馬玉青, 徐玉喬, 王圓圓

(1.青海省人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 青海 西寧 810000； 2.空軍軍醫(yī)大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 病理科, 陜西 西安 710000; 3.空軍軍醫(yī)大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 陜西 西安 710000)

肢帶型肌營養(yǎng)不良2B型(limb-girdle muscular dystrophy type 2B，LGMD2B)是dysferlin肌病(dysferlinopathy)的一種最常見臨床亞型，主要表現(xiàn)為骨盆肌及大腿近端肌肉無力，致使患者下蹲后起立困難，隨著病情的進(jìn)展，肩胛帶肌肉、上肢肌肉也可被累及，而面部、頸部及手部肌肉一般不受累，常伴隨肌萎縮、血清肌酸激酶(creatine kinase,CK)升高表現(xiàn).LGMD2B 與Miyoshi肌病(miyoshi myopathy,MM)、以脛前肌發(fā)病的遠(yuǎn)端型肌病(distal myopathy with anterior tibial on-set，DMAT)、無癥狀的高肌酸激酶血癥等被統(tǒng)一稱為dysferlinopathy.dysferlinopathy是一組存在高度異質(zhì)性、包含多個(gè)臨床亞型的遺傳性肌肉變性疾病，屬于常染色體隱性遺傳；共同特征是由于DYSF基因的突變，使骨骼肌細(xì)胞膜上的dysferlin蛋白表達(dá)下降或缺失所致；目前尚未找到有效的治療方法.多發(fā)性肌炎(polymyositis,PM)是一組由多種病因引起的廣泛的骨骼肌炎性病變，其發(fā)病機(jī)制與免疫失調(diào)有關(guān)，臨床主要表現(xiàn)為對(duì)稱的四肢近端無力、肌肉壓痛、血清CK升高，大多對(duì)激素治療敏感.兩種疾病在發(fā)病機(jī)制、治療方案、預(yù)后方面明顯不同，但由于二者臨床表現(xiàn)、肌電圖改變、肌肉核磁共振影像(MRI)表現(xiàn)、肌肉活檢病理結(jié)果方面存在一定程度相似性[1]，臨床上易混淆.現(xiàn)總結(jié)我院5例LGMD2B患者診療經(jīng)過如下，旨在為臨床醫(yī)生減少誤診誤治提供幫助.

1 資料與方法

1.1 對(duì)象

收集2017年2月至2019年2月期間，主因“肌無力、肌酶升高”而就診空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的患者資料，5例病例初診時(shí)均誤診為多發(fā)性肌炎，最終住院確診為LGMD2B.

1.2 方法

回顧性分析5例病例詳細(xì)的病史、年齡、性別、發(fā)病年齡、首發(fā)癥狀、病程特點(diǎn)、生長發(fā)育史、家族史、其他器官受累情況，以及診療經(jīng)過等；檢測血清CK、自身抗體系列、免疫系列等,肢體骨骼肌MRI檢查，完善/復(fù)查肌活檢、行組織學(xué)染色(HE、MGT、PAS及ORO染色)、免疫組織化學(xué)染色(抗dystrophin-N、抗dystrophin-C、抗dystrophin-R、CD4、CD8、CD20、CD68、Calpain-3、dysferlin抗體，重點(diǎn)測定dysferlin蛋白的表達(dá))以及基因檢測等.

2 病例資料及結(jié)果

2.1 病例資料

病例1 患者，男，14歲，因“雙下肢無力2月”于2017年2月入院.既往史：3年前家屬發(fā)現(xiàn)患者雙足跟不能著地；1年前活動(dòng)時(shí)感雙下肢無力，補(bǔ)鉀1周后恢復(fù)，否認(rèn)家族史.現(xiàn)病史：2月前無明顯誘因出現(xiàn)雙下肢無力，上下樓梯費(fèi)力，遠(yuǎn)距離行走時(shí)疲憊感明顯，雙小腿按壓時(shí)疼痛；1月前行心肌酶譜檢查提示“CK 21 350 IU/L, 乳酸脫氫酶(LDH) 712 IU/L,谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST) 369 IU/L, 肌酸激酶同工酶(CK-MB) 458 IU/L”.體查：無明顯肌容積減少，雙上肢肌張力正常，雙下肢肌張力略下降，除雙下肢近端肌力5-級(jí)，余肢體肌力均5級(jí)，雙下肢腱反射(+).入院后肢體骨骼肌MRI及肌活檢均提示“多發(fā)性肌炎”，給予“靜點(diǎn)甲強(qiáng)龍”等治療，肢體無力略好轉(zhuǎn).2017年11月患者再次就診，進(jìn)一步肌活檢完善免疫組化及基因檢測而確診.

病例2 患者, 女,17歲，因“雙下肢無力4年”于2017年8月就診.既往無特殊病史，家族史：其妹妹有相似癥狀.現(xiàn)病史：4年前，無明顯誘因漸感雙下肢力弱，右側(cè)較左側(cè)更明顯，導(dǎo)致不能跑步，上下樓梯需扶欄桿，蹲下起立困難，家屬多次就診于外院，查心肌酶譜提示“CK為10 490 IU/L，CK-MB為680.10 IU/L,靜息乳酸的濃度為2.49 mmol/L，運(yùn)動(dòng)后乳酸濃度為7.46 mmol/L”，頭顱MRI提示雙側(cè)額葉、側(cè)腦室后角旁散在異常信號(hào)，考慮脫髓鞘，肌肉活檢考慮“空泡性肌病可能”，予以糖皮質(zhì)激素等治療.體查：頸肌、呼吸肌肌力正常，雙上肢肌力對(duì)稱5級(jí)，雙下肢肌力對(duì)稱4級(jí)，肌張力減低，腱反射(-)，未見局限性肌肉萎縮.2018年2月患者復(fù)診，經(jīng)完善肌肉活檢特殊免疫組化及基因檢測而確診.

病例3 患者，男，26歲，因 “發(fā)現(xiàn)血清肌酶升高7月，四肢肌肉酸痛1月” 于2018年4月入院.既往外傷致右側(cè)髕骨骨折.否認(rèn)家族史.現(xiàn)病史：7月前行“肛瘺切除術(shù)”，住院期間發(fā)現(xiàn)肌酶升高(CK為5 392.9 IU/L)，對(duì)癥治療后降至3 000 IU/L，無明顯肌無力、肌痛等.1月前雙下肢腓腸肌疼痛，且逐漸出現(xiàn)雙上肢上臂肌肉酸痛，復(fù)查CK為15 532 IU/L，給予激素治療，癥狀無明顯好轉(zhuǎn).體查：無肌肉萎縮，四肢肌肉壓痛顯著，雙上肢肌力5級(jí)，雙下肢肌力5-級(jí)，四肢肌張力及腱反射均正常.行肌肉MRI及活檢提示“多發(fā)性肌炎”，給予激素治療，CK為波動(dòng)在3 000～15 532 IU/L.2019年1月門診復(fù)查，肌肉壓痛消失，肌力及肌張力同前.基因檢測發(fā)現(xiàn)dysferlin基因突變.

病例4 患者, 女,32歲，因“走路姿勢(shì)異常10余年，肢體無力3年”于2019年2月入院.既往無特殊病史，家族史：父母屬于姨表近親結(jié)婚，2個(gè)弟弟中1人發(fā)現(xiàn)“肌酶升高”.現(xiàn)病史：10余年前患者被發(fā)覺行走姿勢(shì)略異常，未重視；3年前上下樓梯、蹲下站起費(fèi)力，行走姿勢(shì)異常較前明顯；1年前上肢提重物困難，目前平地走路不受限.查體：四肢近段肌力5-級(jí)，遠(yuǎn)端肌力5級(jí)，四肢肌張力、腱反射正常.查肌酸激酶3 580 IU/L;肌電圖呈下肢廣泛肌源性損害；骨骼肌MRI：雙側(cè)臀肌、盆底肌肉及大腿肌肉內(nèi)廣泛異常信號(hào)，考慮變性、脂肪化.當(dāng)?shù)蒯t(yī)院按“多發(fā)性肌炎”給予激素治療無效，后經(jīng)肌肉活檢免疫組化檢查dysferlin蛋白表達(dá)陰性，建議進(jìn)一步完善基因檢測.

病例5 患者，男，19歲，因“右下肢無力6月，左下肢無力4月”于2018年6月入院.既往外傷后致右眼視力下降.現(xiàn)病史：6月前在打籃球時(shí)發(fā)現(xiàn)右下肢無力，下蹲、起立費(fèi)力，未予重視；4月前左下肢稍感無力，化驗(yàn)肌酸激酶CK為15 805 IU/L，當(dāng)?shù)匕础岸喟l(fā)性肌炎”予以靜點(diǎn)“甲強(qiáng)龍”治療，雖CK稍下降，但肢體無力無顯著改善.體查：四肢肌張力正常，雙上肢肌力5級(jí)，雙下肢近端肌力5-級(jí)，遠(yuǎn)端5級(jí)，腱反射未見異常，肌肉壓痛陰性.住院期間反復(fù)化驗(yàn)CK持續(xù)升高，肌電圖提示肌源性損害，進(jìn)一步完善肌肉活檢免疫組化檢查提示dysferlin蛋白表達(dá)陰性而確診.

2.2 結(jié)果

2.2.1 臨床資料分析

5例首診為“PM”以后確診為LGMD2B的患者，發(fā)病年齡14～32歲，亞急性或慢性過程，病程2月至10年，主要表現(xiàn)為雙下肢無力，近端為著，肌萎縮均不明顯，肌痛2例，血CK顯著增加，為正常參考值(50～310 IU/L)的12～69倍，肌電圖呈肌源性損害，肌肉MRI提示炎性改變，均規(guī)范應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療，全部患者在大劑量激素治療后CK有所下降，但減量復(fù)升，癥狀緩解不明顯(詳見表1).

2.2.2 肌肉影像表現(xiàn)

5例患者均完善股骨MRI檢查，提示股骨周圍肌群不同程度腫脹，可見多發(fā)片狀稍長T2、等T1信號(hào)影，邊緣模糊，符合炎性表現(xiàn)；其中2例同時(shí)完善上臂、盆骨平面肌肉MRI檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙側(cè)上臂及雙側(cè)肩部肌肉內(nèi)散在多發(fā)片狀稍長T2、T1信號(hào)影，提示炎性病變，雙側(cè)髖關(guān)節(jié)周圍軟組織及雙側(cè)臀肌未發(fā)現(xiàn)異常信號(hào).

2.2.3 肌肉活檢組織化學(xué)染色及免疫組化病理結(jié)果

5例患者均進(jìn)行了肌活檢，其中4例取材部位為右側(cè)股四頭肌，1例取材于右側(cè)腓腸肌，活檢標(biāo)本行HE染色、NADH-TR染色、MGT染色和免疫組化染色.5例患者肌活檢組織學(xué)形態(tài)表現(xiàn)：橫紋肌纖維粗細(xì)不等，少數(shù)肌細(xì)胞核內(nèi)移，肌原纖維灶性丟失，肌漿網(wǎng)輕度增生并擴(kuò)張，少數(shù)肌纖維壞死，可見少量衛(wèi)星細(xì)胞及新生的肌細(xì)胞，間質(zhì)部分毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，血管周圍壞死肌纖維內(nèi)外有巨噬細(xì)胞及少量淋巴細(xì)胞灶浸潤.NADH-TR染色未見神經(jīng)源性肌損害特點(diǎn)；MGT未見破碎紅纖維等線粒體異常改變.免疫組織化學(xué)染色顯示：炎細(xì)胞CD68陽性，CD4少許陽性，CD8和CD20陰性，肌纖維DYS1和DYS2陽性，dystrophin、calpain-3表達(dá)正常，dysferlin表達(dá)水平明顯降低或缺如.

表1 5例患者臨床資料Table 1 Clinical datas of 5 patients

病例3患者左上臂及雙側(cè)股骨近端肌肉MRI T2壓脂序列，可見肌肉內(nèi)絮片狀高信號(hào)，符合炎性表現(xiàn).

In case 3, flake hyperintensity, which was in accordance with inflammation, could be observed in left upper arm and bilateral proximal muscle of thigh by MRI T2 liposuction sequence.

圖1 LGMD2B患者骨骼肌MRI

Fig.1 Skeletal muscle MRI of LGMD2B

2.2.4 基因檢測

病例1、3及其父母雙方，病例2、4分別采集靜脈血5 mL標(biāo)本，送至北京邁基諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，通過DYSF基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增進(jìn)行基因測序分析.結(jié)果：例1發(fā)現(xiàn)DYSF基因(NM_003494)c.6124C>T和c.6217A>G復(fù)雜雜合突變，其父攜帶DYSF基因c.6124C>T序列改變，其母親攜帶DYSF基因c.6217A>G序列改變；例2檢測到DYSF基因純合突變，為外顯子16 c.1439_1442del(移碼突變)；例3存在DYSF基因外顯子51 c.5713C>T (p.R1905X)純和突變，其父母存在雜合突變；例 4 存在DYSF基因外顯子 4c.331C>T(p.Gln111Ter)雜合突變；例5未行基因檢測.

最終，5例初期被誤診為PM的患者，經(jīng)過肌活檢、免疫組化、基因測定等檢查最終確診為dysferlinopathy, 且臨床均符合LGMD2B型.

A1、A2分別為病例3 LGMD2B患者及病例1多發(fā)性肌炎患者骨骼肌活檢組織病理檢測結(jié)果(HE×200):可見肌纖維粗細(xì)不等，伴不同程度變性、壞死，可見炎性細(xì)胞浸潤；B1為LGMD2B病例3的免疫組織化學(xué)染色，可見肌纖維膜dysferlin蛋白完全不著色；B2為多發(fā)性肌炎患者的免疫組織化學(xué)染色，可見肌細(xì)胞膜dysferlin蛋白陽性表達(dá)，呈棕色.

A1(case 3 LGMD2B)and A2 (case 1 PM), showed various sizes of myofibers, part of which were atrophic, degenerated and necrotic, inflammatory cell infiltration can be observed by HE staining(×200); B1 showed that dysferlin protein is not stained through immunohistochemical staining in case 3 of LGMD2B; B2 showed the positive expression of dysferlin protein in muscle cell membrane in polymyositis patient.

圖2 LGMD2B與PM患者骨骼肌活檢病理及免疫組化檢測對(duì)比

Fig.2 The differences of pathomorphology and immunohistochemical staining in skeletal muscle between LGMD2B and polymyositis

A為病例2的 16號(hào)外顯子上發(fā)現(xiàn)一個(gè)移碼突變 c.1439_1442del，導(dǎo)致氨基酸改變 ( p.S481Cfs*11);B為病例3的 cDNA第 5713位的 C變?yōu)門，導(dǎo)致氨基酸改變( p.R1905X)； C、 D分別為病例3的父母測序結(jié)果，均存在雜合突變.

As shown in A, frameshift mutation c. 1439 _ 1442 d e l, could be found in exon 16 of case 2, which resulted in amino acid change; Figure B showed that the C at position 5713 of patient 3 was changed to T, resulting in amino acid change; Figure C and D were the sequencing of the parents of patient 3, and there were heterozygous mutations.

圖3 LGMD2B患者基因測序圖

Fig.3 Gene sequencing map of LGMD2B

3 討論

dysferlinopathy在起病年齡、病程、肌無力類型及進(jìn)展情況等方面具有高度異質(zhì)性，但這種臨床異質(zhì)性與基因突變類型之間的關(guān)聯(lián)性尚不明[2].該病臨床表型多樣，根據(jù)首先受累肌群的不同而分類,包括以下肢近端肌無力為主LGMD2B、以小腿后群肌肉無力為主的MM、以脛骨前肌無力起病的DAMT、無癥狀的高肌酸激酶血癥及先天性肌病等多種類型，以前3種較多見[3].其共同特點(diǎn)為患者體內(nèi)存在DYSF基因突變，導(dǎo)致dysferlin蛋白完全或部分缺失.

DYSF基因全長150 kb，位于染色體 2p13，含55個(gè)外顯子，可轉(zhuǎn)錄成 8.5kb 的 mRNA 分子，編碼dysferlin 蛋白[4].根據(jù)萊頓肌肉萎縮癥全球數(shù)據(jù)庫顯示，迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該基因有510種不同突變，沒有發(fā)現(xiàn)突變熱點(diǎn)區(qū)；且大多數(shù)報(bào)道其突變多為點(diǎn)突變，小的缺失/插入和內(nèi)含子突變[5].表明DYSF基因突變類型存在多種形式，在對(duì)89例中國dysferlinopathy患者的DYSF基因突變譜進(jìn)行分析[6]，發(fā)現(xiàn)其突變類型包含錯(cuò)義突變、無義突變、移碼突變、缺失突變、內(nèi)含子突變、外顯子突變等，但未發(fā)現(xiàn)明確的基因-表型相關(guān)性[7].

由DYSF基因編碼的dysferlin 蛋白，為ferlin家族成員，其相對(duì)分子質(zhì)量為230 000，由Ca2+依賴脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域 C2、跨膜結(jié)構(gòu)域 T 和ferl、FerA、FerB、Dysf_N 及 Dysf_C 結(jié)構(gòu)域組成[8].dysferlin 蛋白在多種組織中表達(dá)，以在骨骼肌和心肌細(xì)胞膜內(nèi)面或胞質(zhì)囊泡內(nèi)表達(dá)最為集中，也表達(dá)于單核細(xì)胞.Dysferlin蛋白可調(diào)節(jié)受損骨骼肌內(nèi)囊泡與肌膜融合，參與肌細(xì)胞膜損傷的修復(fù)[9-10].dysferlin蛋白的多個(gè)結(jié)構(gòu)域與相關(guān)蛋白通過dysferlin復(fù)合體的形式共存于肌膜上[11]，參與了多種生理過程，與annexin 1、annexin 2、affixin和 caveolin-3共同維持膜穩(wěn)定性，與Cal-pain-3和 AHNAK進(jìn)行細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)，與mitsugumin53、MG53共同參與膜修復(fù).通常情況下，損傷骨骼肌細(xì)胞膜上存在dysferlin蛋白的高表達(dá)，其調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)囊泡聚集成“膜斑片”修復(fù)損傷的細(xì)胞膜.DYSF基因突變導(dǎo)致了不同程度的dysferlin蛋白表達(dá)減低、缺失或功能障礙，引起膜修復(fù)過程故障，肌細(xì)胞膜失去自我修復(fù)能力，發(fā)生肌纖維壞死和炎性反應(yīng)，從而出現(xiàn)漸進(jìn)性肌無力、肌萎縮等癥狀.

dysfedinopathy因臨床表現(xiàn)上多樣化，缺乏特異性，國內(nèi)外均有與多發(fā)性肌炎相互混淆，造成誤診誤治的報(bào)道.Nguyen等[12]在2007年進(jìn)行了一項(xiàng)有關(guān)dysferlinopathy 患者表型的研究，發(fā)現(xiàn)40例患者中高達(dá)1/4的患者被誤診過多發(fā)性肌炎，而接受了糖皮質(zhì)激素和/或免疫抑制劑治療.分析其容易被誤診為PM的原因，因?yàn)閮烧叽嬖谝韵路矫嫦嗨票憩F(xiàn)：(1)兩者有相似的臨床表現(xiàn).①起病年齡相似，多為青中年起??；②常表現(xiàn)為近段肌無力，部分可出現(xiàn)肌肉疼痛[13]，病程長者存在肌萎縮，查體多為近段肌無力，腱反射減低/消失.(2)化驗(yàn)及其他檢查結(jié)果有多種相似處.①均有血清肌酶學(xué)不同程度升高，以CK升高為主；②肌電圖均提示肌源性改變；③肌肉MRI多表現(xiàn)為骨骼肌肌肉脂肪化和水腫[14]，且dysferlinopathy不同亞型間肌肉MRI無特異性[15]；④肌活檢均可見不同程度的肌纖維變性、壞死，伴炎性細(xì)胞浸潤[16-18].

雖然臨床表現(xiàn)相似，但也有以下鑒別點(diǎn)：(1)dysferlinopathy一般病程長，多有家族史，一般不累及其他系統(tǒng)，化驗(yàn)血沉、C 反應(yīng)蛋白及免疫學(xué)指標(biāo)大多正常；而PM肌肉壓痛一般較明顯， 可伴隨有關(guān)節(jié)痛、雷諾現(xiàn)象、肺部等多系統(tǒng)受累表現(xiàn)，活動(dòng)期查血沉、C反應(yīng)蛋白及其他免疫指標(biāo)可異常.(2)dysferlinopathy及PM活檢骨骼肌病理均可見炎細(xì)胞浸潤，但進(jìn)一步分子免疫病理研究發(fā)現(xiàn) dysferlinopathy的炎細(xì)胞以巨噬細(xì)胞浸潤為主，伴隨少量CD8+T細(xì)胞浸潤，MHC-I陰性或弱陽性表達(dá)；PM以CD8+T細(xì)胞浸潤為主，伴隨MHC-I在非壞死肌纖維上的高表達(dá)[17]，有研究者將此免疫病理特征作為PM的免疫病理診斷標(biāo)準(zhǔn)[19].(3)dysfedinopathy肌纖維膜 dysferlin蛋白表達(dá)降低或缺失，而 PM肌細(xì)胞膜dysferlin蛋白呈陽性表達(dá)[20]，故而通過單克隆抗體免疫組化學(xué)染色檢測 dysferlin蛋白作為兩者關(guān)鍵的鑒別點(diǎn).(4)PM大多對(duì)激素敏感，而dysferlinopathy對(duì)激素治療無效，這也提示骨骼肌內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤并不是dysferlinopathy的主要發(fā)病機(jī)制，研究認(rèn)為dysferlinopathy的炎性反應(yīng)為dysferlin蛋白缺失致肌膜破損，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞聚集、吞噬引起的繼發(fā)性炎性反應(yīng)[21]，而PM則是通過CD8/MHC-I復(fù)合體與靶細(xì)胞緊密接觸，發(fā)揮直接殺傷作用，為原發(fā)性炎性反應(yīng).

本研究5例dysferlinopathy患者初時(shí)診斷為PM，均接受激素治療.但經(jīng)過全面的病史復(fù)習(xí)，對(duì)各項(xiàng)輔助檢查結(jié)果的綜合評(píng)估，以及對(duì)激素療效的評(píng)估之后，進(jìn)一步完善免疫組化檢查及基因檢測之后最終得以確診，提示免疫組織化學(xué)檢查(dysferlin、MHC-I、CD8)聯(lián)合基因檢測可有效鑒別兩者.有研究通過測量血液中單核細(xì)胞的dysferlin表達(dá)有望代替肌肉活檢，既可減少創(chuàng)傷，又可降低經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且使操作更加簡單[22].雖然，目前諸多研究對(duì)dysferlinopathy嘗試了基因治療、細(xì)胞治療及小分子治療等治療[23]，仍未發(fā)現(xiàn)有效的治療方法.然而及時(shí)正確地進(jìn)行鑒別診斷，可減少不必要的激素或免疫抑制劑的使用，避免了上述藥物對(duì)患者帶來的不必要的副作用及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān).