衣同輝 王宏蘭 王 潔 張春晶 譚佳音 潘洪明 劉哲丞

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，齊齊哈爾 161006)

原發(fā)性支氣管肺癌簡稱肺癌，近年來肺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年增高的趨勢[1]。其治療首選手術(shù)方式，但多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已到了中晚期，失去了手術(shù)的最佳機(jī)會(huì)，因此放射治療和化學(xué)藥物治療成為臨床治療肺癌的主要手段。但常規(guī)放療、化療因毒副作用大，導(dǎo)致多數(shù)患者無法完成有效的放化療周期。同時(shí)，肺癌的發(fā)病類型中以非小細(xì)胞肺癌居多，占肺癌發(fā)病率的85%以上，該類型肺癌對化療藥物敏感性低，治療有效率及生存率均不佳。鑒于傳統(tǒng)放化療效果沒有取得更大進(jìn)展，故臨床上迫切需要開發(fā)新的抗肺癌藥物[2]。

人參(Pana.x ginseng)為五加科多年生草本植物，具有防治腫瘤、延緩衰老、抗輻射等多種生物學(xué)活性，人參皂苷是其主要活性成分。人參皂苷有多種，其中人參皂苷20(S)-Rh2具有阻滯腫瘤細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等活性[3,4]。BMAP28肽是一條由28個(gè)氨基酸組成的α螺旋結(jié)構(gòu)肽，帶有7個(gè)正電荷，于1996年首次報(bào)道[5]，屬于Cathelicidin肽家族，最初發(fā)現(xiàn)BMAP28肽具有抗細(xì)菌和真菌活性[6]。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)該肽還具有抗病毒和抗淋巴細(xì)胞瘤等活性[7,8]。因此，本研究選用非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549，探討人參皂苷20(S)-Rh2聯(lián)合BMAP28肽對細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)凋亡的影響及機(jī)制，為臨床上肺癌的聯(lián)合治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 肺癌細(xì)胞株A549購自中科院細(xì)胞庫，人參皂苷20(S)-Rh2購自中國食品藥品檢定研究院，BMAP肽和FITC-BMAP28肽由安徽國平藥業(yè)公司合成鑒定。胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司，DMEM-H培養(yǎng)基購自Gibco公司，CCK-8試劑盒購自南京碧云天生物技術(shù)公司，Muse Annexin V Dead Cell Kit購自默克密理博公司，DAPI熒光染料購自北京索萊寶生物科技有限公司。β-tubulin單抗、PARP單抗、Caspase單抗、Cytochrome C單抗和Bax單抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1CCK-8法測定20(S)-Rh2和BMAP28肽聯(lián)合作用指數(shù)(CI) A549細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)用0.25%胰酶消化，用10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液后，按照0.5×104個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔板中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。鏡下觀察，待細(xì)胞鋪滿后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

將A549細(xì)胞分為四組：對照組、人參皂苷20(S)-Rh2處理組、BMAP28肽處理組和聯(lián)合用藥組[20(S)-Rh2聯(lián)合BMAP28肽]。其中對照組未經(jīng)藥物處理；人參皂苷20(S)-Rh2處理組：將人參皂苷20(S)-Rh2用70%乙醇水溶液溶解，配制為100 mg/ml母液(經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)證明所含乙醇濃度對細(xì)胞活性無影響，數(shù)據(jù)省略)，然后用DMEM-H培養(yǎng)基梯度稀釋為10個(gè)濃度(分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 μg/ml)；BMAP28肽處理組：將BMAP28肽用DMEM-H培養(yǎng)基梯度稀釋為10個(gè)濃度(分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 μg/ml)。

對照組每孔中加入100 μl DMEM-H培養(yǎng)基；人參皂苷20(S)-Rh2處理組和BMAP28肽處理組每孔分別加入100 μl人參皂苷20(S)-Rh2和BMAP28肽，每組設(shè)置8個(gè)復(fù)孔，置于37℃孵育24 h后，按照試劑盒說明按20 μl/孔加入CCK-8檢測試劑，孵育3.5 h后以650 nm作為參考波長，在450 nm測定吸光度。進(jìn)行人參皂苷20(S)-Rh2和BMAP28肽抑制率和半數(shù)抑制濃度IC50測定。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。

聯(lián)合用藥組[20(S)-Rh2聯(lián)合BMAP28肽]：以上述半數(shù)抑制濃度IC50為基礎(chǔ)，選擇合適的20(S)-Rh2和BMAP28肽聯(lián)合用藥的濃度，計(jì)算聯(lián)合用藥組IC50，測定聯(lián)合作用指數(shù)(CI)[9]，CI計(jì)算方法如下：CI=(Dxa+Dxb)/(Da+Db)+DxaDxb/DaDb，Da和Db分別為20(S)-Rh2和BMAP28肽單一作用抑制細(xì)胞生長x%時(shí)的濃度；Dxa和Dxb分別是20(S)-Rh2和BMAP28肽聯(lián)合作用抑制細(xì)胞生長x%時(shí)的藥物濃度。

1.2.2DAPI/FITC-BMAP28熒光雙染法檢測A549細(xì)胞凋亡形態(tài)變化 根據(jù)1.2.1各組IC50測定結(jié)果，選擇FITC-BMAP28肽和20(S)-Rh2單獨(dú)作用及聯(lián)合用藥濃度。將A549細(xì)胞分為四組：對照組；人參皂苷20(S)-Rh2處理組(濃度為30 μg/ml)；BMAP28肽處理組(濃度為10 μg/ml)；聯(lián)合用藥組：20(S)-Rh2(30 μg/ml)+BMAP28(10 μg/ml)。

取處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，0.25%胰酶消化，按1×106個(gè)/孔接種于6孔板中，待培養(yǎng)貼壁后，加入10 μl DAPI染色工作液后，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育4 h，使用PBS緩沖液洗滌2～3次后，對照組加入100 μl DMEM-H培養(yǎng)基，各處理組分別加入100 μl藥物，作用4 h后使用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測20(S)-Rh2和BMAP28聯(lián)合作用對A549細(xì)胞凋亡的影響 按照1.2.2將A549細(xì)胞分為四組，并分別進(jìn)行加藥處理24 h后，離心收集各組細(xì)胞，棄上清，每管加入50 μl不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照Muse Annexin V Dead Cell Kit檢測試劑盒的操作流程進(jìn)行染色，最后使用Muse細(xì)胞分析儀進(jìn)行樣品檢測。按照試劑盒說明將雙參數(shù)散點(diǎn)圖進(jìn)行分相分析，以獲得各組中正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的比例。

1.2.4Caspase-3和Caspase-9的活性檢測 Caspase在細(xì)胞線粒體途徑凋亡通路中起關(guān)鍵作用。當(dāng)Caspase-3激活時(shí)PARP被裂解為分子量分別為85 kD和31 kD的兩個(gè)片段。Caspase-9是線粒體凋亡通路中的起始Caspase，細(xì)胞凋亡時(shí)，Caspase-9裂解為分子量為47 kD和37 kD的兩個(gè)片段。利用Caspase-3底物PRAP的裂解情況和Caspase-9裂解情況確定人參皂苷20(S)-Rh2和BMAP28肽聯(lián)合用藥在線粒體凋亡通路中的作用。

按照1.2.2將A549細(xì)胞分為四組。對照組未進(jìn)行加藥處理，其他3組按1.2.2中描述分別進(jìn)行加藥處理，作用24 h后，分別收集各組細(xì)胞并加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，以12 000 g，4℃離心10 min，取上清液進(jìn)行Western blot檢測。首先應(yīng)用DC Protein Assay Kit進(jìn)行樣品蛋白質(zhì)濃度測定后，將提取物按30 μg/孔進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜，封閉液中室溫封閉1.5 h，加入相應(yīng)稀釋倍數(shù)的一抗，孵育過夜，洗膜后，加入1∶5 000的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫孵育3 h，曝光膠片后用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.2.5A549細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞色素C和Bax水平變化的檢測 按照1.2.2將A549細(xì)胞分為四組。按照1.2.4實(shí)驗(yàn)相同方法，收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測各組細(xì)胞色素C和Bax蛋白水平的變化。

2 結(jié)果

2.1CCK-8法測定20(S)-Rh2和BMAP28肽聯(lián)合作用指數(shù)(CI)結(jié)果 人參皂苷20(S)-Rh2和BMAP28肽分別作用A549細(xì)胞24 h后，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞增殖活性逐漸下降，呈濃度依賴性。人參皂苷20(S)-Rh2 IC50為35.36 μg/ml，BMAP28肽IC50為51.25 μg/ml(圖1)。

圖1 20(S)-Rh2和BMAP28肽單獨(dú)作用對A549細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of 20(S)-Rh2 and BMAP28 peptides on proliferation of A549 cells

以人參皂苷20(S)-Rh2 和BMAP28肽IC50為基礎(chǔ)，聯(lián)合用藥物濃度不超過藥物單獨(dú)作用時(shí)的IC50為原則，選擇人參皂苷20(S)-Rh2 和BMAP28肽聯(lián)合用藥的最佳濃度組合。人參皂苷20(S)-Rh2選擇30 μg/ml，BMAP28肽選擇10、20、30、40、50 μg/ml 進(jìn)行聯(lián)合(表1)，測定協(xié)調(diào)抑制率并計(jì)算得到聯(lián)合作用指數(shù)CI均小于1，說明20(S)-Rh2和BMAP28肽具有協(xié)同效應(yīng)。當(dāng)20(S)-Rh2濃度為30 μg/ml時(shí)，BMAP28肽選擇10 μg/ml時(shí)CI值(0.47±0.08)為最優(yōu)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇該濃度組合。

表1 20(S)-Rh2與BMAP28肽聯(lián)合作用的抑制率和協(xié)同指數(shù)

Tab.1 Inhibition rates and CIs of 20 (S)-Rh2 combined with BMAP28 peptide

20(S)-Rh2(μg/ml)BMAP28(μg/ml)Combinationinhibition ratio(%)CI1048.1±2.80.47±0.082062.6±5.60.53±0.11303078.7±2.40.55±0.094087.6±4.10.55±0.045096.1±5.70.55±0.02

2.2DAPI/FITC-BMAP28熒光雙染法檢測A549細(xì)胞凋亡形態(tài)變化 按照1.2.2分組及給藥情況，使用DAPI/FITC-BMAP28熒光雙染法檢測A549細(xì)胞凋亡形態(tài)變化。與對照組相比，藥物作用A549細(xì)胞4 h后，人參皂苷20(S)-Rh2處理組出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)皺縮和染色體濃縮現(xiàn)象，這與已有報(bào)道相符合[10]。FITC-BMAP28肽處理組：各組細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞出現(xiàn)空泡，細(xì)胞間形態(tài)模糊。DAPI染色后可見細(xì)胞核大小不一，出現(xiàn)核內(nèi)部分染色質(zhì)斷裂、皺縮，形成團(tuán)塊現(xiàn)象。A549細(xì)胞形態(tài)變化與以往報(bào)道結(jié)果相似[11]。異硫氰酸熒光素FITC只有進(jìn)入細(xì)胞膜后，才能發(fā)出綠色熒光[12]。在該組中，觀察到綠色熒光現(xiàn)象，說明FITC-BMAP28肽可以穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部促進(jìn)細(xì)胞凋亡。聯(lián)合用藥組中細(xì)胞間形態(tài)模糊，產(chǎn)生大量碎片，綠色熒光強(qiáng)度高于單獨(dú)用藥組，說明聯(lián)合用藥組可以更好殺傷A549細(xì)胞(圖2)。

圖2 20(S)-Rh2和FITC-BMAP28肽協(xié)同作用形態(tài)學(xué)變化(×400)Fig.2 Morphological changes of synergistic effect of 20(S)-Rh2 and FITC-BMAP 28 peptide(×400)Note:1.Light microscope;2.DAPI staining;3.FITC-BMAP 28 peptide staining;4.Combination of DAPI staining and FITC-BMAP 28 peptide staining.

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測20(S)-Rh2/BMAP28聯(lián)合作用對A549細(xì)胞凋亡的影響 將作用24 h后的A549細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。如圖3所示，對照組、20(S)-Rh2組、BMAP-28肽和聯(lián)合用藥組凋亡率分別為(0.02±0.05)%、(22.18±3.91)%、(37.38±4.53)%和(47.10±2.36)%。與對照組相比，各用藥組均對A549細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)凋亡作用。聯(lián)合用藥組凋亡率與20(S)-Rh2組、BMAP-28肽組比較，也有顯著性差異(P<0.05)，說明聯(lián)合用藥組可以更好促進(jìn)細(xì)胞凋亡(圖3)。

圖3 A549細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果Fig.3 Flow cytometry detection results of apoptosis in A549 cells

2.4Caspase-3和Caspase-9的活性檢測 通過Western blot檢測Caspase-3底物PRAP和Caspase-9裂解情況。對照組中未檢測到PRAP和Caspase-9裂解；人參皂苷20(S)-Rh2處理組中未檢測到PRAP裂解，但可以檢測到Caspase-9有少量斷裂條帶；BMAP28肽處理組PRAP和Caspase-9均檢測到少量裂解；聯(lián)合用藥組PRAP和Caspase-9均檢測到裂解?；叶确治鼋Y(jié)果表明：聯(lián)合用藥組PRAP和Caspase-9裂解量均高于單獨(dú)用藥組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明聯(lián)合用藥組可以更有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖4、表2)。

圖4 A549細(xì)胞凋亡中PRAP、Caspase-9斷裂情況Fig.4 PRAP and Caspase-9 cleavage expression in apoptosis of A549 cells

表2 PARP和Caspase-9斷裂條帶分析結(jié)果

Tab.2 Analysis results of cleavage bands of PARP and Caspase-9

Grayintensity ratioControl20(S)-Rh2BMAP2820(S)-Rh2+BMAP28PRAP cleavage band(85 kD)/α-tubulin--0.06±0.021)0.45±0.08Caspase-9 cleavageband(37 kD)/α-tubulin-0.07±0.031)0.13±0.051)0.51±0.04

Note：“-”.No cleavage bands detected;1)P<0.05 vs combined group.

2.5A549細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞色素C和Bax水平變化的檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人參皂苷20(S)-Rh2和BMAP28肽單獨(dú)作用于A549細(xì)胞時(shí)，均不能引起細(xì)胞色素C顯著釋放，而聯(lián)合用藥組中Cytochrome C較對照組明顯升高，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Bax蛋白的轉(zhuǎn)位研究表明各加藥組Bax蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體的量較對照組有顯著性差異(P<0.05)，但聯(lián)合用藥組Bax蛋白轉(zhuǎn)位量要高于單獨(dú)用藥組(P<0.05)。這表明人參皂苷20(S)-Rh2和BMAP28肽能夠增強(qiáng)Bax 蛋白從胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體膜，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞線粒體膜的去極化，促進(jìn)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放。見圖5、表3。

圖5 A549細(xì)胞凋亡中細(xì)胞色素 C和Bax蛋白表達(dá)Fig.5 Cytochrome C and Bax protein expression in apoptosis of A549 cells

表3 20(S)-Rh2與BMAP28肽聯(lián)合作用的細(xì)胞色素C和Bax蛋白表達(dá)結(jié)果

Tab.3 Cytochrome C and Bax protein expression in combination of BMAP28 peptide and 20(S)-Rh2

Grayintensity ratioControl20(S)-Rh2BMAP2820(S)-Rh2+BMAP28Cytochrome C/α-tubulin0.87±0.130.93±0.080.86±0.121.34±0.091)Bax/α-tubulin0.09±0.021.05±0.101)2)0.52±0.231)2)2.33±0.421)

Note：1)P<0.05 vs control group；2)P<0.05 vs combined group.

3 討論

肺癌的治療包括手術(shù)、化療、放療、免疫或細(xì)胞因子療法等?；瘜W(xué)藥物治療是臨床肺癌治療的主要方法之一。但隨著化療藥物用藥劑量的增加，發(fā)生毒副作用的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。通過將傳統(tǒng)化療藥物與單抗、多肽等進(jìn)行聯(lián)用，可以降低用藥風(fēng)險(xiǎn)和用藥劑量[13]。

線粒體途徑在人參皂苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[14]，當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí)，Cytochrome C從線粒體釋放到胞漿，然后通過形成Cytochrome C/Apaf-1/Caspase-9的Apoptosome復(fù)合物觸發(fā)Caspase-3的激活，引起Caspase家族其他激酶的激活[15]。人參皂苷20(S)-Rh2與線粒體介導(dǎo)的信號通路有著密切的關(guān)系，可以使p21WAFI/CHIPI、p27kipI、p15Ink4B表達(dá)上調(diào)，同時(shí)使Cdk2、cyclinD 1等周期素及周期素依賴性激酶的表達(dá)下調(diào)[16]。在NF-κB和Fas/FasL系統(tǒng)途徑中，20(S)-Rh2對不同腫瘤細(xì)胞的凋亡作用已經(jīng)得到共識(shí)[17,18]。BMAP28肽可以使腫瘤細(xì)胞線粒體出現(xiàn)腫脹、空泡化和嵴脫落、核膜界限不清，另外還可以促使腫瘤細(xì)胞核膜破損[19]。

研究表明人參皂苷20(S)-Rh2對白血病、肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤均具有抑制作用[20,21]，并且與樺木酸、柔紅霉素等聯(lián)用時(shí)能逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性[22]。但人參皂苷20(S)-Rh2與多肽的聯(lián)合應(yīng)用報(bào)道較少。在本論文中，通過測定20(S)-Rh2組、BMAP28肽組和聯(lián)合用藥組的IC50，結(jié)果表明BMAP28肽可以提高人參皂苷對A549細(xì)胞的殺傷效果，通過測定協(xié)同指數(shù)CI，表明這種殺傷作用的提高來自于兩者的協(xié)同作用。通過A549細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的變化及流式細(xì)胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組的凋亡率有明顯升高，這表明協(xié)同作用是通過誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。

通過進(jìn)一步對A549細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，表明20(S)-Rh2和BMAP28肽的協(xié)同誘導(dǎo)凋亡是通過線粒體凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。通過對Caspase-3和Caspase-9活性檢測，表明聯(lián)合用藥可以顯著激活Caspase級聯(lián)信號通路，從而誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。通過測定線粒體信號通路中細(xì)胞色素C和Bax蛋白表達(dá)量，表明聯(lián)合用藥能夠通過協(xié)同作用，促進(jìn)Bax蛋白從A549細(xì)胞胞漿轉(zhuǎn)位到線粒體，從而導(dǎo)致線粒體膜去極化，促進(jìn)細(xì)胞色素C由線粒體釋放到胞漿中，從而最終誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

總之，本研究結(jié)果表明20(S)-Rh2和BMAP28肽聯(lián)合用藥可以更有效殺傷A549細(xì)胞。通過測定協(xié)同指數(shù)CI，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥可以產(chǎn)生協(xié)同作用，通過形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)檢測，證明聯(lián)合用藥可以更好促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。Western blot檢測表明20(S)-Rh2與BMAP28肽通過線粒體途徑協(xié)同誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。該研究為20(S)-Rh2與BMAP28肽聯(lián)合應(yīng)用治療肺癌提供了理論依據(jù)，為后續(xù)臨床治療研究初步奠定了理論基礎(chǔ)。