鄭雙，譚偉江，李想，馬俊峰，任學(xué)聰，鄭凌云，王麗京，楊豐華*，黃韌*

(1. 廣東藥科大學(xué)，生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，血管生物學(xué)研究所，廣州 510006； 2. 廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510633)

高膽固醇血癥是心血管疾病的主要原因，與全球死亡率增加密切相關(guān)。研究表明，高膽固醇血癥可誘發(fā)左心室質(zhì)量增加和心臟病理性重構(gòu)[1-3]，其為不可逆轉(zhuǎn)的疾病，最終轉(zhuǎn)歸為心臟收縮功能損傷和心衰[4]。有研究表明其與能量生成障礙[5]和肌絲收縮調(diào)控相關(guān)[6]。

紫蘇籽油性提取物(PSO)含有豐富的α-亞麻酸(ALA)[7]。ALA為n-3多不飽和脂肪酸的一種，流行病學(xué)研究顯示從飲食中攝入的ALA具有顯著的心臟保護(hù)作用[8-9]。目前少有研究探索PSO對高膽固醇血癥患者心臟功能的影響，探究PSO對心臟的保護(hù)和作用機(jī)制具有重要意義。

載脂蛋白E敲除(ApoE-/-)小鼠具有高膽固醇水平，可發(fā)展類似于人類的動脈粥樣硬化病變[10]，另外有報道ApoE-/-小鼠心臟出現(xiàn)肥大性重構(gòu)[11-12]、纖維化[13]和功能障礙[14]，是一個適宜用于藥物治療研究的模型。本研究旨在利用ApoE-/-小鼠探索PSO在抗動脈粥樣硬化和保護(hù)心臟功能的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

40只3月齡ApoE-/-雄性小鼠(B6背景)，體重20～25 g，廣東藥科大學(xué)合作實驗室饋贈；10只3月齡B6雄性小鼠體重20～25 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心【SCXK (粵) 2013-0002】，所有小鼠均飼養(yǎng)于廣東省實驗動物監(jiān)測所SPF環(huán)境中【SYXK(粵)2016-0122】，溫度：22℃～25℃，濕度：50%～70%，晝夜明暗交替時間為12 h/12 h。所有操作符合廣東省實驗動物監(jiān)測所動物保護(hù)和使用委員會(IACUC)的要求。

1.1.2 試劑與儀器

阿托伐他汀(浙江新東港藥業(yè)，中國)，羧甲基纖維素鈉(阿拉丁，美國)，甲醇(阿拉丁，美國)，ATP測試盒(南京建成，中國)，Takara試劑盒(Takara，日本)，引物(生工，中國)，Triton X-100(Sigma，美國)，Pro-Q Diamond磷酸化蛋白凝膠染色試劑(賽默飛，美國)，氣相色譜(安捷倫GC-7820A，美國)，全自動生化分析儀(日立7080型，日本)，Vevo2100高分辨率超聲系統(tǒng)(Visual Sonics，加拿大)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

PSO成人劑量為每人4.5 g/d，小鼠劑量按體表面積折算，約為1000 mg/(kg·d)，經(jīng)預(yù)實驗確定使用劑量。將ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為4組，分別為ApoE-/-：0.5%羧甲基纖維素鈉;ApoE-/-+ 0.5 g/kg PSO：0.5 g/(kg·d) PSO;ApoE-/-+ 1.0 g/kg PSO：1.0 g/(kg·d) PSO;ApoE-/-+ Ato：2.1 mg/(kg·d) 阿托伐他汀(Ato)，PSO口服給藥8周。B6小鼠作為對照(WT組)，接受正常飲食，給予與ApoE-/-相同劑量的溶媒。

1.2.2 PSO的制備和組成

使用二氧化碳超臨界流體萃取(SFE-CO2)獲得PSO[15]。萃取壓力、溫度和CO2流速分別為20 MPa、40°C和30 L/h。使用氣相色譜分析PSO的脂肪酸組成[16]。PSO用甲醇酯化后提取脂肪酸甲酯，使用氣相色譜-火焰離子化檢測器(GC-FID)進(jìn)行分析，確定PSO的碘值、皂化值、非皂化物質(zhì)的量和酸值。

1.2.3 血清生化指標(biāo)測定

治療8周后動物禁食12 h，眼眶靜脈采血，經(jīng)3500 r/min、離心20 min取上清液，采用全自動生化分析儀及匹配試劑盒測量血清總膽固醇 (TC)、甘油三酯 (TG)、低密度脂蛋白 (LDL-C，)和高密度脂蛋白 (HDL-C)。

1.2.4 超聲心動圖和脈沖波多普勒測量

治療8周后使用Vevo2100高分辨率超聲系統(tǒng)和MS-550D探頭以左室短軸切面探測，采集B型和M型超聲圖；取心臟長軸切面，采用脈沖波多普勒測定經(jīng)主動脈血流壓力。測量舒張末期左室后壁厚度(LVPW；d)、收縮末期左室后壁厚度(LVPW;s)、收縮末期室間隔厚度(IVS;s)、舒張末期室間隔厚度(LVS;d)、收縮末期左室內(nèi)徑(LVID;s)、舒張末期左室內(nèi)徑(LVID;d)，計算射血分?jǐn)?shù)(EF)和短軸縮短率(FS)。

1.2.5 組織學(xué)分析

治療結(jié)束后處死小鼠，取心臟和主動脈，用4%多聚甲醛固定，HE染色后觀察主動脈根部和心肌，使用ImagJ軟件測量斑塊面積，使用公式計算斑塊面積百分比：斑塊面積%=動脈粥樣硬化病變面積/管壁面積。

1.2.6 ATP含量測定

50 mg心肌組織勻漿后經(jīng)3500 r/min、4℃離心10 min，取上清液使用試劑盒測定ATP含量。

1.2.7 qPCR分析

采用Trizol法提取心臟組織總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶PrimeScriptTMRT合成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測心臟重塑標(biāo)記基因(心鈉肽(ANP)、腦鈉肽(BNP)、β肌球蛋白重鏈(β-MHC))[17-19]和心肌能量代謝相關(guān)基因[20](過氧化物酶體增殖物激活受體α/γ(PPARα/γ)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子(PGC-1α)、核呼吸因子(NRF-1))的mRNA表達(dá)水平。引物序列見表1。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后使用2-ΔΔct比較法進(jìn)行分析。

表1 定量PCR引物Table 1 PCR primers

1.2.8 心肌絲磷酸化分析

心臟收縮是消耗ATP并由肌絲蛋白實施的一種活動，肌絲磷酸化水平可評估其活性狀態(tài)。本實驗使用勻漿器將心肌組織勻漿，經(jīng)12 000 r/min離心后去除上清液。沉淀物重懸于含有1%Triton X-100的裂解液裂解后離心獲得心肌絲，定量和變性后使用12%凝膠電泳分離肌球蛋白結(jié)合蛋白C(MyBP-C)、肌鈣蛋白T(TnT)、肌鈣蛋白I(TnI)、肌球蛋白輕鏈2(MLC2)，使用Pro-Q Diamond磷酸化蛋白染色試劑檢測肌絲蛋白的磷酸化水平，評估其活性狀態(tài)，考馬斯亮藍(lán)染料檢測上樣量，用激光掃描儀器掃描。使用Image J軟件分析條帶強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PSO的成分

PSO的成分見圖1。ALA是PSO中最豐富的脂肪酸，其次是油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸。PSO的脂肪酸譜包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸(表2)。

圖1 PSO成分分析Figure 1 The PSO component analysis

表2 PSO的理化特征Table 2 The physicochemical characteristics of PSO

2.2 PSO對血脂水平的影響

治療結(jié)束時，與WT組相比，ApoE-/-組血清TC、HDL-C和LDL-C水平顯著升高，PSO治療后與ApoE-/-組比較LDL-C和HDL-C水平有改善趨勢，但未見顯著差異。與ApoE-/-組相比，Ato組顯示小鼠血清脂質(zhì)水平均顯著降低(表3)。

表3 血清脂質(zhì)水平Table 3 Serum lipid levels ± s，n =10)

注：**P< 0.01, vs WT group;#P< 0.05, vs ApoE-/-。

Note.**P< 0.01, vs WT group;#P< 0.05, vs ApoE-/-.

2.3 PSO對主動脈壓的影響

主動脈血管彈性纖維HE染色顯示W(wǎng)T組中彈性內(nèi)膜的平滑肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，而ApoE-/-組管壁有斑塊沉積，泡沫細(xì)胞浸潤。與ApoE-/-組相比，PSO組和Ato組主動脈斑塊顯著減少，血管結(jié)構(gòu)相對完整 (圖2A，B)。脈沖多普勒結(jié)果顯示，ApoE-/-組主動脈壓顯著高于WT組，PSO和Ato治療后，升高的主動脈壓恢復(fù)到WT組的水平(圖2C)。

2.4 心肌組織的病理學(xué)觀察

HE染色顯示W(wǎng)T組心肌結(jié)構(gòu)正常，ApoE-/-組心肌纖維的解體、碎裂或丟失。與ApoE-/-組相比，PSO和Ato治療后心肌結(jié)構(gòu)顯著改善，心肌纖維整齊排列并且沒有顯著碎裂(圖3)。

2.5 PSO對心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響

與WT組小鼠相比，ApoE-/-組小鼠IVS; s和LVPW; s顯著降低，LVID; s和LVID; d顯著增加，表明心臟結(jié)構(gòu)異常(圖4A-E)，EF(57.93 ± 2.62% vs 71.27 ± 2.66%，P< 0.001)和FS(30.05 ± 1.65% vs 41.53 ± 2.14%，P< 0.001)顯著降低 (圖4A，F(xiàn)-G)，表明心臟功能障礙。與ApoE-/-組相比，PSO組的IVS; s和LVPW; s均顯著增高，LVID; s和LVID; d均顯著減小(圖4A，B-E)，EF(0.5 g/kg PSO：68.08 ± 1.63% vs 57.93 ± 2.62%，P< 0.01; 1.0 g/kg PSO: 71.27 ± 2.56% vs 57.93 ± 2.62%，P< 0.001)和FS(0.5 g/kg PSO，37.09 ± 1.23% vs 30.05 ± 1.65%，P< 0.001; 1.0 g/kg PSO，39.84 ± 2.02% vs 30.05 ± 1.65%，P< 0.001)均顯著增加，并恢復(fù)到與WT組接近水平(圖4A，F(xiàn)，G)。另外，Ato組與PSO組的各項指標(biāo)一致，表示PSO治療顯著保護(hù)了心臟結(jié)構(gòu)和功能，具有效果。

2.6 PSO對細(xì)胞內(nèi)ATP含量和基因表達(dá)的影響

注：A：主動脈血管彈性纖維與主動脈血流多普勒；B：斑塊面積與管壁面積的比值；C：主動脈壓。藍(lán)色箭頭表示彈性纖維，黃色箭頭表示斑塊。*P< 0.05 vs WT組;#P < 0.05,### P < 0.001 vs ApoE-/-組。圖2 小鼠主動脈壓的檢測Note. A， Aortic vascular elastic fiber and aortic Doppler images. B， Ratio of plaque area to wall area. C， Aortic pressure. The blue arrow indicates elastic fiber and the yellow arrow indicates plaque.*P< 0.05 vs WT group;#P < 0.05,### P < 0.001 vs ApoE-/- group.Figure 2 Detection of the mouse aortic pressure

與WT組相比，ApoE-/-組的ATP含量顯著降低，與ApoE-/-組相比，PSO組的ATP水平得到恢復(fù)，Ato組的ATP含量無顯著差異(圖5A)。與WT組相比，ApoE-/-組小鼠ANP，BNP和β-MHC 的mRNA表達(dá)水平增加。與ApoE-/-組相比，PSO組BNP和β-MHC 的mRNA表達(dá)顯著降低，并且接近WT，但ANP無顯著改變, Ato組中ANP，BNP和β-MHC 的mRNA表達(dá)水平也顯著降低(圖5B-D)。以上結(jié)果表明PSO減少ApoE-/-心臟重塑。與WT組相比，ApoE-/-組PPARα，PPARγ 和NRF-1 的mRNA表達(dá)降低，PCG-1α的mRNA表達(dá)升高(圖5E-H)。與ApoE-/-組相比，PSO組PPARα 的mRNA(0.5 g/kg PSO，1.65 ± 0.35 vs 0.62 ± 0.11，P< 0.01；1.0 g/kg PSO，1.87 ± 0.34 vs 0.62 ± 0.11，P< 0.01)，NRF-1 的mRNA(0.5 g/kg PSO，0.59 ± 0.03 vs 0.28 ± 0.08，P< 0.01；1.0 g/kg PSO，0.66 ± 0.12 vs 0.28 ± 0.08，P< 0.05)，PGC-1α 的mRNA(0.5 g/kg PSO，4.58 ± 0.36 vs 0.97 ± 0.11，P< 0.01；1.0 g/kg PSO，5.89 ± 0.6 vs 0.97 ± 0.11，P< 0.01)表達(dá)顯著增加(圖5F-H)。PPARγ 的mRNA表達(dá)沒有顯著差異(圖5E)。與ApoE-/-組相比，Ato組PPARα，NRF-1的mRNA表達(dá)均得到恢復(fù)(圖5F-G)，但PGC-1α的mRNA水平降低(圖5H)。以上結(jié)果表明PSO有助恢復(fù)ApoE-/-心臟的能量供給。

2.7 PSO對肌絲蛋白磷酸化的影響

Pro-Q Diamond染色結(jié)果見圖6A。統(tǒng)計顯示ApoE-/-組中MyBP-C、TnT、TnI和MLC2的磷酸化水平顯著低于WT組(圖6A-E)；與ApoE-/-組相比PSO治療后MyBP-C、TnT、TnI和MLC2得到一定程度的恢復(fù)(圖6A-E)，其中1.0 g/kg PSO組和Ato組TnI的磷酸化水平恢復(fù)顯著，接近WT組水平(圖6D)，表明心肌絲活性狀態(tài)得到改善。

注：光學(xué)顯微鏡下的小鼠主動脈根部, 以及肌纖維和主動脈壁。綠色箭頭表示心肌纖維，黃色箭頭表示斑塊。圖3 心肌組織HE染色Note. Mouse aortic root, and aortic wall and cardiac muscle fiber. The green arrows indicate myocardial fibers and the yellow arrows indicate plaques.Figure 3 Histological changes of the mouse myocardial tissues(HE staining)

注：A：超聲顯示小鼠心臟的M型和B型圖；B：收縮末期室間隔厚度；C：收縮末期左室后壁厚度；D：收縮末期左室內(nèi)徑；E：舒張末期左室內(nèi)徑；F：射血分?jǐn)?shù)；G：短軸縮短率。a：舒張末期室間隔厚度；b：舒張末期左室后壁厚度；c：收縮末期室間隔厚度；d：收縮末期左室后壁厚度；e：舒張末期左室內(nèi)徑；f：收縮末期左室內(nèi)徑。*P < 0.05,**P < 0.01,***P< 0.001 vs WT組;#P < 0.05,## P< 0.01,### P < 0.001 vs ApoE-/-組。圖4 小鼠心功能檢測Note. A, Typical B-mode and M-mode ultrasound images of the mouse heart. B, Internal ventricular septum thickness at end-systole. C, Left ventricular posterior wall thickness at end-systole. D, Left ventricular internal dimension at systole. E, Left ventricular internal dimension at diastole. F, Ejection fraction. G, Short axis shortening rate. a, Internal ventricular septum thickness at diastole. b，Left ventricular posterior wall thickness at diastole. c, Internal ventricular septum thickness at end-systole. d, Left ventricular posterior wall thickness at end-systole. e, Left ventricular internal dimension at diastole. F, Left ventricular internal dimension at systole.*P < 0.05,**P < 0.01,***P< 0.001 vs WT group;# P < 0.05,## P< 0.01,### P < 0.001 vs ApoE-/- group.Figure 4 Measurements of cardiac function of the mice

注： A：ATP含量；B：ANP的表達(dá)；C：BNP的表達(dá)；D：β-MHC的表達(dá)；E：PPARγ的表達(dá)；F：PPARα的表達(dá)；G：NRF-1的表達(dá)；H：PCG-1α的表達(dá)。*P<0.05,**P<0.01,***P< 0.001 vs WT組;# P< 0.05,## P< 0.01,### P< 0.001 vs ApoE-/-組。圖5 ATP含量和基因表達(dá)水平Note. A, Content of ATP. B, Expression of ANP. C, Expression of BNP. D, Expression of β-MHC. E, Expression of PPARγ. F, Expression of PPARα. G, Expression of NRF-1. H, Expression of PCG-1α.*P < 0.05,**P < 0.01,***P< 0.001 vs WT group;#P<0.05,## P< 0.01, ### P < 0.001 vs ApoE-/- group.Figure 5 The content of ATP and gene expression levels

A：Pro-Q Diamond染色；B：肌球蛋白結(jié)合蛋白C磷酸化水平；C：肌鈣蛋白T磷酸化水平；D：肌鈣蛋白I磷酸化水平；E：肌球蛋白輕鏈2磷酸化表達(dá)水平。*P < 0.05,**P < 0.01,***P< 0.001 vs WT組;# P < 0.05 vs ApoE-/-組。圖6 肌絲蛋白磷酸化水平Note. A, Pro-Q Diamond staining. B, Phosphorylation levels of MyBP-C. C, Phosphorylation levels of TnT. D, Phosphorylation levels of TnI. E, Phosphorylation levels of MLC2.*P < 0.05,**P < 0.01,***P< 0.001 vs WT group; # P < 0.05 vs ApoE-/- group.Figure 6 Phosphorylation level of myofilaments

3 討論

本實驗中, ApoE-/-小鼠可檢測到心臟擴(kuò)張、心功能障礙和心肌結(jié)構(gòu)損傷，與其他報道結(jié)果一致，例如肥大性心臟重構(gòu)[21-23]和內(nèi)皮功能障礙[21]。但是我們的小鼠出現(xiàn)的時間較早，約為5個月，其它文獻(xiàn)報道出現(xiàn)癥狀的時間有長于或短于此時間的，如正常飲食的ApoE-/-小鼠7.5個月出現(xiàn)顯著的心臟重構(gòu)和內(nèi)皮功能障礙[21]，13個月大的ApoE-/-小鼠出現(xiàn)明顯的肥大性心臟重構(gòu)[22]，較短時間的則顯示正常飲食4周齡ApoE-/-小鼠已出現(xiàn)左心室肥大性重構(gòu)[23]。ApoE-/-病理表型出現(xiàn)時間不一致可能與飼養(yǎng)管理情況和實驗時間點有關(guān)。另外，研究表明動脈粥樣硬化病變與巨噬細(xì)胞能量代謝異常[22]、線粒體功能損傷引起的能量代謝障礙[23]密切相關(guān)，本研究中PSO沒有顯著降低血脂但卻減少動脈粥樣硬化斑塊，可能與能量代謝的機(jī)制相關(guān)，本研究中的基因表達(dá)檢測結(jié)果也支持這個觀點，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

哺乳動物需要大量的ATP來維持正常的心臟收縮功能，能量代謝異常與心功能失常密切相關(guān)。PGC-1α是線粒體合成的“主控制器”，與PPARs和NRF-1共激活起作用[24]。研究表明多不飽和脂肪酸能激活PPARs與PGC-1α調(diào)節(jié)心臟代謝[25-26]，而PPARα的激活可改善心肌能量代謝、延緩心力衰竭[27]。我們的結(jié)果顯示，PSO治療改善了ApoE-/-小鼠心功能，提高了PPARα，PCG-1α和NRF-1的mRNA表達(dá)水平，表明這些基因表達(dá)在PSO治療機(jī)制中起到關(guān)鍵作用。PSO治療后PPARγ的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異，這可能是因為PPARγ的激活主要受n-6脂肪酸調(diào)控[28]，并且其激活未參與左心室重構(gòu)[29]。同時，心肌絲磷酸化結(jié)果提示PSO可通過調(diào)節(jié)心肌絲活性狀態(tài)改善心臟功能收縮，但其如何與能量代謝相互協(xié)調(diào)保護(hù)心臟的機(jī)制仍有待探索闡明。

ApoE-/-小鼠發(fā)生心臟結(jié)構(gòu)和功能異常，PSO可抑制其動脈斑塊形成、維持正常心臟結(jié)構(gòu)和功能。PSO可能通過調(diào)節(jié)PPARα/PCG-1α/NRF-1軸增加ATP和肌絲蛋白磷酸化、改善能量代謝、發(fā)揮心臟保護(hù)作用。