汪魯青，姜花，鄭生

急性心肌梗死等多種心血管疾病患病率逐年升高，目前臨床常采用溶栓及經(jīng)皮冠狀動脈介入等方法進行治療，目的是促使缺血的心肌恢復血液供應，一旦缺血的心肌恢復正?？稍斐删植啃募∪毖M織損傷而引發(fā)心肌缺血再灌注損傷[1]。因而如何解決缺血再灌注損傷引發(fā)的心肌細胞損傷成為目前研究的重點問題。研究表明微小RNA（miRNA）在心肌缺血再灌注損傷過程中異常表達并可能參與心肌缺血、心力衰竭、心臟發(fā)育等多種生理病理過程[2]。研究表明高糖引起腎小球內皮細胞微小RNA-124（miR-124）表達下降，過表達miR-124可減輕高糖所致的腎小球內皮細胞損傷[3]。微小RNA-124-3p（miR-124-3p）可保護神經(jīng)細胞[4]。但關于miR-124-3p在心肌缺血再灌注損傷過程中的作用機制尚未見相關報道。缺氧/復氧（H/R）處理可上調心肌細胞中受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）的表達，抑制RIPK1表達可保護H/R誘導的心肌細胞損傷[5]。研究表明RIPK1在肝損傷中呈高表達[6,7]。靶基因預測結果顯示RIPK1可能是miR-124-3p的靶基因，但關于miR-124-3p是否調控RIPK1表達進而參與心肌缺血再灌注損傷過程尚未可知。因此，本研究構建H/R模型，觀察miR-124-3p與RIPK1在H/R誘導的心肌細胞中的表達變化，并探究其表達對心肌細胞損傷的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑大鼠心肌細胞H9C2購自上海雅吉生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基購自北京索萊寶生物科技有限公司；miR-124-3p mimics、miR-124-3p抑制劑（anti-miR-124-3p）、si-RIPK1及其各自陰性對照均購自廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；胎牛血清、青霉素及鏈霉素均購自上海遠慕生物科技有限公司；Trizol試劑、RNA反轉錄試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；RIPA蛋白裂解液與BCA蛋白定量試劑盒均購自北京康為世紀生物科技有限公司；兔抗鼠B淋巴細胞瘤-2 （Bcl-2）、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白（Bax）、RIPK1抗體均購自美國CST公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒均購自南京建成有限公司；膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）細胞凋亡試劑盒購自南京凱基有限公司。

1.2 方法

1.2.1 缺氧/復氧（H/R）模型建立將不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基放入37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，加入95%體積分數(shù)的氮氣，持續(xù)通入上述氣體3 h，更換DMEM高糖培養(yǎng)基，放入低氧裝置內繼續(xù)培養(yǎng)3 h（缺氧），隨后將培養(yǎng)基更換為含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，放入37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h（復氧）[8]。同時將未進行任何處理的心肌細胞作為Con組。

1.2.2 實驗分組取對數(shù)生長期心肌細胞，參照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書向心肌細胞分別轉染miR-124-3p mimics、si-RIPK1及其各自陰性對照，隨后按照H/R處理方法進行處理，分別為H/R+miR-124-3p組、H/R+miR-NC組、H/R+si-RIPK1組、H/R+siNC組。同時將miR-124-3p mimics與pcDNA-RIPK1、miR-124-3p mimics與pcDNA分別共轉染入心肌細胞，同上述處理方法進行處理，分別為H/R+miR-124-3p+pcDNARIPK1組、H/R+miR-124-3p+pcDNA組。轉染6 h后將培養(yǎng)液更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)研究。

1.2.3 qRT-PCR檢測細胞中miR-124-3p、RIPK1 mRNA表達水平分別收集各組心肌細胞，采用Trizol法提取心肌細胞總RNA，參照反轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進行qRTPCR反應，反應體系共20 μl：cDNA模板2 μl，正反向引物各0.6 μl，SYBR Green Master Mix 10 μl，ddH2O 6.8 μl。反應條件：95℃ 5 min（循環(huán)1次），95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s（循環(huán)40次）。觀察熒光曲線及Ct值，采用2-ΔΔCt法計算miR-124-3p、RIPK1 mRNA的相對表達量。

1.2.4 熒光素酶報告基因檢測靶基因預測庫預測miR-124-3p與RIPK1的3’UTR存在結合位點，將含有miR-124-3p結合位點及其突變位點的RIPK1的3’UTR片段插入PGL3熒光素酶報告基因載體，分別構建野生型（WT-RIPK1）與突變型（MUT-RIPK1）的RIPK1 3’UTR熒光素酶報告載體，將WT-RIPK1、MUT-RIPK1分別與miR-124-3p mimics、miR-NC共轉染，培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48 h，收集細胞，根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測各組心肌細胞的熒光素酶活性。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡收集各組對數(shù)生長期心肌細胞，采用0.25%胰蛋白酶消化細胞，收集心肌細胞計數(shù)，低溫下經(jīng)1000 r/min轉速離心5 min（離心半徑10 cm），棄上清，加入Annexin Binding buffer重懸細胞，調整細胞密度（1×106個/ml），吸取1 ml細胞懸液加入5 μl Annexin V-FITC，充分混勻后加入5 μl PI，充分混勻，室溫避孵育20 min，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 蛋白免疫印跡檢測RIPK1、Bcl-2、Bax蛋白表達取各組心肌細胞，加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白，根據(jù)BCA試劑盒定量蛋白，取30 μg蛋白上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳反應，蛋白轉移至PVDF膜，室溫封閉1 h，孵育一抗（1:1000），4℃孵育24 h，TBST洗膜，孵育二抗（1:3000），室溫孵育2 h，ECL顯影，放入凝膠成像系統(tǒng)并應用Quantityone軟件檢測條帶灰度值。

1.2.7 檢測細胞LDH、MDA、SOD含量收集各組心肌細胞，應用超聲破碎細胞，參照LDH、MDA、SOD試劑盒說明書檢測MDA、SOD的水平及LDH活性，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學處理利用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間差異采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-124-3p和RIPK1在缺氧/復氧處理對心肌細胞中的表達與Con組相比，H/R組心肌細胞中miR-124-3p的表達水平顯著降低（P＜0.05），而RIPK1 mRNA及蛋白水平均顯著升高（P＜0.05）（圖1，表1）。

圖1 RIPK1蛋白表達

表1 miR-124-3p和RIPK1在缺氧/復氧處理對心肌細胞中的表達（±s，n=9 ）

表1 miR-124-3p和RIPK1在缺氧/復氧處理對心肌細胞中的表達（±s，n=9 ）

分組 Con H/R P值miR-124-3p 1.02±0.09 0.39±0.04 ＜0.001 RIPK1 mRNA 1.00±0.08 2.86±0.27 ＜0.001 RIPK1蛋白 0.49±0.04 0.91±0.08 ＜0.001

2.2 miR-124-3p靶向調控RIPK1的表達靶基因預測顯示RIPK1的3’UTR存在miR-124-3p的結合位點（圖2A）。雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果顯示，與共轉染miR-NC、WT-RIPK1的心肌細胞相比，共轉染miR-124-3p mimics與WT-RIPK1的心肌細胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；與共轉染miR-NC、MUT-RIPK1的心肌細胞相比，共轉染miR-124-3p mimics與MUT-RIPK1的心肌細胞熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05）（表2）。表明miR-124-3p可靶向結合RIPK1，并可調控其活性表達。Western blot實驗結果顯示，相較于miR-NC組，miR-124-3p組心肌細胞中RIPK1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-124-3p組心肌細胞中RIPK1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）（圖2B、表3）。

圖2 miR-124-3p靶向調控RIPK1的表達

表2 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9 ）

表2 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9 ）

分組 miR-NC miR-124-3p P值WT-RIPK1 1.04±0.08 0.41±0.03 ＜0.001 MUT-RIPK1 1.03±0.07 1.01±0.09 0.606

表3 miR-124-3p調控RIPK1蛋白的表達（±s，n=9 ）

表3 miR-124-3p調控RIPK1蛋白的表達（±s，n=9 ）

注：與miR-NC組比較，aP＜0.05；與anti-miR-NC組比較，bP＜0.05

分組 miR-NC miR-124-3p anti-miR-NC anti-miR-124-3p P值RIPK1蛋白0.48±0.05 0.19±0.02a 0.48±0.05 0.89±0.08b ＜0.001

圖3 miR-124-3p過表達對缺氧/復氧心肌細胞凋亡的影響

2.3 miR-124-3p過表達對缺氧/復氧心肌細胞損傷的影響流式細胞術檢測結果顯示，H/R組心肌細胞凋亡率較Con組顯著增加（P＜0.05），而H/R+miR-124-3p組心肌細胞凋亡率較H/R+miRNC組顯著降低（P＜0.05）（圖3B、表4）。與Con組相比，H/R組心肌細胞LDH活性明顯增強（P＜0.05），MDA水平明顯升高（P＜0.05），而SOD水平明顯降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平明顯降低（P＜0.05），而Bax蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；與H/R+miR-NC組相比，H/R+miR-124-3p組心肌細胞LDH活性明顯降低（P＜0.05），MDA水平明顯降低（P＜0.05），而SOD水平明顯升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平明顯升高（P＜0.05），而Bax蛋白水平明顯降低（P＜0.05）（圖3A、表4）。表明miR-124-3p過表達了明顯抑制心肌細胞凋亡并減緩心肌細胞氧化應激反應。

2.4 抑制RIPK1對缺氧/復氧心肌細胞損傷的影響Western blot實驗結果顯示，H/R+si-RIPK1組心肌細胞中RIPK1蛋白水平與H/R+siNC組相比顯著降低（P＜0.05），提示成功抑制H/R誘導的心肌細胞中RIPK1的表達。與H/R+siNC組相比，H/R+si-RIPK1組心肌細胞LDH活性明顯降低（P＜0.05），MDA水平與細胞凋亡率均明顯降低（P＜0.05），而SOD水平明顯升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平明顯升高（P＜0.05），而Bax蛋白水平明顯降低（P＜0.05）（圖4、表5）。

2.5 RIPK1過表達逆轉了miR-124-3p過表達對缺氧/復氧心肌細胞損傷的作用相較于H/R+miR-124-3p+pcDNA組，H/R+miR-124-3p+pcDNARIPK1組心肌細胞LDH活性、MDA水平、細胞凋亡率及Bax蛋白水平均明顯升高（P＜0.05），而SOD水平及Bcl-2蛋白水平均顯著降低（P＜0.05）（圖5、表6）。

表4 miR-124-3p過表達對缺氧/復氧心肌細胞損傷的影響（±s，n=9 ）

表4 miR-124-3p過表達對缺氧/復氧心肌細胞損傷的影響（±s，n=9 ）

注：與Con組比較，aP＜0.05；與H/R+miR-NC組比較，bP＜0.05

分組 Con H/R H/R+miR-NC H/R+miR-124-3p P值miR-124-3p 1.02±0.09 0.36±0.03a 0.34±0.04 0.81±0.08b ＜0.001 LDH（U/L） 12.48±1.35 63.25±6.28a 66.87±6.94 21.58±2.67b ＜0.001 MDA（nmol/mg prot） 3.54±0.34 21.65±2.04a 23.68±2.13 8.69±0.87b ＜0.001 SOD（U/mg prot） 19.65±1.89 6.32±0.61a 6.23±0.57 16.35±1.59b ＜0.001 Bcl-2蛋白 0.74±0.07 0.35±0.03a 0.33±0.03 0.62±0.06b ＜0.001 Bax蛋白 0.28±0.03 0.61±0.06a 0.63±0.06 0.39±0.04b ＜0.001凋亡率（%） 7.32±0.72 23.65±2.37a 25.74±2.48 11.72±1.36b ＜0.001

圖4 RIPK1和凋亡相關蛋白表達

圖5 RIPK1和凋亡相關蛋白表達

表5 抑制RIPK1對缺氧/復氧心肌細胞損傷的影響（±s，n=9）

表5 抑制RIPK1對缺氧/復氧心肌細胞損傷的影響（±s，n=9）

注：與Con組比較，aP＜0.05；與H/R+siNC組比較，bP＜0.05

分組 Con H/R H/R+si-NC H/R+si-RIPK1 P值RIPK1蛋白 0.43±0.04 0.88±0.08a 0.92±0.08 0.51±0.05b ＜0.001 LDH（U/L） 13.65±1.27 65.47±6.29a 67.21±6.38 27.65±2.57b ＜0.001 MDA（nmol/mg prot） 4.03±0.39 23.65±2.24a 25.17±2.52 10.65±1.03b ＜0.001 SOD（U/mg prot） 21.36±2.11 6.98±0.68a 6.81±0.62 14.28±1.13b ＜0.001 Bcl-2蛋白 0.75±0.07 0.32±0.03a 0.29±0.03 0.57±0.05b ＜0.001 Bax蛋白 0.25±0.03 0.64±0.06a 0.65±0.06 0.42±0.04b ＜0.001凋亡率（%） 6.27±0.59 22.36±2.38a 23.14±2.09 14.58±1.43b ＜0.001

表6 RIPK1過表達逆轉了miR-124-3p過表達對缺氧/復氧心肌細胞損傷的作用（±s，n=9）

表6 RIPK1過表達逆轉了miR-124-3p過表達對缺氧/復氧心肌細胞損傷的作用（±s，n=9）

注：與H/R+miR-NC組比較，aP＜0.05；與H/R+miR-124-3p+pcDNA組比較，bP＜0.05

分組 H/R+miR-NC H/R+miR-124-3p H/R+miR-124-3p+pcDNA H/R+miR-124-3p+pcDNA-RIPK1 P值RIPK1蛋白 0.89±0.08 0.34±0.03a 0.32±0.04 0.78±0.07b 0.000 LDH（U/L） 65.28±6.47 20.36±2.18a 19.57±2.09 48.25±4.39b 0.000 MDA（nmol/mg prot） 22.69±2.14 8.36±0.84a 8.12±0.79 17.25±1.57b 0.000 SOD（U/mg prot） 6.34±0.64 17.26±1.58a 18.28±1.67 12.54±1.38b 0.000 Bcl-2蛋白 0.30±0.03 0.67±0.06a 0.69±0.05 0.41±0.04b 0.000 Bax蛋白 0.61±0.06 0.33±0.03a 0.32±0.03 0.49±0.04b 0.000凋亡率（%） 24.18±2.09 12.46±1.25a 11.29±1.18 18.67±1.69b 0.000

3 討論

心肌缺血再灌注損傷可引發(fā)心律失常、心肌梗死等多種疾病，且嚴重降低患者生活質量[9]。因而積極探尋有效防治心肌缺血再灌注損傷的治療措施對降低心血管疾病死亡率具有重要現(xiàn)實意義。miRNA表達上調或下調可影響心血管疾病發(fā)生及發(fā)展過程，通過抑制或促進部分miRNA表達可有效調控心血管疾病發(fā)展進程[10]。因此積極尋找miRNA與心血管疾病發(fā)生及發(fā)展的關系，可為心血管疾病治療提供潛在靶點。

miR-124在動物神經(jīng)系統(tǒng)內特異性表達，其表達異常與神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生及發(fā)展密切相關[11]。研究表明miR-124-3p過表達可通過靶向FIP200表達進而保護神經(jīng)元細胞[12]。miR-124-3p通過調節(jié)ANAX5表達可在6-羥基多巴胺誘導的帕金森病細胞模型中發(fā)揮神經(jīng)保護作用[13]。研究報道指出miR-124-3p上調表達可逆轉缺氧期間細胞依賴的凋亡途徑[14]。本研究結果顯示H/R處理的心肌細胞中miR-124-3p的表達水平降低，細胞中LDH活性與MDA水平均明顯升高，而SOD水平明顯降低，通過上調miR-124-3p表達，結果發(fā)現(xiàn)心肌細胞中LDH活性明顯降低，MDA水平明顯降低，而SOD水平顯著升高，說明miR-124-3p過表達可逆轉H/R對心肌細胞氧化損傷的作用。已有研究表明心肌細胞缺氧可導致心肌細胞膜受損，心肌細胞復氧可造成細胞氧化損傷而促使細胞膜通透性增加，LDH是心肌細胞標志酶，SOD屬于抗氧化酶類，其可通過清除超氧陰離子而保護機體免受氧化損傷，MDA屬于氧化酶類，其主要是氧自由基攻擊細胞膜不飽和脂肪酸的產物，其水平高低與細胞氧化損傷程度呈正相關[15]。提示H/R可導致心肌細胞脂質過氧化反應增強進而加重細胞損傷，miR-124-3p過表達可增強心肌細胞清除氧自由基能力并減輕細胞膜脂質過氧化反應進而在H/R發(fā)生過程中發(fā)揮保護作用。同時本研究發(fā)現(xiàn)H/R處理后心肌細胞凋亡率顯著增加，而上調miR-124-3p表達后心肌細胞凋亡率顯著下降，Bcl-2蛋白水平顯著升高，而Bax蛋白水平顯著降低，說明H/R可誘導心肌細胞凋亡，miR-124-3p過表達可抑制心肌細胞凋亡。研究報道指出Bcl-2表達水平升高可抑制心肌細胞凋亡，而Bax表達水平升高可促進心肌細胞凋亡[16]。提示miR-124-3p過表達可通過調控細胞凋亡相關蛋白表達進而抑制H/R所致的心肌細胞凋亡。

細胞程序性壞死與RIPK1、RIPK3表達異常有關，研究表明程序性壞死可參與心肌缺血等多種疾病發(fā)生及發(fā)展過程，通過抑制RIPK1表達可明顯減緩大鼠心肌缺血再灌注損傷[17,18]。心肌缺血再灌注損傷發(fā)生過程中心肌細胞中RIPK1的表達水平明顯升高，并可激活程序性壞死途徑導致心肌梗死、心力衰竭等多種心血管疾病發(fā)生及發(fā)展過程。與上述研究結果相似，本研究結果顯示H/R誘導的心肌細胞中RIPK1的表達水平顯著升高，通過抑制RIPK1表達發(fā)現(xiàn)心肌細胞凋亡率、LDH活性、MDA水平及Bax蛋白水平均顯著降低，而SOD水平及Bcl-2蛋白水平均顯著升高，提示抑制RIPK1表達可有效緩解H/R誘導的心肌細胞氧化損傷，并抑制心肌細胞凋亡。本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗證實RIPK1是miR-124-3p的靶基因，進一步研究顯示RIPK1過表達可明顯逆轉miR-124-3p過表達對心肌細胞的保護作用。說明miR-124-3p過表達可通過下調RIPK1表達進而對心肌細胞H/R損傷產生保護作用。提示miR-124-3p可能為心肌缺血再灌注損傷治療的新靶點。

綜上所述，miR-124-3p可通過抑制下游靶基因RIPK1表達而增強細胞氧自由基清除能力進而減輕心肌細胞H/R損傷，并可發(fā)揮抗凋亡作用進而保護心肌細胞，為臨床治療提供潛在靶點。但本研究實驗結果仍需進行體內研究進而為miR-124-3p在心血管疾病治療過程中的應用奠定理論基礎。