白淑芝， 徐 娜， 王躍虹， 李鴻珠， 李宏霞

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 哈爾濱 150086)

糖尿病發(fā)病率逐年增高，其中90%為2型糖尿病[1]。糖尿病患者有約一半死于心腦血管疾病。糖尿病心肌病( diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病重要合并癥之一，它可導(dǎo)致心功能障礙、甚至心衰，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚未完全闡明[2]。鈣離子在調(diào)控心臟舒縮功能中發(fā)揮非常重要的作用。鈣敏感受體(calcium-sensing receptor, CaSR)屬于G蛋白耦聯(lián)受體超家族C家族第Ⅱ組成員，在平滑肌、腎臟、甲狀旁腺等臟器表達(dá)，參與調(diào)節(jié)甲狀旁腺素、降鈣素、胃泌素等的調(diào)節(jié)。2003年首次發(fā)現(xiàn)CaSR在心臟有表達(dá)，并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)[3]。研究發(fā)現(xiàn)CaSR參與心肌缺血/再灌注損傷、心肌肥大和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展，但CaSR在2型糖尿病心功能降低中的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討CaSR與DCM心功能障礙之間的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示DCM的發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與器材

CaSR 抗體購(gòu)自Alpha Diagnostic International Inc.公司，GAPDH 多克隆抗體、PKC抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司；鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京碧云天，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。主要器材包括 BECKMAN 低溫離心機(jī)，酶標(biāo)儀 (DG3022 A) ，Western blot 電泳槽( 北京六一廠) 等。

1.2 2型糖尿病模型建立

Wistar健康雄性大鼠24 只，體重為180～220 g，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院動(dòng)物研究所。將大鼠于 22℃ ～ 24℃、12 h∶ 12 h 晝夜循環(huán)的安靜環(huán)境飼養(yǎng) 1 周后，隨機(jī)分為 3 組: (1) 正常對(duì)照組(C); (2) 糖尿病 4 周組(D4) ; (3) 糖尿病 8 周組(D8)(n=8)。對(duì)照組大鼠給予自由飲食、飲水，糖尿病組大鼠喂養(yǎng)高糖高脂飲食( 成分: 67% 基礎(chǔ)飼料，10% 豬油，20% 糖，1% 膽酸鈉，2% 膽固醇)。4周后，大鼠禁食 12 h，將佐鏈脲菌素(STZ)溶于 0.1 mol /L 枸櫞酸鈉溶液中備用。糖尿病組大鼠給予腹腔注射STZ(30 mg /kg)，對(duì)照組單獨(dú)注射等量的枸櫞酸鈉溶液。72 h后檢測(cè)血糖，血糖高于16.7 mmol /L 為造模成功，如果未成功，補(bǔ)充動(dòng)物再造模。糖尿病組大鼠繼續(xù)給予高糖高脂飲食，同時(shí)監(jiān)測(cè)各組大鼠血糖、飲食、飲水量，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3 HE染色

用中性10%福爾馬林將新鮮的心肌組織固定，然后不同濃度乙醇逐級(jí)脫水、二甲苯透明、浸蠟后用液體石蠟包埋組織塊。用切片機(jī)將包埋好的組織塊切5 μm厚的切片，用蘇木精染色和伊紅進(jìn)行病理染色、封片，于Olympas光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.4 心臟功能檢測(cè)

用10%水合氯醛(0.3 ml/kg)將大鼠麻醉，心區(qū)剃毛，用GE VIVID7 10S 探頭(10 MHz)置于大鼠左胸前進(jìn)行彩色多普勒超聲心動(dòng)圖二維成像與TDI技術(shù)測(cè)定大鼠心臟的結(jié)構(gòu)和功能參數(shù)。于胸骨旁左室長(zhǎng)軸切面，腱索水平用M型超聲測(cè)量心臟參數(shù)：左室收縮末期腔內(nèi)徑(LV end-systolic diameter, LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(LV ejection fraction, LVEF)、左室縮短分?jǐn)?shù)(LV fractional shortening,LVFS)。于心尖四腔切面彩色多普勒頻譜測(cè)定舒張?jiān)缙诙獍暄魉俣?E)、舒張?jiān)缙诙獍戥h(huán)運(yùn)動(dòng)速度(E')，通過(guò)E/E′來(lái)評(píng)價(jià)左室舒張功能。一般采取3～5個(gè)心動(dòng)周期測(cè)量的數(shù)據(jù)，取其平均值。超聲測(cè)量參照美國(guó)超聲心動(dòng)圖學(xué)會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 Western blot檢測(cè)CaSR和PKC-α蛋白表達(dá)

取各組大鼠心室肌組織，在研缽中用液氮充分研磨后加入組織裂解液，混勻后置于4℃ 裂解 1 h，每15 min混勻一次。然后用低溫離心機(jī)12 000 r/min離心20 min，上清液即為要提取的總蛋白。取 50 μg 總蛋白樣品進(jìn)行 10% 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜，分別用 CaSR 抗體( 1∶ 2 000) 、PKC-α( 1∶ 500)、GAPDH( 1∶ 500) 抗體， 4℃ 震蕩過(guò)夜。用二抗(1∶ 5 000 的兔抗鼠 IgG 二抗;1∶ 5 000 的羊抗兔IgG 二抗) 孵育 1 h 后顯色。在凝膠成像系統(tǒng)下拍照、分析。計(jì)算各蛋白條帶的光密度值，蛋白表達(dá)水平以其與內(nèi)參 GAPDH 光密度比值來(lái)表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠飲食、飲水量和血糖的變化

實(shí)驗(yàn)期間，糖尿病大鼠血糖一直高于 16.67 mmol/L,說(shuō)明造模成功。與正常對(duì)照組大鼠相比，糖尿病組大鼠表現(xiàn)出飲水量增加，飲食量增加，且隨著病程延長(zhǎng)逐漸加重(P<0.05，表1)。

GroupWater intake(ml/d)Food intake(g/d)Glucose( mmol/L)C26.0±2.012.8±1.24.9±0.1D4185.0±4.9?37.9±2.5?28.9±2.4?D8239.0±5.6?#47.1±2.8?#26.4±1.9?

C: Control group; D4: Diabetic-4 week group; D8: Diabetic-8 week group

*P<0.05vsC group;#P<0.05vsD4 group

2.2 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的變化

正常對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，心肌細(xì)胞核大小均一，細(xì)胞漿染色均勻。糖尿病組心肌細(xì)胞排列紊亂，胞漿染色不均一，心肌細(xì)胞核大小不甚規(guī)則，出現(xiàn)不規(guī)則收縮帶，糖尿病8周組更為明顯(圖1)。

Fig.1HE staining in the myocardium of rats (×200)

C: Control group; D4: Diabetic-4 week group; D8: Diabetic-8 week group

2.3 各組大鼠心臟功能的變化

與對(duì)照組相比，糖尿病4周組LVESD、E/E′升高，LVEF、LVFS降低，糖尿病8周組更為明顯，說(shuō)明糖尿病大鼠出現(xiàn)了心肌收縮和舒張功能障礙(表2)。

2.4 各組心肌組織CaSR和PKC-α蛋白表達(dá)的變化

通過(guò)Western blot 檢測(cè)大鼠心肌組織CaSR和PKC-α蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組相比，糖尿病4周組CaSR表達(dá)減少，PKC-α表達(dá)升高，糖尿病8周組變化更為明顯(表3)。

GroupLVESDLVEFLVFSE/E'C3.48±0.2474.32±3.5339.78±3.1919.35±1.39D44.54±0.25?71.70±1.46?33.30±3.12?24.25±2.88?D84.83±0.14?63.10±2.90?#31.53±1.46?29.71±1.90?#

LVESD： Left ventricular end-systolic diameter； LVEF： LV ejection fraction； LVFS： LV fractional shortening； E： Early transmitral peak diastolic flow velocity; E′： Peak early diastolic tissue velocity; C: Control group; D4: Diabetic-4 week group; D8: Diabetic-8 week group

*P<0.05vsC group;#P<0.05vsD4 group

Tab.3Protein expressions of CaSR and PKC-α in heart analyzed by Western blot

GroupCaSRPKC-αC0.40±0.030.36±0.03D40.20±0.02?0.67±0.06?D80.09±0.01?#0.73±0.05?

C: Control group; D4: Diabetic-4 week group; D8: Diabetic-8 week group

*P<0.05vsC group; #P<0.05vsD4 group

3 討論

本研究復(fù)制了大鼠2型糖尿病心肌病動(dòng)物模型，血糖超過(guò)16.7 mmol/L表明造模成功。通過(guò)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠出現(xiàn)飲食、飲水量明顯增加，說(shuō)明出現(xiàn)糖尿病的癥狀。通過(guò)心肌組織HE染色發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，且出現(xiàn)不規(guī)則攣縮帶，表明心臟功能出現(xiàn)異常。

多普勒超聲心動(dòng)描記術(shù)是一項(xiàng)無(wú)創(chuàng)性操作技術(shù)，在臨床上已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)中的糖尿病大鼠也采用心臟超聲多普勒檢查來(lái)評(píng)價(jià)心臟的功能。通過(guò)E/E'來(lái)判定左心室舒張功能，通過(guò)LVEF、LVFS和LVESD來(lái)判定左心室收縮功能[4]。本研究顯示，糖尿病大鼠4周后心臟的LVESD升高，LVEF和LVFS降低，而E/E' 升高，病程達(dá)到8周后這些變化更明顯，與文獻(xiàn)報(bào)道[5]一致?？梢?jiàn)，糖尿病大鼠出現(xiàn)了左心室收縮功能和舒張功能的障礙，且隨著病程的延長(zhǎng)逐漸加重。

DCM的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，迄今尚不十分清楚，一般認(rèn)為，主要與糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、線粒體功能異常、心臟自主神經(jīng)病變以及血管病變等有關(guān)[6]。鈣離子在調(diào)控心臟收縮和舒張過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]，鈣穩(wěn)態(tài)紊亂將直接導(dǎo)致心臟功能異常。DCM時(shí)，引起鈣穩(wěn)態(tài)失衡的因素有RyR、SERCA2a、NCX、LTCC和ATP敏感鉀通道蛋白表達(dá)/活性改變以及肌絲對(duì)Ca2+敏感性降低等[8]，關(guān)于CaSR在DCM心肌鈣穩(wěn)態(tài)紊亂中的作用報(bào)道較少。

CaSR激活通過(guò)G蛋白-PLC-IP3通路導(dǎo)致 [Ca2+]i升高[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著病程延長(zhǎng)，CaSR蛋白的表達(dá)逐漸降低，由此可以推測(cè)其變化可能引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂，可導(dǎo)致心功能降低。

研究表明，慢性高血糖是糖尿病心血管合并癥的主要始動(dòng)因子。在糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，高血糖可激活PKC等多條信號(hào)通路[10]。PKC激活，可引起心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變，嚴(yán)重可導(dǎo)致心力衰竭,運(yùn)用PKC抑制劑可以改善此變化[11]。本研究表明Western blot 檢測(cè)大鼠糖尿病心肌組織PKC-α表達(dá)升高。有報(bào)道在2型糖尿病心肌病早期，高血糖能增加甘油二酯和游離脂肪酸的合成，過(guò)多的甘油二酯可引起PKC-α表達(dá)增強(qiáng)[12]。文獻(xiàn)報(bào)道，PKC可抑制CaSR的功能，而尤其是PKC磷酸化CaSR T888位點(diǎn)，抑制CaSR介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣升高。本研究顯示，高血糖所致的PKC-α的激活引起CaSR表達(dá)降低，將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)紊亂，從而引起心臟收縮和舒張功能出現(xiàn)異常。在糖尿病心肌病中，CaSR是否也通過(guò)PLC-IP3通路調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣導(dǎo)致糖尿病心肌病心功能紊亂的確切機(jī)制，在后續(xù)的研究中將進(jìn)一步探討。