張豐泉，董恩恒，薛玉雪

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院 新鄉(xiāng)市大氣污染健康效應(yīng)與干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453000)

顆粒物(particulate matter，PM)是空氣污染物的重要組成成分，按粒徑分為總懸浮顆粒物(TSP)、可吸入顆粒物(PM10)、細(xì)顆粒物(PM2.5)和超細(xì)顆粒物(PM0.1)。研究證實(shí)PM2.5是多種疾病的重要危險(xiǎn)因素，可誘發(fā)呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和代謝性疾病。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，PM2.5能夠抑制胎兒發(fā)育，導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局[1-2]，因而PM2.5被認(rèn)為是生殖系統(tǒng)的危害因素之一。我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，PM2.5急性暴露能影響妊娠結(jié)局，使雌鼠的不良妊娠率明顯升高[3]。但目前PM2.5生殖損傷的研究主要集中于流行病學(xué)調(diào)查方面，而其生殖損傷致病機(jī)理的研究還非常有限。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不僅是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和糖類(lèi)合成的基地，而且是細(xì)胞內(nèi)重要的物質(zhì)傳輸和信號(hào)傳導(dǎo)通路。已有研究證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與多種疾病(如阿爾茨海默病、帕金森病、糖尿病等)的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[4]。另有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在PM2.5誘發(fā)肺、肝損傷中被激活，是PM2.5致肺臟和肝臟損傷的重要作用機(jī)制[5]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激同樣在PM2.5的斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育損傷中起重要作用[6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠激活促凋亡基因caspase-3進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。已有研究證實(shí)凋亡是子宮細(xì)胞死亡的重要方式，對(duì)子宮起重要調(diào)節(jié)作用[7-8]。本研究中將雌鼠暴露PM2.5后，檢測(cè)子宮組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路相關(guān)蛋白及其下游凋亡調(diào)控蛋白caspase-3的表達(dá)情況，進(jìn)而闡述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在PM2.5生殖毒性中的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只8周齡清潔級(jí)雌性SD大鼠，體重180～200 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2012-0001】，飼養(yǎng)于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院屏障動(dòng)物房【SYXK(豫)2014-0005】，室溫22～24℃，12 h/12 h晝夜交替，相對(duì)濕度50%～60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)的要求(XXMU-2015-0021)。

1.1.2 主要儀器和試劑

熒光定量PCR儀(LightCycler 96， Roche，瑞士)，蛋白垂直電泳系統(tǒng)(Mini-PROTEAN Tetra，Bio-Rad，美國(guó))，凝膠成像分析系統(tǒng)(FluorChem R，ProteinSimple，美國(guó))，顯微鏡(AE2000，麥克奧迪，中國(guó))，TUNEL原位染色試劑盒(TACS·XL DAB Kit， Trevigen, 美國(guó))，TRIzol和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司，GRP78、PERK、CHOP、eIF2α和cleaved caspase-3一抗購(gòu)于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

參考已有研究設(shè)計(jì)本次實(shí)驗(yàn)PM2.5暴露劑量。將30只雌鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組(Con)、1.5 mg/(kg·bw) PM2.5低劑量暴露組(L-Exp)和6 mg/(kg·bw) PM2.5高劑量暴露組(H-Exp)[9]，每組10只。

1.2.2 PM2.5染毒

將收集的PM2.5配置成3 mg/mL低濃度和12 mg/mL高濃度懸液，配置方法參照我們前期的實(shí)驗(yàn)[3]。將制備的PM2.5懸液復(fù)溫重懸后，參照晉樂(lè)飛等[10]吸入式氣管暴露法進(jìn)行PM2.5染毒。大鼠麻醉后，用棉線繩掛住大鼠上切牙將大鼠垂直懸掛，鑷子拉出大鼠舌頭，吸取50 μL/100(g·bw) PM2.5懸液注入大鼠舌根部，并快速捏緊大鼠鼻腔，迫使大鼠經(jīng)口腔將PM2.5液吸入肺內(nèi)，當(dāng)聽(tīng)到肺部濕羅音表示吸入成功。染毒后，大鼠自由活動(dòng)，連續(xù)染毒30 d。對(duì)照組采用同樣的方法吸入50 μL/100(g·bw)的生理鹽水。

1.2.3 子宮組織病理學(xué)觀察

取新鮮組織用生理鹽水漂洗，4%多聚甲醛固定，酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋并切成5～6 μm厚的切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察子宮組織病理學(xué)變化。

1.2.4 子宮組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用TUNEL原位染色法檢測(cè)子宮組織細(xì)胞凋亡情況。常規(guī)方法將子宮組織石蠟切片脫蠟、復(fù)水處理，然后嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行組織切片標(biāo)記染色。滴加2%蛋白酶K(V/V)，室溫孵育15 min，去離子水漂洗2次(每次5 min)。3% H2O2(V/V)浸潤(rùn)5 min以滅火組織中的過(guò)氧化氫酶，去離子水漂洗1 min。滴加50 μL混合標(biāo)記試劑，濕盒中37℃孵育1 h，然后加入100 μL反應(yīng)終止液，PBS漂洗2次，每次2 min。切片上滴加50 μL抗體液，濕盒中37℃孵育30 min，PBS漂洗2次。滴加50 μL Strep-HRP液，濕盒中室溫孵育10 min，PBS漂洗2次，然后加入100 μL DAB液顯色3 min，去離子水漂洗2次，每次2 min。1%甲基綠復(fù)染30 s，然后梯度酒精脫水、二甲苯浸潤(rùn)透明、封片，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。在×200鏡下每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞的凋亡率，每組計(jì)數(shù)6個(gè)樣本。

1.2.5 子宮組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因和caspase-3 mRNA表達(dá)檢測(cè)

TRIzol試劑盒提取子宮組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。熒光定量PCR法檢測(cè)GRP78、PERK、CHOP和eIF2α mRNA表達(dá)水平。目的基因引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 20 s，45個(gè)循環(huán)。用2-△△CT值計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。每組檢測(cè)6個(gè)樣本。

表1 熒光定量PCR目的基因引物序列Table 1 Primer sequences of target genes for Real-Time PCR

1.2.6 子宮組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)檢測(cè)

提取子宮組織中的總蛋白，并用BCA試劑盒測(cè)定樣品蛋白含量。取25 μg蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，將目的蛋白分別轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉1.5 h，加入GRP78一抗(1∶200)、PERK一抗(1∶500)、eIF2α一抗(1∶500)、CHOP一抗(1∶300)、cleaved caspase-3一抗(1∶500)、β-actin一抗(1∶3000)，4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗(1∶5000)室溫孵育90 min，ECL發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像并分析。每組檢測(cè)6個(gè)樣本。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 子宮組織病理學(xué)改變

不同劑量PM2.5暴露后，雌鼠子宮組織的病理學(xué)改變見(jiàn)圖1。對(duì)照組可觀察到正常的子宮內(nèi)膜單層柱狀上皮細(xì)胞，且排列比較緊密和結(jié)構(gòu)完整的腺體；同時(shí)固有層中含有豐富的基質(zhì)細(xì)胞(圖1A)。低劑量暴露組子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生不同程度的萎縮，細(xì)胞間隙增大，且少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)空泡化；腺體細(xì)胞同樣發(fā)生萎縮變薄(圖1B)。高劑量組子宮內(nèi)膜上皮進(jìn)一步萎縮，空泡化細(xì)胞增多；腺體細(xì)胞萎縮更嚴(yán)重(圖1C)。

2.2 子宮組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

注：白色箭頭：空泡化的上皮細(xì)胞；黑色箭頭：萎縮的腺體。圖1 子宮組織病理學(xué)改變(×400)Note. White arrow, vacuolated epithelial cells. Black arrow, atrophic glands.Figure 1 Pathological changes in the uterine tissues(×400)

鏡下觀察組織細(xì)胞如發(fā)生凋亡會(huì)被TUNEL染成深褐色(見(jiàn)圖2)。對(duì)照組大鼠子宮組織細(xì)胞的凋亡率為(9.93±1.66)%，低劑量暴露組子宮組織細(xì)胞凋亡率為(29.40±6.96)%。與對(duì)照組相比，低劑量暴露組細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。高劑量暴露組細(xì)胞凋亡率為(43.58±8.23)%，其凋亡率明顯高于對(duì)照組(P<0.01)和低劑量組(P<0.05)。

注：黑色箭頭：凋亡細(xì)胞。圖2 TUNEL凋亡檢測(cè)結(jié)果(×200)Note. Black arrows, apoptotic cells.Figure 2 Detection of apoptosis in the uterine tissues(TUNEL staining,×200)

2.3 PM2.5對(duì)子宮組織GRP78、PERK、eIF2α、CHOP mRNA表達(dá)水平的影響

子宮內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖3。與對(duì)照相比，低劑量和高劑量PM2.5暴露組大鼠子宮GRP78、PERK、eIF2α、CHOP mRNA表達(dá)量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

與低劑量暴露組相比，高劑量暴露組中GRP78、PERK mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；CHOP和eIF2α表達(dá)量雖高于低劑量暴露組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注: 與對(duì)照組相比，aP<0.05；與低劑量暴露組相比，bP<0.05。圖3 PM2.5對(duì)GRP78、PERK、CHOP和eIF2α mRNA表達(dá)的影響Note. Compared with the control group, aP <0.05. Compared with the L-Exp group,bP <0.05.Figure 3 Effects of PM2.5 on the mRNA expressions of GRP78, PERK, CHOP and eIF2α

2.4 PM2.5對(duì)子宮組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響

短期PM2.5暴露后，低劑量和高劑量暴露組大鼠子宮中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、PERK、eIF2α、CHOP的蛋白表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)(圖4A-D)。與低劑量暴露組相比，高劑量暴露組中GRP78、PERK和eIF2α蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；CHOP表達(dá)量雖高于低劑量暴露組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

與對(duì)照組相比，低劑量和高劑量暴露組子宮中cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4E)。

注： 與對(duì)照組相比，aP<0.05；與低劑量暴露組相比，bP<0.05。圖4 PM2.5對(duì)子宮內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響Note. Compared with the control group, aP <0.05. Compared with the L-Exp group,bP <0.05.Figure 4 Effects of PM2.5 on the expression of protein of endoplasmic reticulum stress and cleaved caspase-3

3 討論

研究指出，隨著空氣污染的持續(xù)，空氣污染相關(guān)疾病的發(fā)病率和死亡率將不斷升高，到2050年時(shí)每年將有660萬(wàn)人死于空氣污染相關(guān)疾病[11]。越來(lái)越多的研究顯示，孕期暴露PM2.5對(duì)胎兒的發(fā)育和分娩產(chǎn)生不良的影響[1-2,12-13]。Son等[14]的研究指出，PM2.5暴露可使新生兒死亡率升高2.66倍。另有研究結(jié)果顯示，妊娠期暴露PM2.5僅對(duì)新生兒出生體重有明顯影響，但對(duì)妊娠周期沒(méi)有影響，不會(huì)造成新生兒早產(chǎn)(OR=0.86)[15]。但也有研究結(jié)果卻顯示PM2.5對(duì)妊娠結(jié)局沒(méi)有影響[16]或影響非常有限[17]。目前PM2.5的生殖毒性以及其對(duì)妊娠結(jié)局影響的研究結(jié)果存在差異性和不一致性的原因可能與調(diào)查對(duì)象所處妊娠時(shí)期、暴露PM2.5濃度和時(shí)長(zhǎng)以及不同地區(qū)PM2.5所含化學(xué)成分不同等有關(guān)。雖然我們?cè)缙诘膶?shí)驗(yàn)證實(shí)，PM2.5暴露對(duì)妊娠結(jié)局有不良影響[3]，但目前PM2.5生殖毒性的作用機(jī)制還不太清楚。

目前關(guān)于空氣中PM2.5對(duì)機(jī)體損傷效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)大多是急性毒性實(shí)驗(yàn)，為了研究更長(zhǎng)時(shí)間PM2.5暴露的毒性作用，本次實(shí)驗(yàn)將SD雌鼠的暴露時(shí)間延長(zhǎng)為30 d的短期暴露，從而觀察PM2.5對(duì)雌鼠子宮損傷效應(yīng)。PM2.5短期暴露后，雌鼠子宮組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的病理?yè)p傷變化，造成子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞萎縮，細(xì)胞間隙增大，且細(xì)胞出現(xiàn)空泡化；同時(shí)腺體也出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象(見(jiàn)圖1)，由此結(jié)果可見(jiàn)空氣中PM2.5短期暴露對(duì)子宮組織結(jié)構(gòu)有損傷，PM2.5具有生殖毒性。

已有研究證實(shí)PM2.5可通過(guò)活化T-細(xì)胞免疫蛋白和TIM蛋白，進(jìn)而誘發(fā)肺組織凋亡[18]。Yang等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞暴露PM2.5后，細(xì)胞中的氧化應(yīng)激水平升高，觸發(fā)bcl-2-bax-caspase-3凋亡信號(hào)，進(jìn)而誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡。由此可見(jiàn)PM2.5可通過(guò)多途徑誘導(dǎo)組織細(xì)胞發(fā)生凋亡。本次研究中我們采用TUNEL法檢測(cè)雌鼠短期暴露PM2.5后子宮組織細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低劑量和高劑量PM2.5暴露組細(xì)胞凋亡率均明顯高于對(duì)照組。caspase-3是caspase家族中具有重用凋亡調(diào)控重用的蛋白，也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路下游重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，而cleaved caspase-3蛋白是反映凋亡的標(biāo)志蛋白。本實(shí)驗(yàn)中為了驗(yàn)證子宮細(xì)胞凋亡的發(fā)生，我們同時(shí)檢測(cè)了子宮cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低劑量和高劑量PM2.5暴露組子宮cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(結(jié)果見(jiàn)圖4E)，與TUNEL檢測(cè)結(jié)果相一致。由以上結(jié)果可知短期暴露PM2.5可誘導(dǎo)子宮細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而推測(cè)PM2.5生殖損傷作用可能與其誘發(fā)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不僅是合成和分泌蛋白的場(chǎng)所，同時(shí)還可介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路[20]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能混亂會(huì)使未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白堆積于細(xì)胞內(nèi)，并誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。過(guò)強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答反應(yīng)(UPR)，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。UPR主要受到跨膜蛋白如PERK、肌醇酶1(IRE1)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)調(diào)控。這些跨膜蛋白通常是以與GRP78結(jié)合的復(fù)合形態(tài)存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。當(dāng)未折疊蛋白過(guò)度堆積時(shí)，GRP78會(huì)與跨膜蛋白分離后與未折疊蛋白結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR[21]。PERK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種感受蛋白，在UPR初期可以調(diào)控蛋白的合成減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程中，PERK與GRP78分離后，進(jìn)而增加促凋亡蛋白CHOP的表達(dá)，最終活化caspase-3從而激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡[22]。PERK- eIF2α-CHOP信號(hào)通路是重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通路。Laing等[5]研究發(fā)現(xiàn)PM2.5通過(guò)PERK-eIF2α-CHOP信號(hào)通路介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)肺和肝臟組織細(xì)胞凋亡。為了探究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在PM2.5誘導(dǎo)子宮組織凋亡中的作用，本實(shí)驗(yàn)中我們檢測(cè)了PERK- eIF2α-CHOP信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)情況。雌鼠暴露PM2.5后，子宮中GRP78、PERK、eIF2α和CHOP在mRAN和蛋白水平的表達(dá)水平均明顯升高(結(jié)果見(jiàn)圖2和3)，由此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知短期暴露PM2.5可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路中GRP78、PERK、eIF2α和CHOP蛋白表達(dá)水平升高，激活PERK- eIF2α-CHOP信號(hào)通路。

綜合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)短期暴露PM2.5對(duì)子宮的損傷作用可能與PERK- eIF2α-CHOP信號(hào)通路介導(dǎo)子宮組織發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并誘導(dǎo)子宮組織細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)。但本次實(shí)驗(yàn)中未對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中其他信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行檢測(cè)，不能確定短期暴露PM2.5是否會(huì)通過(guò)其他信號(hào)通路誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，因而在之后的實(shí)驗(yàn)中還需進(jìn)一步驗(yàn)證。