曹兵 陳雄生

黃韌帶骨化癥 ( ossification of the ligamentum flavum，OLF ) 是由彈性纖維組織和結(jié)締組織組成的黃韌帶發(fā)生異位骨化引起脊髓壓迫的一種疾病[1]。OLF 的好發(fā)部位大多集中在下胸椎[2]，以 T10～11和 T11～12最為多見。國內(nèi) OLF發(fā)病高達(dá) 3.8%，女性多見，同時約 1 / 3 的患者存在多節(jié)段發(fā)病[3]。在導(dǎo)致胸椎脊髓壓迫的疾病中，OLF 是最常見的病因之一[3]。OLF 引起脊髓病的常見癥狀包括下肢功能障礙，可伴有疼痛、麻木、大小便障礙等括約肌功能障礙，甚至發(fā)展為截癱，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，增加家庭和社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。

OLF 發(fā)病的分子機(jī)制仍不明確，但大量文獻(xiàn)報道 Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 2 ( runt-related transcription factor 2，Runx2 )在這個過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[5-7]。Runx2 是一種間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與多條信號通路，所形成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能在 OLF 發(fā)生發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵性作用[8]。為了進(jìn)一步闡明 Runx2 在OLF 發(fā)病機(jī)制中的作用，筆者根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果，將Runx2 作為復(fù)雜調(diào)控的中心，分別闡述與 Runx2 相關(guān)的幾條分子通路如何介導(dǎo)異位骨化過程的發(fā)生，進(jìn)而為后續(xù)研究提供基本的參考依據(jù)并討論未來可能的研究方向。

一、Runx2 的生物學(xué)功能

Runx 是一類高效轉(zhuǎn)錄因子。Runx 家族成員分為Runx1、Runx2、Runx3 三型，可影響人體生長發(fā)育及腫瘤發(fā)生等生理病理進(jìn)程[8]。其中 Runx2 在骨代謝調(diào)節(jié)方面作用最為顯著。Runx2 是與果蠅蛋白 Runt 同源的骨轉(zhuǎn)錄因子，Runx2 是一個主基因，其編碼與間充質(zhì)前體成骨分化過程有關(guān)的蛋白質(zhì)[9]。Runx2 可誘導(dǎo)骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成，促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，以及促進(jìn)軟骨細(xì)胞形成和軟骨內(nèi)血管分化[7,10]，Runx2 對于成骨細(xì)胞分化和軟骨細(xì)胞成熟至關(guān)重要[11]。

有研究發(fā)現(xiàn)，Runx2 基因可結(jié)合成骨細(xì)胞特異順式作用元件，激活骨鈣蛋白、骨橋蛋白、骨涎蛋白和 I 型膠原基因的表達(dá)[7,10]。Runx2 促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)形成，繼而促進(jìn)骨愈合；同時，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白又可通過激活 MEK / ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)一步上調(diào)成骨細(xì)胞內(nèi) Runx2 表達(dá)，實現(xiàn) Runx2 與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白之間正反饋調(diào)節(jié)，加強(qiáng) Runx2對成骨分化誘導(dǎo)作用[12]。Ueta 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，外源性Runx2 能刺激肥大型軟骨細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，促進(jìn)局部血管生成，加速軟骨內(nèi)成骨的過程。Runx2是骨骼發(fā)育必不可少的轉(zhuǎn)錄因子，Runx2 在軟骨細(xì)胞的成熟中起主要作用，此外，其對于成骨細(xì)胞分化和增殖必不可少的[14]。Runx2 可調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，并進(jìn)一步成熟為成骨細(xì)胞[15]。

Runx2 對于成骨細(xì)胞分化和骨骼形態(tài)發(fā)生都具有至關(guān)重要的作用，目前作為骨形成標(biāo)志被廣泛運用于各類研究中。

二、Runx2 在 OLF 發(fā)病機(jī)制中的作用

研究發(fā)現(xiàn)，Wnt 信號通路、BMP 信號通路及 Notch 等信號通路均具有促進(jìn)成骨基因表達(dá)的作用，在成骨細(xì)胞分化和增殖過程中被激活[16]。Runx2 作為這些通路的樞紐，可能在 OLF 發(fā)生的過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

1. Wnt 信號通路：Wnt 是一類富含半胱氨酸的脂錨定糖蛋白，可連結(jié)脂蛋白受體相關(guān)蛋白 5 / 6 ( lipoprotein receptor related protein 5 / 6，LRP5 / 6 )，抑制胞內(nèi)糖原合酶 β，誘導(dǎo) β-連環(huán)蛋白的累積；β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)入核內(nèi)并激活 T 細(xì)胞因子 / 淋巴增強(qiáng)因子 ( T-cell factor / lymphoid enhancer factor，TCF / LEF ) 的轉(zhuǎn)錄[17]。TCF 調(diào)節(jié)單元是 Runx2 相關(guān)基因的啟動子，可促進(jìn)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，改善骨形成微環(huán)境并影響軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能[10]。Yayama 等[18]通過實驗進(jìn)一步證實 Wnt 信號通路可通過調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，啟動軟骨內(nèi)骨化，并導(dǎo)致 OLF 的出現(xiàn)。通過向培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中添加重組人 Wnt3α，誘導(dǎo)乙酰膽堿酯酶( acetylcholinesterase，ACHE ) 基因的表達(dá)，而通過 ACHE基因啟動子中 Runx2 結(jié)合位點證實 Runx2 是 Wnt / β 連環(huán)蛋白信號通路的下游轉(zhuǎn)錄因子[19]；另一方面，Runx2 過表達(dá)可在體內(nèi)或體外抑制 Wnt / β 連環(huán)蛋白水平和活性[20]；但關(guān)于 Runx2 過表達(dá)抑制 Wnt / β 連環(huán)蛋白與 Runx2 作為Wnt / β 連環(huán)蛋白下游轉(zhuǎn)錄因子兩種相互作用如何平衡尚不明確。

鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子 ( Osterix ) 在成骨細(xì)胞中表達(dá)，是骨生成過程中必需的轉(zhuǎn)錄因子[21]。Osterix 通過促進(jìn)相關(guān)成骨基因表達(dá)，促使成骨細(xì)胞的發(fā)育和成熟[22]。Runx2 基因位于 Osterix 上游，可啟動 Osterix 的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而激活 Wnt信號通路。Nakashima 等[22]發(fā)現(xiàn) Runx2 基因敲除小鼠缺少 Osterix 的表達(dá)，從動物實驗水平進(jìn)一步驗證轉(zhuǎn)錄因子Runx2 對 Osterix 的調(diào)控作用。在骨骼發(fā)育過程中 Wnt 信號通路可調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長因子 ( fibroblast growth factor，F(xiàn)GF ) 的活性，而 FGF 可促進(jìn) Osterix 基因的表達(dá)，同時對 Runx2 基因也具有較弱的誘導(dǎo)作用[23]。此外，轉(zhuǎn)錄因子 Osterix 還可通過上調(diào) DKK1 ( Wnt 抑制劑 ) 水平實現(xiàn)對Runx2 / Wnt 信號通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)[24]。

以上研究說明，轉(zhuǎn)錄因子 Runx2 主要通過促進(jìn) Osterix的表達(dá)激活 Wnt 信號通路，啟動黃韌帶內(nèi)的異位成骨過程，并最終導(dǎo)致骨化物的形成。

2. 骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 ( bone morphogenetic protein，BMP-2 ) 信號通路：BMPs 屬于轉(zhuǎn)化生長因子 β ( transforming growth factor beta，TGF-β ) 亞家族的一類細(xì)胞因子，可在骨轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮誘導(dǎo)成骨作用，其中 BMP-2 通過聚集骨源細(xì)胞及誘導(dǎo)成骨分化發(fā)揮骨修復(fù)再生的作用[25]。Qu等[26]發(fā)現(xiàn)，由堿基突變導(dǎo)致的 BMP-2 基因表達(dá)上調(diào)可能是胸椎黃韌帶發(fā)生骨化的可能機(jī)制。機(jī)械牽拉刺激是引起B(yǎng)MP-2 過度表達(dá)的誘因之一[27]。Shunzhi 等[28]研究證實機(jī)械牽拉刺激通過 BMP 信號通路促進(jìn)黃韌帶內(nèi)異位成骨過程的啟動。具體機(jī)制為：BMP-2 與 I 型或 II 型跨膜絲氨酸激酶受體蛋白形成異源四聚體復(fù)合物，促進(jìn)胞內(nèi) Smad / 1 /5 / 8 磷酸化，聯(lián)合 Smad4 后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，刺激轉(zhuǎn)錄因子 Runx2 并上調(diào)成骨細(xì)胞基因的表達(dá)，最終促進(jìn)黃韌帶內(nèi)成骨分化過程[29]。

BMP-2 信號通路的成骨作用同樣是通過 Runx2 作為中間介導(dǎo)實現(xiàn)的。Javed 等[29]通過建立 Runx2 C 端鏈的突變，阻止 Runx2 與母親 DPP 同源物 2 ( 果蠅 ) ( sekelsky mothers against dpp，Smad ) 連接，導(dǎo)致 BMP-2 / TGF-β無法整合，抑制了成骨分化早期階段相關(guān)基因的表達(dá)。Gomis 等[30]發(fā)現(xiàn)，叉頭框蛋白 ( forkhead box，F(xiàn)OXO ) 通過與 Smad 相互作用，調(diào)節(jié) TGF-β 信號通路。此外，F(xiàn)OXO1具有刺激 Runx2 表達(dá)以及促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的作用[31]。因此，Runx2 可通過上述機(jī)制調(diào)控 BMP-2 信號通路，從而影響骨化過程。

BMP-2 信號通路與 Ostriex 之間也存在相關(guān)關(guān)系[22,32-34]。因此，Runx2 也能通過與 Osterix 的相互作用，激活 BMP-2 信號通路，從而促進(jìn) OLF 過程的發(fā)生發(fā)展。Dlx5 是 BMP 誘導(dǎo) Runx2 表達(dá)必不可少的介質(zhì)[35]；BMP-2信號傳導(dǎo)刺激 p300 介導(dǎo)的 Runx2 乙酰化[36]。Dlx5、p300在 BMP-2 介導(dǎo) Runx2 信號通路中作用位點及是否存在相互影響尚未可知。

3. Notch 信號通路：Notch 信號通路是決定細(xì)胞命運和功能的重要信號通路之一，在骨骼發(fā)育和重塑過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Notch 信號通路的激活可抑制成骨過程的啟動?，F(xiàn)有研究主要報道了以下幾種可能機(jī)制：Notch 信號通路可間接抑制 Runx2 的表達(dá)，從而抑制成骨過程[37-38]。此外，Notch 信號通路還可對絲氨酸 / 蘇氨酸激酶 ( Protein Kinase B，PKB / AKT ) 發(fā)揮雙向調(diào)控的作用，進(jìn)一步導(dǎo)致β-catenin 的降解或維持其穩(wěn)定，從而抑制成骨分化[39-43]。Notch 通過受體 N1ICD 結(jié)合 BMP 信號通路下游分子Smad1，對 BMP-2 誘導(dǎo) Msx2 分泌起到促進(jìn)作用[44]。Notch靶基因 Hey1 通過廢除 Runx2 的轉(zhuǎn)錄活性負(fù)性調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化與成熟[45]；Notch 通過抑制 Runx2 轉(zhuǎn)錄活性負(fù)調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞 ( bone marrow mesenchymal stromal cells，BMMSC ) 的成骨作用[38]。Notch 信號通路刺激BMP-2[44]，繼之，BMP-2 對 Runx2 有誘導(dǎo)作用[29]，但目前尚未報道 Notch 信號通路通過 BMP-2 對 Runx2 產(chǎn)生間接誘導(dǎo)作用，其中原因仍需要進(jìn)一步研究。

4. FGF 信號通路：FGF 信號通路可調(diào)節(jié)關(guān)鍵的細(xì)胞生理活動，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞存活[27]。在骨骼發(fā)育過程中 Wnt / β-catenin 可調(diào)節(jié) FGF 的活性，而 FGF 可調(diào)控 Osterix 的表達(dá)，同時對 Runx2 也具有較弱的調(diào)控作用[23]。FGF2 可激活 Runx2 的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨[40-41]。FGF-2 通過激活有絲分裂原活化蛋白激酶( mitogen-activated protein kinase，MAPK ) 途徑介導(dǎo) Runx2的磷酸化和激活[41]；FGF2 通過誘導(dǎo) Runx2 表達(dá)，支持細(xì)胞分化和骨骼發(fā)育[46]；Wnt / β-catenin 可調(diào)節(jié) FGF 的活性，而 FGF 可調(diào)控 Osterix 的表達(dá)，結(jié)合 Osterix 可通過上調(diào) DKK1 ( Wnt 抑制劑 ) 水平實現(xiàn) Runx2 / Wnt 的負(fù)反饋調(diào)節(jié)[24]，上述反饋通路在 Wnt / β-catenin / FGF / Osterix /Runx2 信號通路中如何發(fā)揮作用卻很少研究報道。

5. 瘦素 ( leptin ) 信號通路：Leptin 不僅在調(diào)節(jié)體重、能量代謝方面作用顯著，而且在糖脂穩(wěn)態(tài)維持、再生、免疫、炎癥、骨骼發(fā)育和組織重塑方面也具有重大意義[42]。通過對比 OLF 女性患者與非 OLF 女性體內(nèi) leptin 受體mRNA 表達(dá)，發(fā)現(xiàn) OLF 女性患者體內(nèi)血清 leptin 水平明顯升高[43]。Leptin 激活 STAT3 分子通路，結(jié)合 Runx2、類固醇受體共激活劑 1 形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，作用于 Runx2 靶基因啟動子，激活成骨基因，最終促進(jìn)黃韌帶異位成骨過程；Leptin 對黃韌帶細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)作用是通過 MAPK 信號通路實現(xiàn)的[47]。胸椎黃韌帶骨化細(xì)胞和黃韌帶非骨化細(xì)胞均存在 leptin 受體[47]，但 leptin 選擇性作用于胸椎黃韌帶骨化細(xì)胞的具體機(jī)制尚不清楚。

6. 其它信號通路：甲狀旁腺激素信號通路可通過激活PKA，促進(jìn) Runx2 的轉(zhuǎn)錄，抑制骨吸收，從而間接促進(jìn)成骨[48]。此外，Runx2 在分化的成骨細(xì)胞中過度表達(dá)也會反饋性抑制甲狀旁腺激素 ( parathyroid hormone，PTH ) 在體內(nèi)的合成代謝[48]。

綜上所述，OLF 成骨誘導(dǎo)過程中，Runx2 參與 Wnt 信號通路、BMP 信號通路、Notch 信號通路、FGF 信號通路、Leptin 信號通路等，并作為上述信號通路作用樞紐在成骨誘導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用。現(xiàn)有文獻(xiàn)可證明各類細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子可直接或間接通過 Runx2 調(diào)控 OLF 的發(fā)生發(fā)展。既往研究增加了對 OLF 發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，但很多環(huán)節(jié)及現(xiàn)象仍然無法用已有的研究結(jié)果來解釋，尤其是 OLF 分子機(jī)制中存在很多雙向調(diào)節(jié)，這些問題仍需要進(jìn)一步深入的研究。此外，如何將上述研究進(jìn)展應(yīng)用于臨床工作中仍是亟待攻克的難題。