郭榮霞 張瀟予 劉 飛 劉 鵬 王 彤 羅鴻博 許元富

(中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院血液病醫(yī)院血液學研究所，實驗血液學國家重點實驗室,天津 300020)

目前，放療仍是臨床治療腫瘤的重要手段，但是放射線在殺傷腫瘤細胞的同時也不可避免地殺傷了正常組織細胞，尤其是血液系統(tǒng)對放射線比較敏感，易被誘發(fā)遺傳物質的損傷，從而發(fā)生凋亡和壞死。造血系統(tǒng)的損傷導致患者骨髓抑制、免疫力減低,引發(fā)感染、臟器衰竭等并發(fā)癥，是患者產生副作用甚至死亡的主要原因[1-3]。因此，如何有效促進放療后骨髓粒系造血恢復是目前臨床面臨的一項重大問題。

成體哺乳動物的粒系造血發(fā)生在骨髓內，多種細胞因子參與其中，如粒細胞集落刺激因子(Granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)、IL-6、IL-3、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、IL-1β等炎癥因子均可直接或間接作用于造血干細胞(Hematopoietic stem cell，HSC)、多能祖細胞(Multipotent progenitor cell，MPP)、粒系-巨噬系祖細胞(Granulocyte-macrophage progenitor cell，GMP)等造血干/祖細胞來調控粒系造血。中性粒細胞作為機體防御外來微生物入侵的第一道防線，在天然免疫系統(tǒng)中起著非常重要的作用。它來源于骨髓內的HSC，HSC向下分化形成MPP，MPP再向下游分化為多種定向祖細胞，其中GMP向粒系分化的過程需要經歷一系列的分化階段，即原始粒細胞(Myeloblast，MB)、早幼粒細胞(Promyelocyte，PM)、中幼粒細胞(Myelocyte，MC)、晚幼粒細胞(Metamyelocyte，MM)以及桿狀核和分葉核粒細胞(Band cell and segmented cell，BC & SC)，最終才能形成功能成熟的中性粒細胞[4,5]。

細菌內毒素能夠提高照射后小鼠的生存率，IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-12等炎癥因子具有與內毒素類似的效應，能夠促進照射后小鼠的造血恢復，且協(xié)同作用效果更佳[6-11]。HIE.coli能夠促進IL-1β、G-CSF、TNF-α、IL-6等炎癥因子的分泌與釋放，通過建立HIE.coli誘導的腹腔炎癥模型，能有效觀察各炎癥因子的協(xié)同作用對造血系統(tǒng)的影響。我們實驗室前期工作發(fā)現(xiàn)了運用HIE.coli建立腹腔炎癥模型可以誘導急性粒系造血[12]，但是否對放療后造血恢復有作用尚不可知。本研究通過對接受全身照射的HIE.coli腹腔炎癥模型小鼠造血系統(tǒng)恢復情況的檢測，發(fā)現(xiàn)HIE.coli誘導的小鼠體內急性炎癥微環(huán)境影響了骨髓造血干/祖細胞，尤其是粒系-巨噬系祖細胞，促進照射后小鼠粒系的恢復，提高了照射后小鼠的生存率。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 實驗所用小鼠均由本院動物中心代購自北京華阜康實驗動物有限公司或北京維通利華實驗動物有限公司，所有小鼠品系均為C57BL/6(白細胞抗原表型CD45.2)，8～12周齡。實驗過程中所有小鼠均飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院血液學研究所動物管理中心的SPF級動物房；實驗獲得中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院血液學研究所動物管理中心及倫理委員會的批準。

1.1.2主要試劑及儀器 小鼠抗體:lineage cell detection cocktail(Miltenyi Biotec GmbH，130-092-613)、streptavidin-PE/CY7(BioLegend，cat 405206)、FITC-anti mouse CD34(eBioscience，11-0341-82)、APC/CY7-anti-mouse Sca-1(BioLegend，cat 108125)、APC-anti mouse CD117(c-kit)(BioLegend，cat 105811)、PE-anti-mouse Ly6G(BioLegend,cat 127608)、Biotin anti-mouse-CD45R/B220(BioLegend，cat 103222)、Biotin anti-mouse-CD45R/CD8a(BioLegend，cat 100704)、Biotin anti-mouse-Ter-119(BioLegend，cat 116204)、Biotin anti-mouse CD4(BioLegend，cat 100508)；流式細胞儀(Canto Ⅱ)購自BD公司，血球計數(shù)儀(XT2000i)購自Sysmex公司。微生物搖床購自Beckman公司，酶標儀(Synergy H4)購自BioTek公司。

1.1.3HIE.coli實驗用E.coli為菌種Escheri-chia coli，strain 19138，購自美國ATCC。

1.2方法

1.2.1HIE.coli致小鼠急性腹腔炎癥模型 實驗用E.coli菌種保存在-80℃的菌種凍存液中，使用前經過二次活化，使菌達到良好的生長狀態(tài)，即指數(shù)生長期。經70℃加熱菌體懸液30 min，放置室溫后給每只小鼠腹腔注射1×107CFU。

1.2.2輻射損傷模型的建立 小鼠腹腔注射HIE.coli24 h后，根據(jù)實驗需求采用不同輻射劑量處理小鼠。本文所使用的輻射裝置為RS2000系列生物學X-ray輻射儀，購自Rad Source公司，電壓為160 V，電流為25 mA，劑量率為1.2 Gy/min。

1.2.3外周血血細胞檢測 小鼠尾巴末端或眼球后靜脈竇取血20 μl，置于PBSE(含0.02%EDTA的PBS溶液)溶液中，血液與PBSE溶液的體積比為1∶4，以達到抗凝和稀釋的作用。應用全自動血常規(guī)檢測儀分析外周血細胞的數(shù)目和分類。

1.3統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計學分析采用GraphPad Prism 5.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。組間均值比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1HIE.coli預處理提高了照射后小鼠的生存率 將HIE.coli腹腔注射到小鼠體內建立急性腹腔炎癥模型，每只小鼠注射1×107CFU/300 μl，對照組注射等量體積的生理鹽水(Normal saline，NS)，24 h后，給予小鼠7 Gy照射并觀察其狀態(tài)及生存(圖1)。結果顯示對照組(n=7)中大多數(shù)小鼠在照射后第8天不良癥狀明顯，主要表現(xiàn)為:體重減輕，毛發(fā)缺乏光亮，眼睛無神，食欲下降，身體蜷縮等，且在照射后第10天、第11天、第12天分別有3只(43%)、1只(14%)、3只(43%)小鼠死亡，即對照組在照射后第10天到第12天內全部死亡，死亡率為100%。而HIE.coli預處理后(n=7)明顯提高了照射后小鼠的生存率，實驗組僅在照射后第17天有1只小鼠死亡，明顯晚于對照組，且在后期(照射后30 d內)并無小鼠死亡，即死亡率僅為14%，明顯低于對照組。這些結果表明照射前用HIE.coli預處理小鼠能夠明顯提高照射后小鼠的生存率。

圖1 生理鹽水和熱滅活的大腸埃希菌預處理對7 Gy照射后小鼠的生存情況的影響Fig.1 Impact of pretreatment with heat-inactivated E.coli(HI E.coli)to mice irradiated by 7 Gy compa-red to normal saline(NS)Note: A.Schematic of the experiment process;B.The survival rate.*.P<0.05,**.P<0.001,***.P<0.000 1.

2.2照射后小鼠的造血系統(tǒng)嚴重受損 給予小鼠7 Gy照射，分別在照射后1、2、4、7、9、12 d檢測照射后小鼠的受損情況。結果發(fā)現(xiàn)，輻射后小鼠的造血系統(tǒng)嚴重受損(圖2)，主要表現(xiàn)為:小鼠骨髓細胞總數(shù)在照射后急劇下降，第4天到第7天降到最低水平，每根股骨僅有1×105個細胞，7 d后開始恢復(圖2B)；脾臟的重量在照射后1 d驟降，到第7天降到最低水平，僅有(0.020±0.002 1)g，約為正常脾重的1/4，同骨髓細胞總數(shù)一樣，脾臟細胞數(shù)在照射7 d后開始恢復(圖2C)；外周各種血細胞急劇減少，其中紅細胞、血紅蛋白、血小板逐漸減少(圖2F)，白細胞、單核細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞在照射后1 d之內急劇下降到最低水平，中性粒細胞在照射后迅速降低，僅在第2天略有升高，之后即維持在最低水平，第7天開始恢復(圖2G～J)。

圖2 小鼠經7 Gy輻射后的造血系統(tǒng)損傷和血象變化Fig.2 Injury to hematopoietic system and hemogram of mice irradiated by 7 GyNote: A.Schematic of the experiment process;B.Total bone marrow number;C.Spleen weight;D-J.Different cell type in peripheral blood(PB).*.P<0.05,**.P<0.001,***.P<0.000 1.

這些結果表明經7 Gy照射后，小鼠的外周血以及骨髓、脾臟在內的造血器官均嚴重受損，在照射后第3天至第7天骨髓處于抑制狀態(tài)，主要表現(xiàn)為粒細胞、血小板以及紅細胞、淋巴細胞減少。在此期間，血細胞減少會導致出血、貧血；同時，照射也會損傷腸黏膜，使得腸道菌群釋放引發(fā)感染；而粒細胞的缺乏還會增加細菌、真菌等病原微生物感染的風險。這些都是導致小鼠照射相關高死亡率的重要原因。因此，及時促進照射后小鼠造血系統(tǒng)的恢復對提高生存率具有重要意義。

2.3HIE.coli預處理促進照射后小鼠造血系統(tǒng)的恢復 由于經7 Gy照射后，小鼠骨髓恢復速度較慢，且死亡率較高，不利于對造血干/祖細胞以及粒系各階段前體細胞的分析。為了觀察照射后骨髓恢復的規(guī)律，我們采用非致死劑量(4 Gy)照射小鼠，實驗組小鼠在照射前24 h用HIE.coli預處理小鼠(1×107CFU/mouse)，對照組腹腔注射等體積的生理鹽水。在照射后第7天檢測小鼠外周血、脾臟、骨髓造血的恢復情況發(fā)現(xiàn)(圖3):照射后第7天，實驗組小鼠和對照組相比，經HIE.coli預處理的小鼠造血恢復明顯加快，主要表現(xiàn)為:脾臟明顯增大(P=0.002 8)，且有脾結節(jié)(圖3B、D)；骨髓細胞數(shù)目增多(P<0.001)(圖3E)，病理報告顯示，HIE.coli預處理的小鼠骨髓增生明顯活躍(包括粒系、紅系、巨核系)，且以粒系為主(圖3C)；外周血紅細胞、血紅蛋白、血小板數(shù)目均有一定程度的增多；白細胞總數(shù)也增多，淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞沒有明顯差異，但中性粒細胞數(shù)目明顯增多(P<0.05)(圖3F)。

圖3 小鼠經4 Gy照射后第7天的造血恢復能力的比較和分析Fig.3 Comparison and analysis recovery ability of hematopoietic system of mice irradiated by 4 Gy at day 7Note: A.Schematic of the experiment process;B.Spleen;C.Bone marrow biopsy(HE staining was performed on femur sections);D.Spleen weight;E.Total bone marrow number;F-I.Different cell types in PB.*.P<0.05,**.P<0.001,***.P<0.000 1.

2.4HIE.coli預處理促進照射后小鼠骨髓造血干/祖細胞及粒系的恢復 造血干/祖細胞是所有血細胞和免疫細胞的來源，有效促進照射后小鼠造血干/祖細胞的恢復對小鼠生存率的提高具有重要作用。我們發(fā)現(xiàn)HIE.coli預處理組和對照組相比，骨髓中的LSK(lin-Sca-1+c-kit+)比例雖無統(tǒng)計學差異，但絕對數(shù)略有升高(P<0.05)。此外，包括LK(lin-Sca-1-c-kit+)、髓系共同祖細胞(Comment myeloid progenitor，CMP)(LK CD34+CD16/32-)在內的造血祖細胞的比例和絕對數(shù)相較于對照組均明顯增多，其中GMP(lin-Sca-1-c-kit+CD34+CD16/32+)最為明顯(P<0.001)(圖4A～C)。GMP可進一步增殖分化成原始粒細胞、早幼粒細胞、中幼粒細胞、晚幼粒細胞以及桿狀核和分葉核粒細胞[5]。因此，我們進一步檢測了骨髓粒系分化的情況，發(fā)現(xiàn)HIE.coli預處理組粒系分化明顯加快(P<0.05)(圖4D～F)。

圖4 小鼠經4 Gy照射后第7天造血干/祖細胞(A)、粒系細胞(B)的恢復的比較和分析Fig.4 Comparison and analysis recovery of hematopoietic stem/progenitor cells(A)and granulocytes(B)of mice after irradiated by 4 Gy at day 7Note: A-C.The recovery of hematopoietic stem/progenitor cells after irradiation;D-F.The recovery of granulocytes after irradiation.*.P<0.05,**.P<0.001,***.P<0.0001.

以上結果表明HIE.coli預處理能夠促進照射后小鼠外周血以及骨髓、脾臟等造血器官的恢復，且能通過作用于GMP來促進粒系造血，從而提高了照射后小鼠的生存率。

3 討論

放療是當前治療腫瘤的常用手段，而造血系統(tǒng)對放射線比較敏感，易被誘發(fā)凋亡或壞死，造血系統(tǒng)的損傷可導致患者骨髓抑制、免疫力減低，易發(fā)生感染、臟器衰竭等并發(fā)癥，是患者治療相關高死亡率的重要原因。血細胞及免疫細胞來源于造血干/祖細胞的增殖分化，促進造血干/祖細胞的增殖分化對照射后小鼠的恢復意義重大。

細菌內毒素能夠提高照射后小鼠的生存率，近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子能夠明顯促進照射后小鼠造血的恢復，且協(xié)同作用效果更佳[6-11]。HIE.coli能夠促進IL-1β、G-CSF、TNF-α、IL-6等炎癥因子的分泌與釋放，此外，我們實驗室前期工作發(fā)現(xiàn)運用HIE.coli建立的腹腔炎癥模型可以誘導急性粒系造血[12]，但是對放療后小鼠造血系統(tǒng)的影響尚未進行研究。Neta等[7]研究表明在照射前腹腔給予IL-1β能夠明顯提高小鼠的生存率，而照射后再用IL-1β挽救則無明顯效果，隨后又有多個實驗室報道了IL-1β的這種效應[13，14]。因此，我們在照射前24 h腹腔局部注射HIEcoli建立小鼠腹腔炎癥，通過這個模型來研究炎癥因子對照射后造血系統(tǒng)的影響，避免了某個炎癥因子作用的單一性，從而有效利用了HIE.coli刺激后各炎癥因子的協(xié)同作用。本研究結果表明經HIE.coli誘發(fā)的急性腹腔炎癥能夠明顯提高照射后小鼠的生存率，且從小鼠外周血各細胞類型的數(shù)量、脾臟的大小以及骨髓細胞總數(shù)、造血干/祖細胞等方面來看，HIE.coli誘發(fā)的急性腹腔炎癥能夠明顯促進照射后小鼠造血系統(tǒng)的恢復，其中粒系恢復較對照組最為明顯。本研究發(fā)現(xiàn)經非致死劑量(4 Gy)照射后第7天，實驗組與對照組相比造血恢復明顯加快。我們實驗室前期工作發(fā)現(xiàn)腹腔注射HIE.coli36 h后，造血祖細胞BrdU陽性率明顯增多[12]，說明HIE.coli腹腔注射36 h內便會有造血祖細胞的增殖；Pietras等[15]證明炎癥因子可促進造血干/祖細胞的增殖分化，均提示HIE.coli誘導的炎癥反應能夠促進造血恢復。因此，我們猜測照射后實驗組小鼠造血恢復加快一方面可能是因為炎癥反應促進了機體中大量的炎癥因子的產生，改變了骨髓中的造血微環(huán)境，激活了造血干/祖細胞的抗凋亡或促存活機制，導致一些造血干/祖細胞產生抗輻射效應[16]；另一方面，我們猜測HIE.coli誘導的炎癥促進造血干/祖細胞的數(shù)目增多，導致S期(放射不敏感)造血干/祖細胞的數(shù)目增多[17]?？傊狙芯堪l(fā)現(xiàn)HIE.coli誘導的炎癥反應最終促進了照射后小鼠的造血恢復，其中GMP最為明顯，其具體機制還需要進一步的工作去證實。

我們已知HSC、MPP、GMP等造血干/祖細胞表面存在多種炎癥因子受體，如白介素1受體(Interleukin-1 receptor，IL-1R)、粒細胞集落刺激因子受體(Granulocyte colony stimulating factor receptor，G-CSFR)、Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)等[18]。因此，這些炎癥因子能夠直接或間接作用于HSC、MPP、GMP等造血干/祖細胞并促進其增殖并向髓系分化[4，11]。但HIE.coli在促進IL-1β、IL-12、TNF-α、IL-6、SCF等具有照射保護作用的因子分泌的同時也會導致影響照射后小鼠生存質量的因子的釋放，如TGF-β、INFα/β。因此，HIE.coli是如何作用于細胞并促進這些炎癥因子的分泌與釋放，如何在小鼠體內形成一個有效的炎癥相關因子網絡促進IL-1β、IL-12、TNF-α、IL-6、SCF的作用而抑制TGF-β、INFα/β的效應，如何作用于造血干/祖細胞促進其向粒系分化以達到照射后小鼠恢復的效應，這些問題目前還不清楚，有待我們進一步研究。