韓欽維 吳智玉 吳金萍 劉瑾華 白 丹 楊麗娜

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，以上皮性卵巢癌最為常見[1]。早期卵巢癌無特異性癥狀，多數(shù)在晚期才被發(fā)現(xiàn)，>70%的患者在確診時(shí)已處于國際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)(FIGO)分期Ⅲ或Ⅳ期，發(fā)生腹腔內(nèi)廣泛轉(zhuǎn)移[2]。卵巢癌的治療包括手術(shù)、化學(xué)治療(簡稱化療)和放射治療(簡稱放療)，目前新的治療方法包括基因治療、血管生成抑制治療和免疫治療，但療效均不確切[3-5]?；熓锹殉舶┲委煹闹匾侄危鄶?shù)患者術(shù)后需輔助化療。鉑類藥物和紫杉醇是治療卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)化療方案[6-7]。在化療初期，患者的治療敏感率約為80%，但隨著化療時(shí)間的延長，多數(shù)患者對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致預(yù)后不良[8]。

在對(duì)抗腫瘤的過程中，細(xì)胞免疫是機(jī)體抗腫瘤免疫的主要形式。T淋巴細(xì)胞亞群可產(chǎn)生眾多細(xì)胞因子，在免疫細(xì)胞對(duì)抗腫瘤和免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮作用[9-10]，其中有4種細(xì)胞因子在激活細(xì)胞免疫和誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用。如IL-2可刺激細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)的殺瘤活性，IFN-γ是較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤因子，TNF-α可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡等[11-12]。近期研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，免疫微環(huán)境中的IFN-γ等細(xì)胞因子是機(jī)體對(duì)抗腫瘤的重要因素，在腫瘤耐藥性的形成過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過分析卵巢癌患者的順鉑耐藥與血清T淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平的相關(guān)性，旨在探討順鉑刺激對(duì)機(jī)體淋巴細(xì)胞，尤其是CD8+T淋巴細(xì)胞功能的影響，以及T淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子在順鉑耐藥過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 選擇2010年5月—2018年1月西安市兵器工業(yè)衛(wèi)生研究所婦產(chǎn)科收治的37例卵巢上皮性惡性腫瘤患者，年齡38～69歲，平均年齡為(54.00±13.11)歲?；颊呷朐汉缶邮苣[瘤細(xì)胞減滅手術(shù)聯(lián)合順鉑的化療，手術(shù)當(dāng)日留取腫瘤標(biāo)本進(jìn)行化療藥物的耐藥性檢測和T淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的檢測。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 檢測順鉑耐藥性 采用ATP生物熒光腫瘤體外藥物敏感檢測(ATP-TCA)法檢測腫瘤組織的順鉑耐藥性，ATP-TCA試劑盒(購自上海海創(chuàng)生物科技公司)包括完全培養(yǎng)液、腫瘤組織消化酶、ATP抽提劑、熒光素-熒光素酶、稀釋緩沖液、ATP標(biāo)準(zhǔn)液等。選用100%血漿峰值濃度(100%PPC)的順鉑(山東齊魯制藥有限公司)6.3 mg/L。主要操作步驟：取手術(shù)當(dāng)日留取的腫瘤標(biāo)本清洗剪碎，經(jīng)酶解液酶解后于檢測培養(yǎng)基中孵育約6 h，制成腫瘤細(xì)胞懸液，檢測細(xì)胞存活率。將順鉑分別按藥物使用濃度(6.3 mg/L)的200%、100%、50%、25%、12.5%和6.25%的濃度進(jìn)行配制。將腫瘤細(xì)胞加入含化療藥的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周后，以ATP提取液抽提腫瘤細(xì)胞ATP，應(yīng)用熒光素酶試劑檢測其熒光值。

1.3 ELISA法檢測血清中IL-2、TNF-α和IFN-γ水平 根據(jù)患者對(duì)順鉑的敏感和耐藥情況將其分為兩組，即耐藥組(11例)和敏感組(26例)，抽取兩組患者靜脈血，采用ELISA法檢測血清IL-2、TNF-α和IFN-γ水平。ELISA試劑盒購自美國eBioscences公司。將標(biāo)準(zhǔn)品按產(chǎn)品說明書稀釋，加入相應(yīng)的反應(yīng)孔中。收集樣本各50 μL加入相應(yīng)的反應(yīng)孔中，在各反應(yīng)孔中加入50 μL生物素標(biāo)記的抗體反應(yīng)液。移去各孔內(nèi)液體，加入200 μL洗滌液清洗反應(yīng)孔3次，每次5 min，移去洗滌液。隨后向各孔中加入100 μL的HRP偶聯(lián)抗體，置于室溫孵育30 min。移去各孔內(nèi)液體，加入洗滌液清洗反應(yīng)孔4次，每次5 min，移去洗滌液。每孔加入3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液100 μL，避光37 ℃孵育15 min。取出反應(yīng)板，加入50 μL終止液終止顯色反應(yīng)，立即檢測樣本在波長為450 nm處的吸光度(A450)值。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和腫瘤組織中IL-10、IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達(dá)水平 分別在耐藥組和敏感組隨機(jī)(對(duì)角線取樣法)選取6例患者，取其靜脈血樣本和腫瘤組織。采用Ficoll密度梯度離心法提取血液樣本PBMC，應(yīng)用QiagenRNA提取試劑盒(購自美國Qiagen公司)提取PBMC總mRNA，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。提取的細(xì)胞總mRNA經(jīng)cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自美國ThermoFisher公司)進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ的mRNA表達(dá)水平。應(yīng)用熒光定量PCR試劑盒(購自日本TaKaRa公司)進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，應(yīng)用iQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀(購自美國Bio-Rad公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。熒光定量實(shí)驗(yàn)以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算Ct值，采用2-ΔΔCt法相對(duì)定量各因子mRNA的表達(dá)水平。各引物序列：IL-10正向引物5’-CCC TGG GTG AGA AGC TGA AG-3’，IL-10反向引物5’-CAC TGC CTT GCT CTT ATT TTC ACA-3’；IL-2正向引物5’-ACT CAC CAG GAT GCT CAC AT-3’，IL-2反向引物5’-AGG TAA TCC ATC TGT TCA GA-3’；IL-4正向引物5’-ATG GGT CTC ACC TCC CAA CTG C-3’，IL-4反向引物5’-TTC CTG TCG AGC CGT TTC AG-3’；IFN-γ正向引物5’-AGT TAT ATC TTG GCT TTT CA-3’，IFN-γ反向引物5’-ACC GAA TAA TTA GTC AGC TT-3’；TNF-α正向引物5’-GCG TGT TCA TCC GTT CTC TAC-3’，TNF-α反向引物5’-TTC TGA GCA TCG TAG TTG TTG G-3’；GAPDH正向引物5’-AGG TGA AGG TCG GAG TCA ACG-3’，GAPDH反向引物5’-AGG GGT CAT TGA TGG CAA CA-3’。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測PBMC和CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中IFN-γ蛋白質(zhì)表達(dá)水平 收集敏感組和耐藥組患者的靜脈血樣本，采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC，將新鮮分離的PBMC以流式洗液洗滌2次后垂懸調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。分別以抗人CD3的FITC熒光染料抗體(anti-hCD3-FITC抗體)和抗人CD8的多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物(PerCP)熒光染料抗體(anti-hCD8-PerCP抗體)標(biāo)記PBMC表面的CD3和CD8分子，于4 ℃孵育40 min后以流式洗液洗滌3次。用細(xì)胞透膜液處理細(xì)胞后，以抗人IFN-γ的藻紅蛋白(PE)熒光染料抗體(anti-hIFN-γ-PE抗體)標(biāo)記細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ，于4 ℃孵育40 min后以流式洗液洗滌3次。用500 μL流式洗液將各組細(xì)胞垂懸后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測PBMC和CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中IFN-γ蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者血清IL-2、TNF-α、IFN-γ水平 耐藥組血清IL-2和IFN-γ水平均顯著低于敏感組(P值均<0.05)，兩組間血清TNF-α水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

組別NIL-2TNF-αIFN-γ耐藥112.934±0.82510.590±0.6475.231±0.905敏感26 3.551±0.745①10.800±1.059 6.685±1.380①

與耐藥組比較：①P<0.05

2.2 兩組患者腫瘤組織和PBMC中IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ的mRNA表達(dá)水平 敏感組腫瘤組織中TNF-α和IFN-γ的mRNA表達(dá)水平均顯著高于耐藥組(P值均<0.05)，兩組間IL-2、IL-4、IL-10的mRNA表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)；敏感組PBMC中IFN-γ的mRNA表達(dá)水平顯著高于耐藥組(P<0.05)，IL-2、IL-4、IL-10和TNF-α的mRNA表達(dá)水平較耐藥組有升高的趨勢(shì)，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表2。

2.4 兩組患者PBMC和CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中IFN-γ蛋白質(zhì)表達(dá)水平 兩組PBMC中IFN-γ蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，敏感組CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞中的IFN-γ蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著高于耐藥組(P值分別<0.01、0.05)。見表3。

組別腫瘤組織IL-2IL-4IL-10TNF-αIFN-γPBMCIL-2IL-4IL-10TNF-αIFN-γ耐藥3.082±2.5882.188±0.8522.211±0.1310.580±0.2580.419±0.1561.463±0.8983.301±1.7480.576±0.2332.801±2.6241.266±1.239敏感2.730±1.0632.927±1.4431.569±0.4273.701±1.427①1.220±0.220①2.016±1.5145.050±4.6040.813±0.6043.632±3.6392.998±1.331①

與耐藥組比較：①P<0.05

組別NPBMCCD4+T淋巴細(xì)胞CD8+T淋巴細(xì)胞耐藥1122.535±2.89027.643±5.67210.813±0.953敏感2626.878±3.87434.867±4.629②13.787±0.925①

與耐藥組比較：①P<0.01，②P<0.05

3 討 論

目前，腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑類藥物化療是公認(rèn)的卵巢上皮性惡性腫瘤標(biāo)準(zhǔn)化治療方案。順鉑作為一線化療藥物被廣泛應(yīng)用于臨床，對(duì)各種實(shí)體腫瘤均有明顯的治療效果[15]。Tomao等[16]研究發(fā)現(xiàn)，順鉑可抑制包括DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄在內(nèi)的眾多細(xì)胞代謝過程，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，順鉑還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡受體5(DR5)等細(xì)胞凋亡信號(hào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡[16-17]。然而，腫瘤細(xì)胞可對(duì)鉑類藥物產(chǎn)生耐受，嚴(yán)重影響化療效果，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)[15,18]。因此，明確鉑類藥物的耐藥機(jī)制對(duì)提高卵巢癌的化療效果具有重要意義。本研究對(duì)卵巢癌患者順鉑耐藥與免疫細(xì)胞因子水平的相關(guān)性進(jìn)行分析，檢測順鉑對(duì)機(jī)體淋巴細(xì)胞，尤其是T淋巴細(xì)胞功能的影響。

本研究結(jié)果顯示，順鉑敏感組的腫瘤組織、血清和PBMC中IFN-γ水平均顯著高于順鉑耐藥組，表明順鉑耐藥組患者T淋巴細(xì)胞IFN-γ分泌功能顯著低于順鉑敏感組，提示患者對(duì)順鉑藥物的敏感性可能與T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答狀態(tài)相關(guān)。IFN-γ是重要的抗腫瘤細(xì)胞因子。近期研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織成纖維細(xì)胞分泌的谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸可通過協(xié)同運(yùn)輸?shù)姆绞浇閷?dǎo)順鉑從腫瘤細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外運(yùn)輸，從而減少順鉑在腫瘤細(xì)胞中的積累，降低其敏感性；但另一方面，腫瘤間質(zhì)CD8+T淋巴細(xì)胞可通過分泌IFN-γ減少成纖維細(xì)胞半胱氨酸和GSH代謝，對(duì)順鉑向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生抑制作用。本研究結(jié)果顯示，敏感組CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞中的IFN-γ水平均顯著高于耐藥組，提示IFN-γ水平升高可能在順鉑耐藥形成過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，順鉑藥物耐藥性可能與CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答狀態(tài)相關(guān)，血清、PBMC和腫瘤組織中IFN-γ水平升高可能對(duì)維持卵巢上皮性惡性腫瘤患者順鉑藥物敏感性具有重要意義。