℃和6 ℃條件下，存放的前5 d的桑寄生種子生活力下降均比較緩慢，3種溫度條件下桑寄生種子生活力也較為相近。第10天之后，桑寄生種子生活力在3種溫度條件下開(kāi)始迅速下降，但下降速率不太相同，桑寄生種子生活力在4 ℃條件下一直明顯地高于2 ℃和6 ℃，且保存90 d后完全喪失生活力。而在2 ℃和6 ℃條件下，桑寄生種子分別僅保存到60 d和45 d就完全喪失生活力。

圖4 不同溫度條件下桑寄生種子生活力隨存放時(shí)間的變化

2.3.2ABA對(duì)桑寄生種子生活力的影響

從圖5可知，對(duì)照組的桑寄生種子生活力存放5 d后開(kāi)始下降，而ABA浸泡組則10 d后開(kāi)始下降，ABA浸泡明顯延緩了桑寄生種子生活力下降時(shí)間。存放第5天開(kāi)始，ABA浸泡組的桑寄生種子生活力在每個(gè)存放時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組，且ABA浸泡組的桑寄生種子至完全喪失生活力保存時(shí)間最終為135 d，多于對(duì)照組的90 d保存時(shí)間。

圖5 ABA浸泡后桑寄生種子生活力隨存放時(shí)間的變化

3 討 論

種子質(zhì)量是藥材產(chǎn)量和品質(zhì)的重要基礎(chǔ)和前提，而種子萌發(fā)率是檢測(cè)種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[19]。但有些植物物種的種子萌發(fā)時(shí)間不一致導(dǎo)致整個(gè)萌發(fā)過(guò)程較長(zhǎng)，如桑寄生種子在25 ℃條件下萌發(fā)勢(shì)最高到達(dá)35 d[20]。因此，應(yīng)用種子萌發(fā)率檢測(cè)桑寄生質(zhì)量種子是一個(gè)長(zhǎng)時(shí)間的過(guò)程。而TTC法則是一種能快速判斷種子潛在發(fā)芽能力的有效方法，現(xiàn)已開(kāi)始廣泛應(yīng)用于藥用植物種子質(zhì)量檢測(cè)，如北細(xì)辛[21]、厚樸[22]、肉蓯蓉[23]等，但不同植物物種TTC法最適宜的測(cè)定條件有所差異。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法探討了TTC濃度、染色時(shí)間和染色溫度對(duì)桑寄生種子生活力測(cè)定的影響，最后確定了TTC法測(cè)定桑寄生種子生活力的最佳測(cè)定條件組合。種子生活力不一定能真實(shí)地反映種子萌發(fā)能力，但對(duì)車(chē)前子[24]、紅豆[25]、白術(shù)[26]等藥用植物的研究表明，種子生活力與種子萌發(fā)率存在一定的相關(guān)性。因此，本文將桑寄生種子生活力和萌發(fā)率進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明二者呈顯著線性正相關(guān)關(guān)系，并得到了線性方程(圖2)。以本線性方程可應(yīng)用TTC法快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地測(cè)定桑寄生種子生活力數(shù)值，預(yù)測(cè)桑寄生種子萌發(fā)率，從而為桑寄生種子質(zhì)量檢測(cè)提供了快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便和適用的方法。

前人對(duì)桑寄生種子的研究表明，桑寄生種子對(duì)脫水和低溫敏感，具有頑拗性種子的生物特性[17]。但不同植物物種對(duì)脫水和低溫耐性是不同的，如紅毛丹種子(Nepheliumlappaceum)脫水臨界值約為20.00%，木菠蘿種子(Artocarpusheterophyllus)約為30%，榴蓮種子(Duriozibethinus)約為45.00%，而海橄雌種子(Avicenniamarina)約為52.00%，為此根據(jù)忍耐脫水能力的不同，又將頑拗型種子分為低度、中等和高度3類(lèi)[2]；而熱帶種子較之溫帶種子更易受低溫?fù)p害[27-28]。對(duì)桑寄生種子的脫水和低溫的臨界值是多少還尚不清晰。本實(shí)驗(yàn)在不同脫水和低溫條件下測(cè)定桑寄生種子生活力，不僅揭示了桑寄生種子生活力隨不同脫水程度和低溫條件的變化規(guī)律，還確定了桑寄生種子脫水臨界值約為30.00%，而低溫臨界值約為0 ℃。

適合正常種子貯藏的低溫、低含水量和密閉條件往往并不適合頑拗性種子[29]，甚至?xí)涌旆N子的死亡[30]。頑拗性種子保存的溫度既要低至足以抑制或減慢萌發(fā)而又要高至足以阻止低溫的傷害[31]，因此，頑拗性種子對(duì)脫水和低溫敏感性也決定了其保存技術(shù)是頑拗性種子研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比不同溫度條件下桑寄生種子生活力隨保存時(shí)間的變化，雖然所有的溫度條件下桑寄生種子生活力都隨保存時(shí)間呈下降趨勢(shì)，在4 ℃時(shí)桑寄生種子生活力下降最為緩慢，直到90 d種子才完全喪失生活力。這也表明適度的溫度選擇也可以延緩頑拗性種子的失活速度[32]。另一方面，脫落酸ABA在種子發(fā)育與萌發(fā)過(guò)程具有重要作用[33]，其含量的下降與頑拗性種子的頑拗性也是密切相關(guān)[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用外源植物激素ABA浸泡桑寄生種子，然后在4 ℃條件下保存，結(jié)果表明，ABA浸泡后的前10 d桑寄生種子生活力基本沒(méi)有下降，較之對(duì)照組延長(zhǎng)了5 d，且生活力下降速率進(jìn)一步的延緩。前人對(duì)頑拗性種子發(fā)育和萌發(fā)過(guò)程中ABA的作用研究表明，ABA一方面能抑制種子代謝作用，阻止胚萌發(fā)而促進(jìn)發(fā)育，如抑制α-淀粉酶活性[34]，另一方面能在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)貯藏蛋白合成和積累[33]。此外，ABA還是種胚發(fā)育后期親水性蛋白(LEA)基因表達(dá)的信使，誘導(dǎo)LEA蛋白產(chǎn)生和積累，其與大分子結(jié)構(gòu)結(jié)合對(duì)種子脫水傷害起保護(hù)作用[35-36]。因此，ABA在頑拗性種子生活力保持方面具有十分重要的作用。初步確定延緩桑寄生種子失活的辦法：將用無(wú)菌水處理過(guò)的新鮮種子浸泡到2 mg·L-1的ABA溶液中30 min，取出瀝干表面水分，攤開(kāi)放置于鋪有2層消毒濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，然后用封口袋包裝好置于4 ℃的冰箱保存。

綜上所述，確定了桑寄生種子生活力TTC法測(cè)定的最佳條件組合；擬合了桑寄生種子生活力與種子萌發(fā)率的線性方程，為桑寄生種子質(zhì)量檢測(cè)提供了快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便和適用的方法；系統(tǒng)地描述了桑寄生種子的頑拗性生物學(xué)特性；初步探索了桑寄生種子保存的辦法。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討桑寄生對(duì)脫水和低溫敏感機(jī)理以及超低溫長(zhǎng)期保存的研究提供科學(xué)參考。