王鳳杰， 宗星煜， 杜俊龍， 王文晟， 袁德培， 陳顯兵1,△

(1. 湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院， 恩施 445000； 2. 湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部， 恩施 445000; 3. 湖北民族大學(xué)科技學(xué)院，恩施 445000)

胃癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)胃癌已成為嚴(yán)重威脅人類健康的第二大常見癌癥，發(fā)病率和死亡率僅次于肺癌[1]。惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是癌癥患者死亡的主要原因之一。臨床常用化療藥物如鉑類、氟尿嘧啶等往往有較大毒副作用，而來自傳統(tǒng)中藥的活性成分因具有副作用小、多靶點(diǎn)抗腫瘤作用等特點(diǎn)而得到廣泛研究，可用于輔助腫瘤治療。二氫楊梅素 (dihydromyricetin, DHM, 又名蛇葡萄素)是一種天然的黃酮類化合物，是傳統(tǒng)中草藥顯齒蛇葡萄(又名藤茶)的主要活性成分；藤茶中總黃酮含量為43.4%～44%，二氫楊梅素含量高達(dá)37.4%～38%[2]；已有大量研究表明DHM具有抗氧化、抗癌、保肝、降糖、增強(qiáng)人體免疫力等多種藥理活性作用[3,4]。

目前DHM的抗腫瘤作用在胃癌中研究較少，前期研究發(fā)現(xiàn)其有抑制胃癌腹腔移植瘤惡性增殖作用[5]，本研究選用人低分化胃癌MKN45細(xì)胞為研究對(duì)象，初步探討其抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用及分子機(jī)制，為天然抗腫瘤藥物的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及主要儀器

DHM (Bellancom-A1046, 純度99.51%) 購(gòu)自北京寰宇科技公司，用DMSO溶解配置成50 mmol/L儲(chǔ)存液備用，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將儲(chǔ)存液加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中稀釋為相應(yīng)濃度后作用于MKN45細(xì)胞; CCK-8(Cell Counting Kit-8)試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、β-actin抗體購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司；JNK, pJNK, MMP-2, MMP-9抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Vimentin, E-cadherin抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人低分化胃癌MKN45細(xì)胞購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。MKN45細(xì)胞置于含10%胎牛血清 (Gibco)、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640(Hyclone)培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次。

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞消化離心后棄上清液，加入2 ml培養(yǎng)基重懸，取10 μl重懸液與10 μl臺(tái)酚藍(lán)混勻，加入計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)；取96孔板，每孔加入2 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基補(bǔ)齊到100 μl；待細(xì)胞貼壁后，加入含相應(yīng)濃度的DHM培養(yǎng)液分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h后，每孔加入10 μl CCK-8液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)為490 nm的吸光率(A490)，計(jì)算細(xì)胞存活率。公式為細(xì)胞存活率%=[(A實(shí)驗(yàn)孔-A對(duì)照孔)/ (A空白孔-A對(duì)照孔)]×100%。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)

取培養(yǎng)在24孔板的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN45細(xì)胞，用200 μl移液槍頭垂直于孔板底面進(jìn)行劃痕3～5條，無菌PBS漂洗3次去掉脫落細(xì)胞；再換成預(yù)先配置好的含相應(yīng)濃度DHM的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡下拍照評(píng)價(jià)對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。200倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)劃痕區(qū)域內(nèi)遷移細(xì)胞數(shù)量，取平均值用于表示腫瘤細(xì)胞的遷移能力[6]。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)

取Transwell小室，每室加入6×104個(gè)細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基補(bǔ)齊到200 μl；置于24孔板中，小室外加入含相應(yīng)濃度的DHM的有血清培養(yǎng)基800 μl置于37℃孵箱培養(yǎng)48 h；取出小室，去除培養(yǎng)基，PBS清洗2遍；4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗2遍；結(jié)晶紫染色10 min，PBS清洗2遍，用棉球擦去小室內(nèi)壁細(xì)胞，通風(fēng)處自然吹干，拍小室外壁細(xì)胞圖片，顯微鏡200倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目，取平均值用于表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[7]。

1.6 Western blot檢測(cè)

取DHM處理后的各組細(xì)胞加入蛋白裂解液，按試劑盒說明提取各組細(xì)胞總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，5×SDS凝膠上樣緩沖液溶解蛋白后煮沸。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至孔徑為0.45 μm的PVDF膜。PVDF膜用10%脫脂牛奶封閉非特異性抗原，在室溫下孵育2 h。加入相應(yīng)濃度的一抗，4℃下孵育過夜。TBST清洗后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下繼續(xù)孵育3 h。TBST清洗后用ECL法顯色并曝光成像，凝膠圖像分析軟件對(duì)膠片掃描，以β-actin作為內(nèi)參照，分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 DHM對(duì)MKN45細(xì)胞活力的影響

用0,10,20, 30,40,50 μmol/L的DHM分別處理MKN45細(xì)胞24 h和48 h后，檢測(cè)各組細(xì)胞A490值表示細(xì)胞活力水平，以0 μmol/L處A490值為1。結(jié)果表明隨著DHM作用濃度增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，MKN45細(xì)胞活力逐漸降低(P<0.05及0.01)。DHM作用MKN45細(xì)胞24及48 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為67.3和45.2 μmol/L(表1)。

2.2 DHM對(duì)MKN45細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

檢測(cè)不同濃度DHM對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，20, 30,40 μmol/L的DHM處理48 h均可明顯抑制細(xì)胞遷移能力(P<0.01，圖1A，表2)。

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相比，不同濃度DHM處理48 h可抑制細(xì)胞侵襲能力(P< 0.05，0.01，圖1B，表2)。

DHM (μmol/L)24 h48 hControl99.00±0.9896.84±1.441095.76±1.3091.04±1.55?2088.13±2.52??80.69±1.61??3079.42±1.51??73.74±3.51??4068.70±1.17??52.62±2.45??5051.08±3.56??43.13±3.20??

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig.1Effects of DHM on cell migration and invasion in MKN45 cells. MKN45 cells were treated with DHM (0,10,20,30,40 μmol/L) for 48 h

DHM (μmol/L)Invasive cells per fieldMigrated cells per fieldControl339.67±10.50410.67±25.3810282.33±16.65?354.33±17.9020227.33±17.16??244.00±43.14??30151.44±10.02??213.00±25.63??4088.33±16.01??124.00±13.45??

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.3 DHM對(duì)MKN45細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot檢測(cè)DHM對(duì)各組細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明，與正常組相比，10 μmol/L的DHM處理對(duì)E-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)無明顯影響(P>0.05)；而20及30 μmol/L的DHM處理48 h可明顯增加E-cadherin蛋白表達(dá)(P<0.01)、降低Vimentin表達(dá)水平(P< 0.01, 圖2，表3)，從而逆轉(zhuǎn)EMT過程。

Fig.2Effects of DHM on E-cadherin and vimentin levels in MKN45 cells by Western blot. MKN45 cells were treated with DHM (0,10,20,30 μmol/L) for 48 h

DHM (μmol/L)E-cadherinVimentin Control98.31±1.0597.68±1.531096.19±6.5791.01±2.9820118.76±8.12??78.09±3.07??30138.70±6.47??67.43±4.22??

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.4 DHM對(duì)MKN45細(xì)胞中pJNK和MMP-2/9蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot檢測(cè)10,20及30 μmol/L的DHM處理對(duì)各組細(xì)胞內(nèi)pJNK及MMP-2/9表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pJNK活性表達(dá)水平隨著DHM作用濃度增加而逐漸降低(P<0.05，0.01)，而且MMP-2表達(dá)水平亦明顯降低(P<0.01)，但MMP-9表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05, 圖3，表4)。

Fig.3Effects of DHM on pJNK, MMP-2 and MMP-9 levels in MKN45 cells by Western blot.

DHM (μmol/L)pJNK/JNKMMP-2/β-actinMMP-9/β-actinControl97.62±1.5695.38±1.9594.17±4.181085.68±4.73?90.68±3.1293.09±3.982077.67±4.63??69.42±6.00??91.38±2.633066.45±2.88??60.76±1.66??90.79±2.51

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.5 DHM通過下調(diào)pJNK來抑制MMP-2表達(dá)，進(jìn)而抑制MKN45細(xì)胞侵襲能力

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與單獨(dú)DHM處理相比，20 μmol/L JNK抑制劑SP600125預(yù)處理20 min，再用30 μmol/L的DHM干預(yù)處理MKN45細(xì)胞48 h可明顯減少侵襲細(xì)胞的數(shù)量(P<0.01, 圖4A，表5)；

Western blot結(jié)果顯示，相對(duì)于30 μmol/L的DHM單獨(dú)作用來說，SP600125預(yù)處理與DHM干預(yù)共同作用可進(jìn)一步抑制pJNK水平及降低MMP-2蛋白的表達(dá)(P<0.01, 圖4B，表5)。

Fig.4Effects of DHM and JNK inhibitor SP600125 on cell invasion by Transwell assay and pJNK and MMP-2 levels by Western blot in MKN45 cells. MKN45 cells were treated with DHM (30 μmol/L) for 48 h and pretreated with JNK inhibitor SP600125 (20 μmol/L) for 20 min

DHM (μmol/L)Invasive cells per fieldRelative expression (%)pJNK/β-actinMMP-2/β-actinControl232.67±15.1895.47±2.6494.09±3.19DHM(30)175.00±15.10??84.41±4.53?83.40±6.03?SP600125(20)159.00±8.71?79.71±2.57??80.75±6.16?DHM(30)+ SP600125(20)97.00±7.55##61.01±5.69##59.23±3.31##

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P< 0.01vsDHM treatment group

3 討論

眾多研究表明，中藥中多種活性單體及提取物可用于輔助腫瘤治療，安全有效，且有多途徑、多靶點(diǎn)抗腫瘤作用特點(diǎn)，因此研發(fā)抑制胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的藥物是臨床治療的研究熱點(diǎn)，有廣泛前景。二氫楊梅素(DHM)作為一種黃酮類化合物，抗腫瘤作用明顯，主要機(jī)制有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)自噬、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥以及抑制侵襲和轉(zhuǎn)移等多種途徑，其抗胃癌作用研究較少，因此深入探討其作用機(jī)制可為臨床腫瘤的輔助治療及藥物作用靶點(diǎn)的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 是一類在細(xì)胞增殖、分化及凋亡等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，包括c-Jun氨基端激酶 (c-Jun N-terminal kinase, JNK)、p38及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated kinase, ERK)信號(hào)通路，其中JNK家族是參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)家族成員能降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，破壞癌細(xì)胞侵襲屏障，而且MMP-2在增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[8]，增加MMP-2/9活性表達(dá)可提高細(xì)胞侵襲能力[9]。亦有研究報(bào)道，在人肺癌細(xì)胞中敲除MMP-2表達(dá)后可抑制細(xì)胞增殖、侵襲及遷移，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡性死亡[10]，而且JNK是調(diào)節(jié)MMP-2活性及表達(dá)的重要激酶之一。JNK激酶通過上調(diào)MMP-2/9基因表達(dá)從而調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和侵襲[11,12]，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展；MMP-2與腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)特異性siRNA干擾長(zhǎng)鏈非編碼SPRY4-IT1的表達(dá)可能通過MMP-2影響癌細(xì)胞侵襲和遷移能力[13]。以上研究表明，JNK/MMP通路可能在癌細(xì)胞侵襲和遷移中起重要作用，亦可能是抗癌藥物的作用靶點(diǎn)之一。

以往研究表明，多種中藥活性成分可通過影響MMPs活性表達(dá)來抑制惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，如白藜蘆醇可通過抑制JNK1/2和ERK1/2活性，調(diào)控MMPs的蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄來抑制腫瘤細(xì)胞遷移[14]；姜黃素[15]、黃芩素[16]等化合物也可通過下調(diào)MMP-2或MMP-9表達(dá)來降低癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。這些均與本研究結(jié)果相似，DHM干預(yù)人胃癌MKN45細(xì)胞可明顯抑制細(xì)胞遷移及侵襲能力，并可明顯降低pJNK水平及MMP-2表達(dá)，而對(duì)MMP-9表達(dá)的影響不明顯；且用JNK通路抑制劑SP600125預(yù)處理可進(jìn)一步促進(jìn)DHM對(duì)癌細(xì)胞侵襲的抑制作用，伴有MMP-2蛋白表達(dá)的明顯下調(diào)，因此DHM抑制胃癌MKN45細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移作用可能與下調(diào)JNK/MMP-2信號(hào)通路有關(guān)。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是腫瘤性上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的生物學(xué)過程，是惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要步驟。EMT過程中細(xì)胞從上皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)槟軇?dòng)性和侵襲性更強(qiáng)的間充質(zhì)細(xì)胞表型，并侵入組織形成轉(zhuǎn)移，因此EMT的主要特點(diǎn)是上皮細(xì)胞標(biāo)記E-鈣黏蛋白(E-cadherin) 的缺失[17]和間葉細(xì)胞標(biāo)記N-cadherin和Vimentin的獲得[18]。有報(bào)道MMP-2和MMP-9是與EMT進(jìn)程密切相關(guān)的蛋白[19]，參與了癌細(xì)胞的入侵、轉(zhuǎn)移和EMT過程，且發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中Shh分子可通過PI3K/Akt通路促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，這與促進(jìn)EMT進(jìn)程及增強(qiáng)MMP-9活性有關(guān)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，DHM干預(yù)處理亦可增加胃癌細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)、降低Vimentin表達(dá)，從而減緩甚至逆轉(zhuǎn)EMT進(jìn)程，也可能是其抑制胃癌MKN45細(xì)胞侵襲的機(jī)制之一，而DHM減緩EMT過程及降低MMP-2表達(dá)之間是否存在某種聯(lián)系還需研究證實(shí)。

綜上所述，本研究證實(shí)，DHM可抑制EMT進(jìn)程、下調(diào)JNK/MMP-2信號(hào)通路分子表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌MKN45細(xì)胞侵襲和遷移能力；用DHM和JNK通路抑制劑共處理可進(jìn)一步抑制MMP-2活性表達(dá)，表明DHM可能通過JNK/MMP-2通路發(fā)揮抑制胃癌MKN45細(xì)胞的遷移和侵襲作用。本研究結(jié)果為DHM可作為臨床胃癌輔助治療的候選劑提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其作用機(jī)制復(fù)雜，還有待深入探討。