崔 崎 韓 玲 郭小鵬

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院泌尿科，烏魯木齊 830000)

前列腺癌是西方國家發(fā)病率和死亡率較高的男性惡性腫瘤，近些年來，隨著工作壓力的增加，前列腺癌的發(fā)病率逐年升高[1]。目前臨床上前列腺癌主要的治療方式是外科手術(shù)，但對(duì)于轉(zhuǎn)移性前列腺癌主要方法是保守治療，預(yù)后較差，因此需要尋找一些轉(zhuǎn)移分子標(biāo)志物，改善預(yù)后[2]。MircoRNA可通過多種方式調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，發(fā)揮致癌基因或抑癌基因的作用。MircoRNA-206(miR-206)是MircoRNA家族成員之一，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力[3，4]。目前關(guān)于miR-206在前列腺癌中的作用報(bào)道較少，因此本研究主要探討miR-206在前列腺癌中的表達(dá)水平及其對(duì)增殖與侵襲的影響，并初步研究其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 PC-3細(xì)胞和RWPE-1細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑和儀器 Trizol試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Gibco胎牛血清購自上海素爾生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；DMSO、蛋白雙染marker、顯影液、5%脫脂奶粉、NFAT5、PCNA、Vimentin、E-cadherin、GADPH單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG二抗購自上海生工公司；雙熒光素酶檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)試劑盒購自Promega公司；TransScript Ⅱ All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removal)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2× SYBR Green qPCR Master Mix購自北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司；日本同仁CCK8試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Transwell小室購自上海子起生物科技有限公司；前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3購自上海奧陸生物科技有限公司；胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)含酚紅購自金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 Transfection Reagent購自上海廣銳生物科技有限公司；miR-206模擬物(mimics)及無關(guān)序列對(duì)照購自上海吉瑪公司；pultton超微量分光光度計(jì)購自北京五洲東方科技發(fā)展有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自云南臨康生物科技有限公司；Thermofisher梯度PCR儀購自上海恒斐生物科技有限公司；德國CO2培養(yǎng)箱WCI-180購自蘇州貝銳儀器科技有限公司；Thermo-80℃低溫冰箱購自北京乾明基因技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 使用10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)PC-3細(xì)胞和RWPE-1細(xì)胞，放置于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2RT-qPCR檢測(cè)組織與細(xì)胞中miR-206和NFAT5的表達(dá) 使用液氮研磨前列腺癌患者和前列增生患者的前列腺組織，加入適量Trizol試劑提取組織總RNA。使用pultton 超微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的純度和濃度。依據(jù)TransScript Ⅱ All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removal)試劑盒說明書將組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄為總cDNA。依據(jù)2×SYBR Green qPCR Master Mix試劑說明書進(jìn)行熒光反應(yīng)。反應(yīng)條件：94℃ 2 min；95℃ 10 s；58℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以U6為參照，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞后，采用胰酶消化液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化后提取RNA，步驟同上。

1.2.3熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-206和NFAT5的結(jié)合 將pmir-GLO熒光素酶載體分別插入NFAT5的野生型3′-UTR和突變型(不能再與miR-206結(jié)合)3′-UTR，構(gòu)建成重組NFAT5野生型3′-UTR質(zhì)粒和NFAT5突變型3′-UTR質(zhì)粒。在6孔板中培養(yǎng)PC-3后，將以下四種組合miR-206模擬物和NFAT5野生型3′-UTR質(zhì)粒、miR-206模擬物 (miR-206 mimics)和NFAT5突變型3′-UTR質(zhì)粒、miR-206對(duì)照 (miR206-NC)和NFAT5野生型3′-UTR質(zhì)粒、miR-206對(duì)照和NFAT5突變型3′-UTR質(zhì)粒通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)36 h后根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定熒光素酶活性 。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞，使用RPMI1640完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為3×106個(gè)/ml，接種200 μl細(xì)胞培養(yǎng)液至康寧六孔板中，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。使用LipofectamineTM2000 Transfection Reagent分別轉(zhuǎn)染miR-206模擬物和miR-206對(duì)照于細(xì)胞中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞miR-206的表達(dá) 具體方法參照1.2.2。

1.2.6CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖 吸去轉(zhuǎn)染48 h后的PC-3細(xì)胞上清液，細(xì)胞消化后離心棄上清液，使用RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/ml，接種200 μl細(xì)胞培養(yǎng)液至康寧96孔板中，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄掉細(xì)胞上清液，使用磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞，每孔加入配置好的CCK8 混合液(10 μl CCK8試劑和90 μl RPMI1640完全培養(yǎng)基)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450。

1.2.7Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲 將轉(zhuǎn)染48 h的PC-3細(xì)胞消化后，用無血清RPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整至4×105個(gè)/ml，取100 μl轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞液接種于Transwell上室，下室加入600 μl含20%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，并在Transwell上室與下室間的聚碳酸酯膜上鋪一層基質(zhì)膠。然后放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出Transwell培養(yǎng)板，吸去小室上層中的液體并擦拭，倒扣小室，室溫放置8 min。采用4%甲醛固定15 min 并使用1%結(jié)晶紫進(jìn)行染色，染色時(shí)間為5～10 min。最后置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8NFAT5、PCNA、E-cadherin和Vimentin蛋白水平的測(cè)定 將轉(zhuǎn)染48 h的PC-3細(xì)胞消化后，加入RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白并測(cè)定蛋白濃度。調(diào)整蛋白濃度后進(jìn)行電泳過程，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜中。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜采用5%脫脂牛奶-TBST進(jìn)行封閉，洗滌后分別與β-actin、NFAT5、PCNA、E-cadherin和Vimentin單克隆抗體孵育4℃ 12 h，洗滌后使用HRP標(biāo)記的山羊抗人lgG二抗室溫孵育2 h，洗滌后進(jìn)行ECL發(fā)光鑒定，掃描條帶后，使用ImageJ軟件分析條帶。

1.2.9NFAT5、PCNA、E-cadherin和Vimentin mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 具體步驟參照1.2.2。引物見表1。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞和組織中miR-206和NFAT5的表達(dá)水平比較 前列腺癌組織miR-206表達(dá)水平顯著低于前列腺增生組織(圖1A)，而前列腺癌組織NFAT5表達(dá)水平顯著高于前列腺增生組織(圖1B)，并且兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.934，P<0.000 1)，見圖1C。

圖1 細(xì)胞和組織中miR206和NFAT5的表達(dá)水平比較Fig.1 Comparison of expression levels of miR-206 and NFAT5 in cells and tissuesNote:A.The relative expression of miR-206;B.The relative expression of NFAT5;C.The relationship between the expressions of NFAT5 and miR-206.Compared with miR-206-NC,***.P<0.000 1.

2.2NFAT5是miR-206的靶向基因 生物信息學(xué)網(wǎng)站(http://starbase.sysu.edu.cn/agoClipRNA.php?source=mRNA)預(yù)測(cè)NFAT5與miR-206的結(jié)合位點(diǎn)，序列見圖2A。結(jié)果顯示，NFAT5野生型3′-UTR組中，與miR-206對(duì)照的PC-3細(xì)胞相比，miR-206模擬物組熒光素酶的活力值明顯降低(t=7.842，P=0.001 4)。但在NFAT5突變型3′-UTR組中，熒光素酶的活性無明顯變化(圖2B)，證明miR-206靶向調(diào)控NFAT5的3′-UTR，降低了熒光素酶的表達(dá)。

表1 RT-qPCR引物

Tab.1 Primer of RT-qPCR

Primer nameSequence(5′ to 3′)miR-206p FTGCTTCCCGAGGCCACATGCmiR-206 RGTGTGTGGTTTCGGCAAGTGU6 FGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATU6 RCGCTTCACGAATTTGCGTGTCATNFAT5 FCTGCTGGGATCCCTGAGATGTTCNFAT5 RGGTTTTCCAATGTTCCCCACGPCNA FAGCAGAGTGGTCGTTGTCTTTPCNA RTAGGTGTCGAAGCCCTCAGAE-cadherin FCATTTCTTGGTCTACGCCTGE-cadherin RGAGAGGAGTTGGGAAATGTGVimentin RGAGCAGCAGAATAAGATCCTGVimentin FCTTTGTCGTTGGTTAGCTGG

圖2 NFAT5是miR-206的靶向基因Fig.2 NFAT5 is a targeted gene of miR-206Note:A.Binding sites and sequences of NFAT5 to miR-206;B.Relative activity of luciferase.Compared with miR-206-NC,*.P<0.05.

2.3細(xì)胞增殖速率的比較 與miR206-NC比較，細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-206-mimics后，miR-206的表達(dá)水平顯著升高，轉(zhuǎn)染miR-206-mimics48和72 h后，PC-3細(xì)胞的增殖速率顯著降低(P<0.05)，見圖3。

圖3 細(xì)胞增殖速率的比較Fig.3 Comparison of cell proliferation rateNote:A.Relative expression of miR206;B.miR206 expression (OD) curve with time.Compared with miR-206-NC,*.P<0.05.

2.4細(xì)胞侵襲能力的比較 轉(zhuǎn)染miR-206-mimics后，與miR206-NC組比較，侵襲性PC-3細(xì)胞的數(shù)量明顯降低(P<0.05)，見圖4。

圖4 細(xì)胞侵襲能力的比較Fig.4 Comparison of cell invasion abilityNote:A.Cell invasion map;B.Comparison of the number of cell invasion.Compared with miR-206-NC,*.P<0.05.

2.5NFAT5、PCNA、E-cadherin和Vimentin蛋白水平比較 與miR-206-NC組比較，miR-206-mimics組E-cadherin蛋白水平顯著升高，NFAT5、PCNA和Vimentin蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖5。

圖5 NFAT5、PCNA、E-cadherin和Vimentin蛋白水平Fig.5 NFAT5,PCNA,E-cadherin and Vimentin protein levels

2.6NFAT5、PCNA、E-cadherin和Vimentin mRNA水平比較 與miR-206-NC組比較，miR-206-mimics組E-cadherin mRNA水平顯著升高，NFAT5、PCNA和Vimentin mRNA水平顯著降低(P<0.05)，見圖6。

圖6 NFAT5、PCNA、E-cadherin和Vimentin mRNA水平比較Fig.6 Comparison of NFAT5,PCNA,E-cadherin and Vimentin protein levelsNote:Compared with miR-206-NC,*.P<0.05.

3 討論

前列腺癌是發(fā)生于前列腺上皮的惡性腫瘤，主要包括腺癌、腺鱗癌及導(dǎo)管腺癌等，發(fā)病高峰年齡為55～70歲。由于前列腺癌生長速度緩慢，早期癥狀輕微，容易誤診、漏診和耽誤治療，導(dǎo)致五年生存率較低。前列腺癌的發(fā)生發(fā)展與mircoRNA密切相關(guān)。在前列腺癌中，mircoRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。研究報(bào)道，miR-221和miR-222促進(jìn)PC-3細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的作用；miR-101抑制LNCap細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并下調(diào)EZH2的表達(dá)[5,6]。目前，已有學(xué)者研究表明，miR-206可通過干擾CDK4和GAK的表達(dá)顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的生長，也有學(xué)者研究表明，miR-206通過靶向Annexin A2調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[7,8]。由此可知，miR-206可以靶向結(jié)合調(diào)控多個(gè)mRNAs，通過不同途徑參與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。本文結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-206后，前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖與侵襲能力顯著降低。

應(yīng)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(http://starbase.sysu.edu.cn/agoClipRNA.php?source=mRNA)預(yù)測(cè)，NFAT5存在miR-206的潛在的結(jié)合位點(diǎn)。本研究通過雙熒光素酶證實(shí)了miR-206和NFAT5的靶向關(guān)系。NFAT5，屬于NF-κB/Rel家族，是一種滲透壓轉(zhuǎn)錄因子，參與維持腎臟內(nèi)髓部細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡。目前研究表明，NFAT5在多種腫瘤中異常表達(dá)，參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展[9]。并且很多研究都證實(shí)了NFAT5在腫瘤的促血管新生因子及血管新生的表達(dá)中發(fā)揮重要作用[10]。本文經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)NFAT5在前列腺癌中異常高表達(dá)，并與miR-206呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。再次驗(yàn)證了miR-206和NFAT5存在的靶向關(guān)系。

EMT被認(rèn)為是前列腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的主要原因。上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)被激活后，細(xì)胞侵襲、遷移能力明顯增強(qiáng)，在體外則主要表現(xiàn)為Transwell透膜能力提高。有文獻(xiàn)報(bào)道，EMT是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，N-cadherin、vimentin的表達(dá)水平增加，E-cadherin的低表達(dá)均可誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[11]。E-cadherin是一類重要的細(xì)胞表面黏附分子，其主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞黏附與遷移。近年來的研究表明，E-cadherin在肺癌等多種腫瘤中異常表達(dá)，對(duì)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用[12]。李俊堂等[13]發(fā)現(xiàn)NFAT5能夠結(jié)合在腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)分子S100A4的啟動(dòng)子區(qū)上，上調(diào)S100A4表達(dá)及活性。S100A4是Ca2+結(jié)合蛋白家族的成員之一，常被作為間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，文獻(xiàn)報(bào)道在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中過表達(dá)S100A4可以抑制E-cadherin和促進(jìn)vimentin的表達(dá)[14]。PCNA與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，主要表達(dá)于G1期至S期的增殖細(xì)胞。越來越多的研究證實(shí)，其表達(dá)量是反應(yīng)細(xì)胞增殖狀態(tài)的理想評(píng)價(jià)指標(biāo)。沈薇等[15]研究表明，通過siRNA下調(diào)S100A4基因的表達(dá)能夠抑制U251細(xì)胞的增殖。因此本文檢測(cè)NFAT5、PCNA、E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平，考察miR-206抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖與侵襲作用機(jī)制。結(jié)果顯示，與miR-206-NC組比較，miR-206-mimics組E-cadherin 蛋白和mRNA水平顯著升高，NFAT5、PCNA、Vimentin蛋白和mRNA水平顯著降低，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。

綜上所述，miR-206還有可能會(huì)通過調(diào)控NFAT5抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖與侵襲的作用。本實(shí)驗(yàn)的不足之處僅在細(xì)胞水平中研究miR-206的作用，后續(xù)將通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討miR-206在體內(nèi)的作用。