魏 萌 梁珊珊 王 萌 劉 華 薛瑾虹 孫凌霜 魏麗敏 蔣紅利

研究表明終末期腎病(ESRD)患者普遍處于微炎癥狀態(tài)，可能是其心腦血管疾病發(fā)生的主要原因[1-2]，且與營(yíng)養(yǎng)不良、動(dòng)脈粥樣硬化、貧血及高死亡率存在密切的關(guān)系[3]。微炎癥狀態(tài)原因包括尿毒癥毒素的刺激、氧化應(yīng)激損傷、透析膜生物相容性差、透析用水不純、透析器復(fù)用、血管通路各接口的感染及內(nèi)瘺口感染等[4]。本課題組在國(guó)際上首先提出了尿毒癥腸道菌群失調(diào)、腸道菌群移位可能參與尿毒癥微炎癥狀態(tài)發(fā)生及發(fā)展的觀點(diǎn)[5-6]。尿毒癥腸道屏障功能狀態(tài)、腸道細(xì)菌移位與微炎癥狀態(tài)的關(guān)系及機(jī)制值得不斷探索。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型取雄性SPF級(jí)SD 大鼠45 只，體重為150±10g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。編號(hào)法隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組(n=20)及尿毒癥組(n=25)。采用5/6腎切除法制備尿毒癥動(dòng)物模型，假手術(shù)組僅打開腎包膜。假手術(shù)組、尿毒癥組在第6、8、10周末采集全血，隨后進(jìn)入示蹤菌實(shí)驗(yàn)。

應(yīng)用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的示蹤菌檢測(cè)腸道細(xì)菌移位

建立示蹤菌方法 按照說明書方法制備感受態(tài)細(xì)胞，加入用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒pGFPuv Vector(大連TaKaRa公司)4ng轉(zhuǎn)化大腸桿菌，取2 ml大腸桿菌菌液，應(yīng)用天根質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。根據(jù)質(zhì)粒pGEFP酶切位點(diǎn)選擇限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ及 HindⅢ行雙酶切，對(duì)雙酶切后的DNA片段1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其片段長(zhǎng)度是否符合預(yù)期。經(jīng)雙酶切電泳后質(zhì)粒生成2條DNA鏈，分別為770 bp和2 560 bp。證實(shí)此示蹤菌可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

示蹤菌灌胃動(dòng)物 比濁法調(diào)整示蹤菌濃度至2×108Cfu/ml。灌胃前動(dòng)物禁食24h，不禁水。大鼠每只灌胃示蹤菌菌液1 ml。灌胃后2h 給予10%水合氯醛0.3 ml/100g體重麻醉動(dòng)物，取外周血、肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)，立即置于液氮冷凍并轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存。

提取血液及腸外組織總DNA 肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)、血液中基因組DNA的提取采用Qiagen公司DNeasy blood& tissue kit試劑盒，提取操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

組織示蹤菌檢測(cè) 根據(jù)質(zhì)粒pGFPuv中GFP基因序列設(shè)計(jì)特異性引物：Forward primer：C￣T￣C￣T￣T￣A￣T￣G￣G￣T￣G￣T￣T￣C￣A￣A￣T￣G￣C￣T￣T￣T￣T￣C￣C； Reverse primer：C￣G￣T￣C￣T￣T￣G￣T￣A￣G￣T￣T￣C￣C￣C￣G￣T￣C￣A￣T￣C￣T￣T,擴(kuò)增片段：143 bp。擴(kuò)增條件：預(yù)熱94℃，5 min；變性94℃，1 min；退火56℃，30s；延伸72℃，1 min ；35個(gè)循環(huán)，終末延伸72℃ 5 min。結(jié)果觀察：2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物作為陽(yáng)性對(duì)照。成功擴(kuò)增出GFP產(chǎn)物條帶代表示蹤菌移位至該樣品中。

腸道組織病理學(xué)將腸道組織標(biāo)本按常規(guī)脫水、透明、包埋，石蠟切片。按組別進(jìn)行蘇木素-伊紅染色(HE 染色)。

透射電鏡觀察腸上皮細(xì)胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)用PBS充分漂洗切取的回腸組織，充分洗凈腸內(nèi)容物，將腸組織快速置于3%的冷戊二醛溶液中，固定2h，取出后置于1%鋨酸中固定 1h，再經(jīng)丙酮梯度脫水，環(huán)氧丙烷置換，Epon-812 樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重電子染色，透射電鏡觀察。

免疫組織化學(xué)染色觀察取回腸組織,中性甲醛固定,經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明后行石蠟包埋、切片、脫蠟、置水后經(jīng)3% H2O2浸泡消除內(nèi)源性過氧化物酶,微波修復(fù),分別滴加50 μl JAM-1、claudin-1和Occludin(美國(guó)abcam公司)一抗，室溫過夜，滴加二抗，室溫孵育30 min,DAB 顯色,常規(guī)脫水透明、封片; 每張切片隨機(jī)選6 個(gè)視野,利用KS400 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行陽(yáng)性率分析比較。

血清炎癥介質(zhì)檢測(cè)示蹤菌灌胃前、灌胃后分別收集大鼠血清。免疫比濁法測(cè)定血漿超敏C 反應(yīng)蛋白(hs-CRP)(西安交通大學(xué)醫(yī)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科)。 ELISA法檢測(cè)檢測(cè)白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用《SPSS 19.0》統(tǒng)計(jì)軟件分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。連續(xù)變量組間比較采用student’st檢驗(yàn)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

模型建立情況術(shù)后兩組大鼠傷口無(wú)出血和感染。尿毒癥組大鼠逐漸表現(xiàn)出活動(dòng)減少、對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，喜拱背蜷縮。食物攝入減少，體重增長(zhǎng)緩慢。毛色枯黃，疏松不齊，眼、耳、尾漸蒼白。假手術(shù)組活動(dòng)靈活，毛色、眼、耳及尾部均無(wú)異常變化，食量隨體重增長(zhǎng)不斷增加，尿量無(wú)異常改變。

術(shù)后7天尿毒癥組大鼠出現(xiàn)蛋白尿，尿素氮、肌酐水平逐漸升高，術(shù)后第10周，尿毒癥組大鼠共有21只存活且肌酐水平達(dá)到尿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)取20只進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組20只大鼠全部存活。尿毒癥組大鼠體重、紅細(xì)胞壓積均顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，尿毒癥組大鼠尿量有減少趨勢(shì)，但與假手術(shù)組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。

表1 尿毒癥組與假手術(shù)組生物學(xué)參數(shù)

*：與假手術(shù)組比較，P<0.05

腸道組織病理學(xué)改變尿毒癥組空腸、回腸明顯可見腸絨毛萎縮、倒塌，黏膜層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，吸收細(xì)胞減少；結(jié)腸亦見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但與假手術(shù)組差異較小。假手術(shù)組大鼠各腸段腸絨毛結(jié)構(gòu)清晰飽滿，幾乎無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。絨毛部上皮見大量吸收細(xì)胞(圖1)。

圖1 兩組大鼠腸道病理圖(HE染色，×100)紅色箭頭示微絨毛結(jié)構(gòu)；藍(lán)色箭頭示炎癥細(xì)胞

腸道細(xì)菌移位尿毒癥組中70%的實(shí)驗(yàn)對(duì)象可在腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟、血液等一個(gè)或多個(gè)組織中檢測(cè)到示蹤菌GFP片段(圖2)；假手術(shù)組中細(xì)菌移位發(fā)生率為10%。尿毒癥組細(xì)菌移位(BT)發(fā)生率顯著高于假手術(shù)組(P<0.01，χ2= 15)。尿毒癥組腸外器官檢出BT的百分比：淋巴結(jié)>肝臟>脾臟>外周血。假手術(shù)組10%個(gè)體(2例)腸系膜淋巴結(jié)中檢出示蹤菌(表2)。

圖2 尿毒癥組不同組織中DNA擴(kuò)增GFP基因片段電泳圖M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；N：陰性對(duì)照；P：陽(yáng)性對(duì)照；B1、M1、L1和S1分別為動(dòng)物NO.1血液、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟和脾臟;B2、M2、L2、S2分別示動(dòng)物NO.2血液、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟;依次類推

組別(n=20)檢出BT總個(gè)體數(shù)淋巴結(jié)檢出BT肝臟檢出BT脾臟檢出BT血液檢出BT假手術(shù)組2 (10)2 (10)000尿毒癥組14 (70)?14 (70)7 (35)6 (30)5 (25)

BT：細(xì)菌移位；MLNs：淋巴結(jié)；*：與假手術(shù)組比較，P<0.01

腸上皮細(xì)胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)假手術(shù)組腸上皮細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)完整、連接致密；胞膜表面絨毛整齊、走形規(guī)則。尿毒癥組腸上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)不完整，部分?jǐn)嗔眩B接疏松、電子密度降低；胞膜表面絨毛走形紊亂，部分上皮細(xì)胞絨毛斷裂、消失(圖3)。

圖3 兩組大鼠腸上皮細(xì)胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)(×50 000) A：表示假手術(shù)組；B：表示尿毒癥組；紅色箭頭示緊密連接超微結(jié)構(gòu)

腸道免疫組化假手術(shù)組腸黏膜表面緊密連接蛋白 Occludin、claudin-1 和JAM-1棕色顆粒較多，黏膜表面和隱窩均有緊密連接蛋白Occludin、claudin-1 和JAM-1分布；尿毒癥組腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白Occludin、claudin-1 和JAM-1表達(dá)下降，棕色顆粒明顯減少，且從黏膜表面向隱窩部位移位(圖4)。

血清炎癥介質(zhì)尿毒癥組血清IL-6、TNF-α和hs-CRP水平較假手術(shù)組顯著增高(P<0.05)。尿毒癥組和假手術(shù)組，在灌胃示蹤菌前、后，組內(nèi)IL-6、TNF-α、hs-CRP水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖5)。

圖4 兩組大鼠回腸Occludin、claudin-1、JAM-1表達(dá)(IH,×400)紅色箭頭示相應(yīng)蛋白染色呈棕色顆粒

圖5 尿毒癥及假手術(shù)組大鼠灌胃示蹤菌前后血清炎癥介質(zhì)IL-6、TNF-α、hs-CRP水平*：與假手術(shù)組(灌胃后)比較，P<0.05；#：與假手術(shù)組(灌胃前)比較，P<0.05；S1：假手術(shù)組(示蹤菌灌胃前)；S2：假手術(shù)組(示蹤菌灌胃后)；U1：尿毒癥組(示蹤菌灌胃前)；U2：尿毒癥組(示蹤菌灌胃后)

討 論

腸道是分隔腸腔中微生物和機(jī)體內(nèi)環(huán)境的重要壁壘，數(shù)量巨大的微生物系統(tǒng)與機(jī)體內(nèi)環(huán)境通過腸道屏障發(fā)生相互接觸作用。微生物與腸道相互作用的結(jié)果是或?yàn)槟c道所隔絕而局限于腸腔，或穿透上皮細(xì)胞層而被腸道免疫細(xì)胞消化殺滅，另有極少數(shù)細(xì)菌可作用于腸道組織或全身循環(huán)而導(dǎo)致多種炎癥性疾病[7-8]。尿毒癥時(shí)腸黏膜屏障功能決定了機(jī)體與微生物相互關(guān)系的最終走向，因此本研究通過探討腸道細(xì)菌移位評(píng)估尿毒癥腸黏膜屏障功能狀態(tài)，并進(jìn)一步探討腸道屏障功能障礙與微炎癥狀態(tài)關(guān)系。

腸道屏障包含機(jī)械屏障、生物屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障等多重含義。腸道細(xì)菌移位是評(píng)價(jià)腸道屏障功能的直接方法。細(xì)菌移位的概念由Berg于1979年提出，其定義為胃腸道的活細(xì)菌或其產(chǎn)物出現(xiàn)在胃腸以外的位置，如腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾、腎臟及血液[9]。本研究通過尿毒癥大鼠灌胃GFP標(biāo)記示蹤菌的方法，在腸外器官(腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟、外周血)中成功擴(kuò)增了特有的GFP基因片段，證實(shí)尿毒癥腸道細(xì)菌移位，該方法具有敏感、直觀、簡(jiǎn)便等的優(yōu)點(diǎn)。尿毒癥大鼠血液中炎癥介質(zhì)升高，結(jié)合細(xì)菌移位的情況分析，腸道屏障功能障礙使得腸腔中大量的細(xì)菌、內(nèi)毒素可突破腸黏膜上皮細(xì)胞層，與黏膜下免疫細(xì)胞相互作用，刺激腸道免疫反應(yīng)，亦能被腸道中免疫細(xì)胞吞噬并隨之移位入血循環(huán)，可能是導(dǎo)致機(jī)體微炎癥狀態(tài)的重要原因之一。

腸上皮緊密連接在維持腸黏膜通透性和完整性方面起著重要作用，是構(gòu)成腸道機(jī)械屏障的重要組成部分。本研究經(jīng)透射電鏡技術(shù)觀察到尿毒癥大鼠腸道上皮細(xì)胞間連接復(fù)合體結(jié)構(gòu)異常，其中緊密連接、黏附連接結(jié)構(gòu)模糊。并且發(fā)現(xiàn)尿毒癥大鼠回腸組織中緊密連接復(fù)合體中Occludin，Claudin-1，JMA-1蛋白表達(dá)降低，本研究結(jié)果與Vaziri等應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)慢性腎衰竭大鼠胃及腸道組織中上皮細(xì)胞間緊密連接復(fù)合體中Occludin，Claudin-1，ZO-1蛋白表達(dá)水平上降低[10-11]相一致，而我們的研究從超微結(jié)構(gòu)上對(duì)Vaziri 等試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了有益補(bǔ)充，也為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)的形態(tài)學(xué)信息。我們推測(cè)尿毒癥腸道菌群移位可能有以下幾個(gè)原因：(1)尿毒癥時(shí)結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間延長(zhǎng)，且患者飲食差異，使腸道菌群失調(diào)，需氧菌、兼性厭氧菌大量繁殖，具備了腸道細(xì)菌移位先決條件；(2)尿毒癥時(shí)腸道中含有尿毒酶基因的腸道細(xì)菌明顯增多。這些細(xì)菌在尿素酶作用下使尿素水解，其大量堿性產(chǎn)物能夠改變腸道內(nèi)化學(xué)環(huán)境[12]，影響了腸道的化學(xué)屏障；(3)尿毒癥時(shí)腸組織多有水腫、局部壞死，超微結(jié)構(gòu)觀察示腸上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)模糊、在蛋白水平亦呈現(xiàn)下降，即腸道機(jī)械屏障破壞；(4)尿毒癥時(shí)除機(jī)體整體免疫功能下降外，在腸道組織中亦表現(xiàn)為局部免疫功能的紊亂，尤其是腸道固有層中巨噬細(xì)胞由(抑炎型)M2型向(促炎型)M1型分化，這些巨噬細(xì)胞可攜帶吞噬的腸道細(xì)菌進(jìn)入血循環(huán)或遠(yuǎn)隔臟器。

本研究尿毒癥大鼠腸系膜淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的比例(14/20)明顯高于血液(5/20)、肝(7/20)、脾(6/20)的比例，這提示：(1)細(xì)菌移位發(fā)生在淋巴循環(huán)和血循環(huán)中，腸道細(xì)菌可通過腸壁上的毛細(xì)血管進(jìn)入血循環(huán)的肝門靜脈、再進(jìn)入其他臟器和組織的血循環(huán)，也可以通過腸系膜淋巴結(jié)進(jìn)入淋巴循環(huán)[13]、再回流到上腔靜脈中，但優(yōu)先途徑可能是淋巴途徑；(2)細(xì)菌在移位過程中，由于免疫組織和器官中巨噬細(xì)胞的免疫捕獲作用，使細(xì)菌在移位過程中被淋巴結(jié)、脾臟等組織器官的巨噬細(xì)胞吞噬、溶解，而無(wú)法進(jìn)入遠(yuǎn)隔部位的淋巴和血循環(huán)。腸系膜淋巴結(jié)相對(duì)于其他組織和器官離腸道最近，細(xì)菌移位最容易發(fā)生；有的大鼠僅在肝臟、脾臟、血液中一個(gè)或兩個(gè)器官中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，這也說明了機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌移位的抑制作用。

本研究假手術(shù)組大鼠中有2例腸系膜淋巴結(jié)中也發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，該結(jié)果與其他研究中發(fā)現(xiàn)的正常對(duì)照組腸系膜淋巴結(jié)也能檢測(cè)移位腸道菌的結(jié)論相一致[14]。分析原因：極少量正常個(gè)體中腸道菌群也可能會(huì)出現(xiàn)短暫波動(dòng)變化。當(dāng)腸道黏膜屏障受到損害、腸道血流量下降、宿主免疫功能下降等情況發(fā)生時(shí)，在正常個(gè)體也會(huì)發(fā)生腸道菌群移位，但細(xì)菌在移位過程中迅速被宿主免疫器官捕獲，不會(huì)在組織器官中長(zhǎng)期存在，更不會(huì)對(duì)正常人造成影響[15]，所以對(duì)照組雖然有2例腸系膜淋巴結(jié)中出現(xiàn)細(xì)菌，但在血、肝、脾中均未檢測(cè)到細(xì)菌。

綜上所述，本研究較全面的評(píng)價(jià)尿毒癥腸道屏障功能，尿毒癥大鼠存在腸黏膜屏障功能障礙，腸道細(xì)菌可移位進(jìn)入遠(yuǎn)隔臟器及血液循環(huán)并激活炎癥反應(yīng)，是微炎癥狀態(tài)的發(fā)生機(jī)制之一。機(jī)體免疫細(xì)胞與移位的腸道菌群具體的作用機(jī)制及部位仍需要深入研究。