朱華，李卓，蘇磊，郭亞茜，杜曉鵬，袁建松，秦川*

(1. 衛(wèi)健委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心， 北京 100021； 2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 阜外心血管醫(yī)院，北京 100037)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病，是一種非常常見的心血管疾病。截止到2016年的數(shù)據(jù)顯示，我國城鄉(xiāng)居民因冠心病死亡173.6萬例[1]。冠心病是一種遺傳因素與環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的慢性復(fù)雜性疾病。在遺傳因素方面，有文獻報道通過全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)了46個與冠心病相關(guān)的危險基因，占冠心病遺傳因素的10.6%，并且這些因素只與脂質(zhì)和血壓相關(guān)且穩(wěn)定性高，不易受飲食、性別、年齡和藥物的影響[2]，從而使危險基因較難成為預(yù)防治療冠心病的靶點。腸道菌群作為環(huán)境因素的重要組成部分越來越受到研究者重視。直接利用人進行腸道菌群研究存在倫理學(xué)限制，動物模型是研究腸道菌群與宿主健康與疾病關(guān)系是必不可少的手段。由于實驗動物腸道菌群組成及代謝活性與人存在顯著差異，因此將動物體內(nèi)實驗結(jié)果外推到人不是完全可靠的。以無菌(germ free mice, GF)小鼠為研究對象通過糞菌移植方式建立人源菌群(human flora-associated, HFA)動物模型，其微生物背景清晰，可有效控制遺傳基因、腸道微生物、飲食、性別年齡等因素造成的混雜性偏倚[3-4]。本研究通過灌胃方式給無菌小鼠接種冠心病患者的新鮮糞便懸液建立冠心病 HFA 動物模型，為探索腸道菌群在冠心病發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

本實驗室自己繁育的無菌雌性C57BL/6J小鼠28只，飼養(yǎng)于專用無菌隔離器，設(shè)施合格證號：【SYXK(京)2018-0019】。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度21～25℃，濕度40%～70%，光照周期明暗比12 h:12 h。動物自由攝入經(jīng)50 kGy60Co γ射線輻照消毒的定制無菌小鼠飼料。實驗中使用的飲水、墊料、鼠盒、水瓶、灌胃針等均經(jīng)過126℃，30 min的高溫高壓滅菌處理。本實驗已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會(IACUC)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號：ZH17001。

1.1.2 試劑與儀器

抗體芯片檢測試劑：儀器校準(zhǔn)試劑盒Bio-Plex Validation Kit (Bio-Rad)；Bio-Plex Calibration Kit (Bio-Rad)。檢測試劑盒Bio-Plex Pro Mouse Cytokine GrpⅠPanel 23-plex(貨號M60009RDPD)。主要儀器：懸液微珠芯片平臺，Bio-Plex MAGPIX System (Bio-Rad)。組織脫水機、石蠟包埋機、石蠟切片機(德國Leica)、IQ5PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 志愿者信息

采集2位冠心病患者、1位健康志愿者的新鮮糞便用于建立HFA模型(表1)。冠心病及健康志愿者均來自北京，為典型非素食中國飲食，體檢、血相正常；健康志愿者及冠心病患者的消化系統(tǒng)無其它器質(zhì)性疾病；消化道未進行過手術(shù)；無酗酒史、糖尿病及其它影響腸道菌群的問題；取樣前8周未服用處方藥、益生菌、抗生素、非甾體類藥物。冠心病患者符合世界衛(wèi)生組織/國際心臟病學(xué)會制定的冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。

表1 實驗志愿者信息Table 1 General information of the volunteers

1.2.2 模型建立

8周齡雌性無菌 C57BL/6J 28只，分為健康對照組(CON)與冠心病(CAD)組，每組14只。收集3位志愿者清晨第1次排出的新鮮糞便，無菌、厭氧條件下稱量1 g加入100 mL 0.1 mol/L PBS (pH 7.2)緩沖液，振蕩混勻，制成糞便菌懸液待用。分別向2組的每只無菌小鼠體內(nèi)經(jīng)口灌喂0.4 mL糞便懸液，建立冠心病人源菌群動物模型。

1.3 檢測指標(biāo)

動物每周稱體重，在糞菌移植6周、10周后每組分別安樂7只動物，進行以下指標(biāo)的檢測：

1.3.1 腸道菌群16S rDNA的檢測

動物安樂死前在隔離器內(nèi)采集糞便，-80℃冰箱冷凍保存。按參考文獻[6]的方法進行基因組DNA提取和PCR擴增文庫構(gòu)建、測序及生物信息學(xué)分析。

1.3.2 血液學(xué)指標(biāo)：

動物用舒泰(25 mg/kg)麻醉后腹主動脈取血，取血結(jié)束剪斷腹主動脈放血將動物安樂死。血液3000 r/min離心10 min取上清，樣品送北京中同藍博臨床檢測有限公司，采用比色法進行TG、TC、LDL-C、高密度脂蛋白(HDL-C)、LDH、CK的檢測。

1.3.3 細胞因子檢測

血液用10 000 r/min離心10 min，取上清。使用 Luminex抗體芯片技術(shù)檢測血清中與粥樣硬化斑塊形成相關(guān)的細胞因子：IL-1β、 IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、INF-γ、IL-10、 IL-12p70、TNF-α的濃度變化。

1.3.4 組織病理學(xué)

動物安樂死后，打開胸腔，取出心臟，自升主動脈處將心臟與主動脈分離并切除心臟的下半部分，用PBS洗凈殘血后4%中性甲醛固定進行HE染色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 動物一般情況

在整個動物實驗過程中，模型組和對照組動物小鼠精神良好、毛色光滑、攝食飲水正常，體重平穩(wěn)增長。從第5周開始，CAD組動物體重增長加快，與CON組比較差異有顯著性(P< 0.05)(圖1)。

2.2 腸道菌群16S rDNA檢測結(jié)果

2.2.1 腸道菌群多樣性分析

根據(jù)OTUs代表序列與數(shù)據(jù)庫注釋文件對比，在 97%(種)水平上進行OTUs 劃分，CAD組在造模后6 周和10周時所獲得的OTUs數(shù)均減少，與CON組比較差異有顯著性(P<0.05)。Shannon指數(shù)大、Simpson指數(shù)小表示腸道菌群的多樣性強，CAD組的Shannon指數(shù)在造模后兩個時間點均降低(P<0.05，P<0.01)，Simpson指數(shù)均升高(P<0.05，P<0.01)，與CON組比較差異有顯著性。ACE和Chao1指數(shù)大表示菌群豐度高，CAD組的ACE和Chao1指數(shù)在造模后兩個時間點的數(shù)值均降低(P<0.05)，與CON組比較差異有顯著性(表2)。

2.2.2 腸道菌群在門和屬水平上的構(gòu)成

在造模6周和10周兩個時間點CON組reads主要分布在以下8個門：厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、梭桿菌門(Fusobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、藍藻菌門(Cyanobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)。

圖1 體重變化Figure 1 Body weight change in CON groups and CAD groups

表2 模型組與對照組腸道菌群α-多樣性分析指數(shù)比較Table 2 Comparison of the α-diversity indexes of gut microbiota between CON groups and CAD

組別GroupsSimpsonACE造模6 周6 weeks after gavage造模10周10 weeks after gavage造模6 周6 weeks after gavage造模10周10 weeks after gavage對照組Control group130.00±17.20128.70±12.20219.33±22.29209.37±35.24模型組CAD group1114.20±12.50101.60±11.04177.31±16.42171.24±19.17P值P value0.0470?0.0000??0.0132?0.0124?

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

造模6周時，CAD組厚壁菌門、軟壁菌門豐度降低(P<0.05)，與對照組比較差異有顯著性。擬桿菌門、疣微菌門豐度升高(P<0.01)，與對照組比較差異有顯著性。造模10周時，CAD組厚壁菌門豐度降低(P<0.01)，與對照組比較差異有顯著性。擬桿菌門、疣微菌門豐度升高(P<0.01)，與對照組比較差異有顯著性(圖2)。

在屬水平，對相對豐度較高的菌株進行分析，造模6周時擬桿菌屬(Bacteroides)、Akkermansia菌屬相對豐度增高(P<0.01)，Blautia菌屬、Parasutterella菌屬相對豐度降低(P<0.05，P<0.01)，與對照組比較差異有顯著性。造模10周時擬桿菌屬(Bacteroides)、Akkermansia菌屬相對豐度增高(P<0.01)，腸桿菌屬(Lactobacillus)、Blautia菌屬、Parasutterella菌屬相對豐度降低(P<0.05，P<0.01)，與對照組比較差異有顯著性(圖3)。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。圖2 腸道菌群在門水平上的構(gòu)成Note. Compared with the control group，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001.Figure 2 Relative abundance of the bacteria in gut microbiota at phylum level in the CON and CAD groups

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。圖3 腸道菌群在屬水平上的構(gòu)成 Note. Compared with the control group，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001.Figure 3 Relative abundance of the bacteria in gut microbiota at genus level in the CON and CAD groups

2.2.3 β-多樣性分析

β-多樣性研究是使用 Weighted Unifrac 距離來衡量組間相異系數(shù)，此系數(shù)越大表示組間物種多樣性的差異越大。分析結(jié)果顯示，CAD組在建模 6周、10周時的Weighted Unifrac 距離分別為0.658、0.681。表明CAD組與CON組在微生物物種構(gòu)成方面存在顯著性差異(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4A)。CAD組、CON組的腸型分布在不同區(qū)域，同一組的不同階段則分布在相同區(qū)域(圖4B)。

2.3 血液學(xué)指標(biāo)

CAD組小鼠在建模6周和10周時，血液中TG(P<0.05，P<0.01，圖5A)，TC(P<0.05，圖5B)，LDH(P<0.01，P<0.0001，圖5E)和CK(P<0.01，P<0.05，圖5F)值均升高，與CON組比較差異有顯著性。LDL-C在建模6周時升高(P<0.05)，與CON組比較差異有顯著性，10周時未見差異有顯著性(圖5D)。HDL-C在兩個時間點均未見差異有顯著性(圖5C)。

圖4 β-多樣性分析結(jié)果Figure 4 β-diversity analysis of the CON and CAD groups

注：與對照組比較，*P<0.05，** P<0.01,****P<0.0001。圖5 血脂和心肌酶標(biāo)檢測結(jié)果Note. Compared with the control group, *P<0.05，** P<0.01,****P<0.0001.Figure 5 Detection of the serum lipid levels and myocardial enzymes in the CON and CAD groups

2.4 細胞因子檢測

結(jié)果顯示，與斑塊形成、進展相關(guān)的細胞因子中，IL-6 在建模6周時濃度升高(P< 0.05)，10周時減低(P< 0.0001，圖6A)；IL-10在建模10周時濃度降低(P< 0.05，圖6E)； IL-2、IL-4、IL-5、IL-1β 在建模10周時濃度升高(P< 0.0001，P< 0.05，P< 0.0001，P< 0.01，圖6B,C,D,F)，與CON組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。IL-12p70、TNF-α、INF-γ在建模6周和10周時差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖6G,H,I)。

注：與對照組比較，*P<0.05，** P<0.01,****P<0.0001。圖6 細胞因子檢測結(jié)果Note. Compared with the control group, *P<0.05，** P<0.01,****P<0.0001.Figure 6 The serum levels of cytokines in the CON and CAD groups

圖7 心臟組織的病理學(xué)改變Figure 7 Histopathological changes in the mouse myocardial tissues of the CON and the CAD groups

2.5 心臟組織病理學(xué)

在建模6周(圖7A,B)和10周(圖7C,D)時，CON組及CAD組小鼠胸主動脈無斑塊形成，血管內(nèi)膜平滑，未見斷裂增厚，內(nèi)皮細胞排列整齊，中膜厚度正常，平滑肌細胞排列整齊，均未見泡沫細胞形成等動脈粥樣硬化改變。

3 討論

根據(jù)Hazenberg等[7]、Che等[8]的研究結(jié)果,在接種人腸道菌群2周后，HFA 動物腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)豐度與志愿者菌群幾乎完全一致，并且至少保持5周穩(wěn)定不變。所以本研究選擇在灌胃接種志愿者糞便菌懸液6周和10周后，收集CON組和CAD組小鼠的新鮮糞便、血液、組織樣品進行檢測。通過對腸道菌群β-多樣性進行分析，CON組小鼠與健康志愿者分布在同一象限、CAD組小鼠與冠心病患者分布在同一象限，而健康志愿者及接種了健康志愿者腸道菌群的小鼠與冠心病患者及接種了患者菌群的小鼠分布在不同區(qū)域，且Weighted Unifrac 距離差異有顯著性。α-多樣性分析結(jié)果，CAD組的Shannon指數(shù)在兩個時間點均降低，Simpson指數(shù)均升高，ACE和Chao1指數(shù)在造模后6周和10周兩個時間點的數(shù)值均降低，與CON組比較差異有顯著性。表明志愿者腸道菌群在無菌小鼠體內(nèi)成功定植，并可形成復(fù)雜且與志愿者菌群相似的微生物區(qū)系，且CON組、CAD組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與豐度差異顯著。

血脂是動脈血管壁發(fā)生病變的基礎(chǔ)物質(zhì)，高血脂既是冠心病的獨立危險因素，也是其病理表現(xiàn)，其機理可能與心肌受損后泵血功能下降導(dǎo)致的血液流變學(xué)改變相關(guān)[9-11]。Fu等[12]的研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門和擬桿菌門的豐度與體質(zhì)量指數(shù)、甘油水平、高密度脂蛋白水平呈有相關(guān)性。Velagapudi等[13]通過動物實驗證實腸道菌群可影響小鼠的能量代謝和血脂水平。我們的實驗中，2名冠心病志愿者的體質(zhì)量指數(shù)、血脂均高于正常值。糞菌液接種到無菌小鼠腸道后，CAD組動物體重在移植后5周上升幅度增加，小鼠血清中的TG、TC、LDL-C與CON比較顯著升高。厚壁菌門和擬桿菌門是CON組與CAD組腸道菌群中豐度差異最大的兩個門，結(jié)果與已有的研究報道相符。

動脈粥樣硬化是一個慢性的炎癥發(fā)展過程[14]，其機制目前較為認同的是損傷反應(yīng)學(xué)說及在此基礎(chǔ)上發(fā)展出的炎癥學(xué)說，在這個過程里始終存在各種炎癥細胞和大量炎癥介質(zhì)參與[15-16]。IL-6作為心臟不良事件的獨立危險因素標(biāo)志物參與易損斑塊的炎癥全程[17]。IL-10的作用主要是在免疫應(yīng)答進行負調(diào)節(jié)，它可以通過直接抑制免疫細胞的功能實現(xiàn)免疫抑制[18]，也可以通過控制IL-1β產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)避免組織過度損傷[19]。IL-2與IL-2受體α亞基結(jié)合后可調(diào)節(jié)T淋巴細胞的活化，而活化的T淋巴細胞能分泌趨化因子增強炎癥反應(yīng)，從而促進動脈粥樣硬化斑塊的形成及進展[20]。實驗結(jié)果顯示，移植冠心病患者的腸道菌群后，小鼠血清中IL-6，IL-2升高，IL-10降低而被IL-10調(diào)節(jié)的IL-1β升高，驗證了上述研究結(jié)果。IL-4參與粥樣硬化的機制比較復(fù)雜，目前尚無定論。我們的結(jié)果顯示移植6周時IL-4已經(jīng)升高但無顯著性差異，10周時顯著升高，說明IL-4參與的體液免疫可能促進動脈粥樣硬化的發(fā)展。

上述實驗結(jié)果證明移植冠心病患者腸道菌群10周后HFA小鼠的心肌細胞和血管內(nèi)皮細胞已發(fā)生功能上的損傷，導(dǎo)致血脂、細胞因子的含量發(fā)生變化。但由于斑塊形成是一個復(fù)雜且緩慢的過程，移植10周時心肌細胞和血管內(nèi)皮細胞還未發(fā)生器質(zhì)性改變，故HE染色中未發(fā)現(xiàn)泡沫細胞浸潤等斑塊形成的病理學(xué)變化。

理想的動物模型應(yīng)具備以下特點：發(fā)病過程和機制盡量接近臨床情況；能夠?qū)ο嚓P(guān)藥物或治療手段作出客觀評價；模型的制備應(yīng)操作簡便、經(jīng)濟、可重復(fù)性高[21]。本研究利用糞菌移植方法建立了冠心病HFA小鼠模型，除腸道菌群的結(jié)構(gòu)與豐度與人類似外，體重、血脂、細胞因子含量也出現(xiàn)了與臨床類似的改變，為研究腸道菌群與冠心病關(guān)系研究提供了更多可選擇的動物模型。