劉林，李弘，王宇紅，任衛(wèi)瓊，藺曉源，李蘇，柏正平1,*

(1. 湖南省中醫(yī)藥研究院， 長沙 410013； 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙 410007； 3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)， 長沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)創(chuàng)新中心，長沙，410007)

高血壓是我國常見的心血管疾病之一，長期處于高血壓狀態(tài)容易引發(fā)心、腦、腎和血管等靶器官不同程度的損害，嚴重危害人類的健康[1-2]。本課題組以與人類原發(fā)性高血壓相似的動物—自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)和繼發(fā)性高血壓動物—兩腎一夾(2K1C)高血壓大鼠(renal hypertensive rats，RHR)為研究對象。采用具有平肝熄風(fēng)、清熱活血、利濕化痰之功效天麻芎苓止眩片(Tianma Xiongling Zhixuan Tablet，TXZT)進行干預(yù)，比較藥物對兩種高血壓模型大鼠的血壓、生化功能等指標的影響。比較探討TXZT對SHR大鼠和RHR大鼠的降壓效應(yīng)和改善高血壓病理進展的特點，闡明其內(nèi)在防治規(guī)律，為抗高血壓中藥新藥開發(fā)研究動物模型選擇和臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠，雄性，8～10周齡，體重180～220 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司實驗動物中心【SCXK(湘)2016-0002】。SPF級SHR大鼠，雄性，8～10周齡，體重180～200 g，購于北京維通利華實驗動物中心【SCXK(京)2016-0006】。SPF級WKY大鼠，雄性，8～10周齡，體重180～200 g，購于北京維通利華實驗動物中心【SCXK(京)2016-0006】。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心【SYXK(湘)2015-0003】，實驗操作過程中符合實驗動物倫理學(xué)要求(倫理審批號：ZYFY20161012)。

1.1.2 試劑與儀器

TXZT(每片0.46 g)，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科制備，批號20170315，TXZT成人臨床日用量為每日5.52 g。厄貝沙坦片(每片75 mg)，揚子江藥業(yè)集團北京海燕藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號16112152，厄貝沙坦片成人臨床日用量為每日300 mg。

尿素氮(BUN)，批號171024；肌酐(Crea)，批號170952；肌酸激酶(CK)，批號170952，乳酸脫氫酶(LDH)，批號170952；以上試劑為北京中生北控工程公司產(chǎn)品。

BP2010無創(chuàng)血壓檢測儀，北京軟隆科技有限責(zé)任公司；CA-500血液分析儀，山東蘭橋醫(yī)學(xué)科技有限公司產(chǎn)品；RT-1904C型半自動生化分析儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司產(chǎn)品；顯微鏡攝影系統(tǒng)為Olympus產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 對RHR模型大鼠作用的研究

(1) 2K1C法造模

動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，以無創(chuàng)血壓檢測儀檢測大鼠血壓，剔除血壓異常者，按照血壓隨機分組，隨機抽取10只大鼠為為假手術(shù)組，其余大鼠均按照2K1C造模方法進行如下手術(shù)造模，造模后連續(xù)4周測定血壓，以收縮壓≥140 mmHg，且較術(shù)前血壓超出20 mmHg者為造模成功。假手術(shù)組大鼠除不結(jié)扎腎動脈外，其余手術(shù)操作均同上。

(2)分組及給藥

將成模大鼠按照收縮壓隨機分為5組，每組10只。分別為：模型對照組、厄貝沙坦對照組、天麻芎苓止眩片組高、中、低劑量組。模型組灌胃蒸餾水，陽性藥組給予厄貝沙坦27 mg/kg；TXZT高、中、低劑量組分別按2.0 g/kg、1.0 g/kg、0.5 g/kg大鼠灌胃給藥；每天給藥1次，10 mL/kg，連續(xù)給藥4周。

(3)指標檢測

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 細胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細胞，PBS清洗2次，每管細胞樣品中加入 Binding Buffer 500 μL輕輕重懸細胞，加入AnnexinV-FITC 5 μL 混勻，加入 PropidiumIodide 5 μL，混勻，室溫避光溫育15 min，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。數(shù)據(jù)結(jié)果中包含4個象限，其中上左象限(UL)表示碎片或損傷細胞，上右象限(UR)表示晚期凋亡細胞，下左象限(LL)表示正常細胞，下右象限(LR)表示早期凋亡細胞。

①血壓的測定：分別在給藥前及藥后各周，采用尾動脈測壓法測量大鼠收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)。②LVMI的測定：給藥4周后，大鼠處死后迅速取出心臟，沿房室環(huán)剪去心房，沿室間隔剪去右心室，保留室間隔、左心室肌，以濾紙吸干后稱重，計算左室質(zhì)量與體重之比，以左室質(zhì)量(LVM) 與體重之比作為左心室指數(shù)(LVMI)，計算公式：LVMI=LVM/BW。③生化指標檢測：末次給藥后，實驗動物禁食12 h，麻醉后腹主動脈采血，不抗凝，離心(4500 r/min，10 min)分離血清，-80℃保存?zhèn)溆?。嚴格按照試劑盒說明書的步驟操作檢測生化指標。④病理檢查大鼠取血后，迅速取左心室、腎、腦及主動脈，清洗干凈，置于4%多聚甲醛中固定，浸蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.2 對SHR模型大鼠作用的研究

(1)分組及給藥

將50只SHR大鼠按照收縮壓值隨機分為：模型組、厄貝沙坦片組、天麻芎苓止眩片組高、中、低劑量組，每組10只，另設(shè)10只WKY大鼠為正常組。厄貝沙坦片組大鼠給予厄貝沙坦片27 mg/kg；TXZT高、中、低劑量組大鼠分別按2.0 g/kg、1.0 g/kg、0.5 g/kg大鼠給予藥物；模型組和正常組分別給予等量蒸餾水；每天給藥1次，10 mL/kg，灌胃給藥，連續(xù)給藥4周。

(2)指標檢測 SHR大鼠收縮壓(systolic blood pressure，SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)，LVMI指數(shù)，生化及病理指標檢測及方法同RHR大鼠實驗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 對不同高血壓模型大鼠SBP和DBP的影響

2.1.1 對RHR大鼠的影響

2.1.2 對SHR大鼠的影響

與SHR模型組比較，天麻芎苓止眩片高、中、低劑量組大鼠給藥后各周的收縮壓明顯降低，第2、3、4周的舒張壓明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01 或 0.05)；天麻芎苓止眩片中、低劑量組第3、4周的舒張壓明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01 或 0.05)。(見圖3，圖4)

2.2 對兩種不同高血壓模型大鼠LVMI的影響

2.2.1 對RHR大鼠LVMI的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVM明顯增大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。其他各組LVM和LVMI差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。與模型組比較，其他各給藥組RHR大鼠LVM減輕，LVMI減小，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。(見圖5)

2.2.2 對SHR大鼠LVMI的影響

與WKY組比較，模型組及其他各組大鼠LVMI明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。其他各組LVM差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。與模型組比較，高劑量組LVM明顯減小，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，其他各給藥組SHR大鼠左心室LVM減輕，LVMI減小，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。(見圖6)

注：自身前后比較， *P< 0.05, **P< 0.01;與假手術(shù)組比較, ●P< 0.05, ●●P<0.01;與模型組比較，▲P< 0.05, ▲▲P< 0.01。下圖同。圖1 天麻芎苓止眩片對RHR大鼠SBP的影響Note. Self comparison, before and after drug administration， *P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the sham operation group, ●P< 0.05, ●●P< 0.01. Compared with the model group, ▲P<0.05, ▲▲P<0.01. The same in the following figure.Figure 1 Effect of TXZT on the systolic blood pressure in the RHR rats ± s, n=10)

圖2 天麻芎苓止眩片對RHR大鼠DBP的影響Figure 2 Effect of TXZT on the diastolic blood pressure in the RHR rats ± s, n=10)

2.3 對兩種不同高血壓模型大鼠心、腎功能生化指標的影響

2.3.1 對RHR大鼠心、腎功能生化指標的影響

如表1所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LDH、CK、CREA、BUN值顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01 或 0.05)。高、中、低劑量組大鼠CREA、BUN值顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，其他大鼠血常規(guī)指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。與模型組比較，高劑量組大鼠CK、CREA、BUN值顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義P< 0.01 或 0.05)。中劑量組大鼠LDH、CK、CREA、BUN值顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01 或 0.05)。低劑量組大鼠BUN值顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。其他給藥組生化指標值差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。提示，天麻芎苓止眩片有一定的改善RHR大鼠心、腎功能藥理作用。

注：自身前后比較，*P< 0.05,**P < 0.01;與WKY組比較,●P< 0.05,●●P< 0.01;與模型組比較,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01。下圖同。圖3 天麻芎苓止眩片對SHR大鼠SBP的影響Note. Self comparison, before and after drug administration, *P < 0.05, **P< 0.01. Compared with the WKY group,●P< 0.05, ●●P< 0.01. Compared with the model group, ▲P< 0.05, ▲▲P< 0.01. The same in the following figure.Figure 3 Effect of TXZT on the systolic blood pressure in the SHR rats ± s，n=10)

圖4 天麻芎苓止眩片對SHR大鼠DBP的影響Figure 4 Effect of TXZT on the diastolic blood pressure in the SHR rats ± s，n=10)

2.3.2 對SHR模型大鼠心、腎生化指標的影響

如表2所示，與WKY組比較，模型組大鼠LDH、CK值顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。其他各給藥組大鼠血常規(guī)指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。

與模型組比較，高、中、低劑量組大鼠CK、CREA、CREA、BUN值有一定降低，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。提示，與WKY組比較，SHR大鼠心功能生化指標存在明顯異常。天麻芎苓止眩片有一定的改善SHR大鼠心功能藥理作用趨勢。

2.4 對兩種不同高血壓模型大鼠靶器官的影響

2.4.1 對RHR大鼠心、腎、腦、主動脈病理形態(tài)的影響

HE染色病理學(xué)觀察，模型大鼠組與假手術(shù)組大鼠心、腎及主動脈存在一定的病理變化，主要表現(xiàn)左室心肌細胞肥大或部分消失,細胞橫徑增大，被纖維組織替代，并伴有炎性細胞浸潤。腎小動脈管壁增厚，管腔狹窄，腎小管及腎小球均出現(xiàn)不同程度的萎縮，同時伴有腎間質(zhì)纖維化。主動脈內(nèi)膜明顯增厚，肌纖維排列不整齊，粗細不一。腦組織未見明顯變化。經(jīng)過天麻芎苓止眩片治療4周后，心肌纖維排列較整齊，細胞橫徑大小差異不大，腎小管及腎小球萎縮程度減輕，主動脈內(nèi)膜完整、排列整齊。天麻芎苓止眩片能較好的改善RHR大鼠左心室、腎臟、血管病理結(jié)構(gòu)，對高血壓靶器官具有一定的保護作用。(見圖7)

2.4.2 對SHR大鼠心臟、腎、腦、主動脈病理形態(tài)的影響

給藥治療4周，病理檢查提示，WKY組大鼠血管內(nèi)膜完整，細胞排列整齊清晰、無明顯增生；模型組大鼠血管內(nèi)膜明顯損傷，不完整，明顯增厚；止眩片高劑量組大鼠血管病理改善，內(nèi)膜較光滑，排列較整齊復(fù)方，中劑量組大鼠血管內(nèi)膜輕損傷，平滑肌細胞增殖，低劑量組大鼠血管內(nèi)膜輕損傷，中膜增厚，平滑肌細胞增殖。(見圖8)

注：與假手術(shù)組比較,●P<0.05,●●P<0.01；與模型組比較，▲P< 0.05, ▲▲P< 0.01。圖5 天麻芎苓止眩片對RHR模型大鼠LVM及LVMI的影響Note. Compared with the sham operation group, ●P< 0.05, ●●P< 0.01. Compared with the model group, ▲P<0.05, ▲▲P<0.01.Figure 5 Effects of TXZT on the left ventricular mass and left ventricular mass index of the RHR rat models

注：與WKY組比較，●P<0.05, ●●P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05,▲▲P<0.01。圖6 天麻芎苓止眩片對SHR模型大鼠LVM及LVMI的影響Note. Compared with the WKY group, ●P<0.05,●●P<0.01. Compared with the model group, ▲P<0.05, ▲▲P<0.01.Figure 6 Effects of TXZT on the left ventricular mass and left ventricular mass index of SHR rat ± s，n=10)

表1 天麻芎苓止眩片對RHR大鼠心、腎功能生化指標的影響Table 1 Effects of TXZT on biochemical indexes of heart and kidney function in the RHR ± s，n=10)

注：與假手術(shù)組比較,●P< 0.05,●●P< 0.01;與模型組比較，▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

Note. Compared with the sham operation group,●P<0.05,●●P<0.01. Compared with the model group,▲P<0.05,▲▲P<0.01.

表2 對SHR模型大鼠心、腎功能生化指標的影響

注：與WKY組比較,●P< 0.05,●●P< 0.01; 與模型組比較，▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

Note. Compared with the WKY group,●P< 0.05,●●P< 0.01. Compared with the model group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

注：a，假手術(shù)組；b，模型組；c，厄貝沙坦組；d，止眩片高劑量組；e，止眩片中劑量組；f，止眩片低劑量組。圖7 RHR大鼠左心室(A)、腎(B)、腦(C)、主動脈(D)病理形態(tài)檢測(HE染色)Note. a, Sham operation group. b，Model group. c, Irbesartan group. d, High dose group. e，Medium dose group. f, Low dose group.Figure 7 Pathological changes of the left ventricle (A), kidney (B), brain (C) and aorta (D) in the RHR rats (HE staining)

注：a，WKY組；b，模型組；c，厄貝沙坦組；d，止眩片高劑量組；e，止眩片中劑量組；f，止眩片低劑量組。圖8 SHR大鼠左心室(A)、腎(B)、腦(C)、主動脈(D)病理形態(tài)檢測(HE染色)Note. a, WKY group. b，Model group. c, Irbesartan group. d, TXZT high dose group. e， TXZT medium dose group. f, Low Dose Group.Figure 8 Pathological changes of the left vntricle(A), kidney (B), brain (C) and aorta (D) in the SHR rats(HE staining)

3 討論

高血壓嚴重危害人類健康，長期處于高血壓狀態(tài)可造成心、腦、腎和血管等靶器官不同程度的損害。對應(yīng)于人類高血壓病理機制，高血壓大鼠模型也可分為兩大類：自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和繼發(fā)性高血壓大鼠模型(如：兩腎一夾型腎性高血壓大鼠(RHR)等)[3]。大鼠SHR從發(fā)病機制、并發(fā)癥、外周血管阻力變化、對鹽的敏感性等多方面來講，都與人類高血壓相似，是目前國際上公認的最接近人類原發(fā)性高血壓的動物模型，已廣泛應(yīng)用于原發(fā)性高血壓及抗高血壓藥物篩選[4-5]。兩腎一夾法高血壓大鼠是研究腎血管性高血壓最常用的模型，以腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)激活為主，是國際上常用的經(jīng)典的繼發(fā)性高血壓動物模型，在目前篩選降壓藥物中選用較多[6]。兩者相比，SHR大鼠心功能較RHR大鼠低；RHR大鼠腎組織腎素、血管緊張素Ⅱ(Angiotensin II，Ang II)及醛固酮較高，且腎性高血壓大鼠血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)mRNA的表達量較SHR大鼠的低；此外，RHR大鼠還有著竇性心動過緩、腎組織損傷等特點[7-9]。本課題組在采用RHR和SHR進行研究時發(fā)現(xiàn)，兩者血壓均呈上升趨勢，但是SHR大鼠的血壓上升的更高、更快。RHR大鼠血壓不穩(wěn)定，偏差大，造成這種現(xiàn)象的原因可能是因為左腎動脈結(jié)扎導(dǎo)致該側(cè)腎臟缺血，而另一側(cè)腎臟不觸及。在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)天麻芎苓止眩片能夠降低兩種大鼠模型的收縮壓和舒張壓；能夠明顯的減小SHR大鼠的LVMI值，但對RHR大鼠的效果不明顯；對于心腎功能，其可以很好的改善RHR的心腎功能，對SHR大鼠具有改善作用，但無統(tǒng)計學(xué)差異，可能是因為SHR大鼠早期的腎損傷不明顯。

長期處于高血壓狀態(tài)下，易導(dǎo)致患者心、腦、腎、血管等多靶點、多器官器質(zhì)性病變和功能性損害[10-11]。中醫(yī)藥防治高血壓病及其并發(fā)癥立足于整體辨證論治，可對其多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點進行調(diào)節(jié)，在降低血壓、減輕或逆轉(zhuǎn)靶器官損害、防止嚴重并發(fā)癥、改善臨床癥狀及提高患者生活質(zhì)量等方面均具有較好的作用[12-15]。本實驗使用的中藥天麻芎苓止眩片是由天麻、川芎等中藥組成的復(fù)方，具有平肝熄風(fēng)、清熱活血、利濕化痰的功效，臨床上主要用于治療高血壓病，眩暈耳鳴，頭痛頭脹等證者。研究發(fā)現(xiàn)，天麻的主要有效成分天麻素能夠改善其大中動脈管壁彈性[16]，改善血管內(nèi)皮功能，抗脂質(zhì)過氧化損傷，降低血壓等[17-18]；其地上部分能夠減慢心率使心輸出量減少，從而使動脈血流量降低，降低RHR血壓[19]；此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，天麻素可以改善心肌缺血/再灌注損傷從而保護心肌細胞[20]。川芎主要有效成分川芎嗪能夠顯著增加腎血流，延緩慢性腎損害；抑制血管內(nèi)皮細胞的分泌乳酸脫氫酶及丙二醛，減輕血管內(nèi)皮細胞的損傷程度；降低血壓[21]。通過本實驗發(fā)現(xiàn)天麻芎苓止眩片對SHR大鼠及RHR大鼠均具有良好的降血壓藥理效應(yīng)，且能夠減少心、腎、血管等靶器官的損害，而這種改善作用可能是通過川芎的腎保護作用，天麻的心肌細胞保護作用及改善大中動脈管壁彈性作用等不同中藥的綜合藥理作用來實現(xiàn)的，體現(xiàn)了中醫(yī)藥改善靶器官損傷治療高血壓的優(yōu)勢。

綜上所述，天麻芎苓止眩片對兩種不同高血壓大鼠模型均具有良好降壓藥理效應(yīng)。能夠?qū)⒚}壓差保持在一定的范圍，具有持續(xù)穩(wěn)定的調(diào)控血壓的藥理作用。對高血壓模型大鼠的心、腎靶器官損傷具有一定的保護作用，對中醫(yī)藥防治高血壓病臨床和實驗研究具有重要的指導(dǎo)意義。