賈子昉，王清連，董娜

河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心/河南省棉麥分子生態(tài)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng)453003

開展棉花品種的遺傳多樣性研究具有重要的意義，近年來(lái)對(duì)自育品種、亞洲棉、陸地棉等的遺傳多樣性研究越來(lái)越多，對(duì)種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究是目前育種工作者的主要任務(wù)。目前，分子標(biāo)記如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）等已被廣泛應(yīng)用于棉花遺傳多樣性研究。其中，SSR 以其具有較高的多態(tài)性、共顯性、DNA 樣本用量少而被大范圍應(yīng)用[1-4]。前人利用表型性狀對(duì)棉花遺傳多樣性進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究[5-8]，但是將表型性狀與分子標(biāo)記兩者同時(shí)應(yīng)用于遺傳多樣性研究的報(bào)道較少。本研究中，我們主要利用SSR 標(biāo)記及表型分析探討300 份種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為育種工作者提供豐富的品種遺傳多樣性信息，為合理進(jìn)行親本雜交選配，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和多抗新品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的300 份陸地棉種質(zhì)資源材料由河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院的棉花種植試驗(yàn)田提供（表1）。試驗(yàn)材料于2016 年4 月種植于試驗(yàn)田，同時(shí)開始2 年的田間表型性狀調(diào)查，室內(nèi)試驗(yàn)于2018年10 月進(jìn)行。

1.2 棉花基因組DNA 的提取

在棉花生長(zhǎng)旺盛時(shí)期，每一個(gè)品種隨機(jī)任取2 株上未展平的新鮮嫩葉1～2 片，放入預(yù)冷的離心管中，立即加入600 μL 預(yù)冷的DNA 提取液，用電鉆法將嫩葉組織磨至細(xì)碎。用改良CTAB 法提取DNA[9-10]。DNA 溶解在滅菌的TE 中，濃度為50 ng/μL。

1.3 SSR 引物的篩選

隨機(jī)選取16 份種質(zhì)材料對(duì)372 對(duì)SSR 引物進(jìn)行初篩，共得到72 對(duì)差異性引物。372 對(duì)SSR 引物序列信息來(lái)自棉花分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)（CMD；http://www.cottonmarker.org），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，包括84 對(duì)BNL 引物、20 對(duì)JESPR 引物、267 對(duì)NAU 引物、1 對(duì)TMB 引物。從72 對(duì)差異性引物中選取重復(fù)性好、條帶清晰穩(wěn)定、信號(hào)強(qiáng)的38 對(duì)引物（表2），在300 份供試材料間進(jìn)行PCR 反應(yīng)[11]。

1.4 PCR 擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

PCR 反應(yīng)體系為10 μL，包括1.0 μL 模板，正、反引物（5 μmol/L）各0.5 μL，5 μLTaqMasteMix（含有TaqDNA 聚合酶、PCR 緩沖液、Mg2+、dNTPs），3 μL ddH2O。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性2 min；94℃變性45 s，57℃退火45 s，72℃延伸60 s，循環(huán)30 次；72℃延伸7 min；10℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-6C 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀上經(jīng)9%聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)，恒定電壓180 V，電泳1 h，銀染后觀察并照相[12-13]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

對(duì)2 年田間數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值處理，采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述分析，得到方差、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)等參數(shù)，并進(jìn)行

聚類分析。對(duì)SSR 電泳圖譜上的條帶，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，缺失記為“2”[9,14]。用NTSYS-pc2.10e 軟件處理SSR 分型數(shù)據(jù)，計(jì)算品種對(duì)之間的遺傳相似系數(shù)，并獲得相似系數(shù)矩陣。用SHAN 程序中的UPGMA（Unweighted pair-group method with rithmetic averages）方法進(jìn)行聚類分析，并通過(guò)Treeplot 模塊生成聚類圖。

表1 300份供試棉花材料

2 結(jié)果

2.1 300 份種質(zhì)的表型性狀遺傳多樣性方差分析

根據(jù)性狀調(diào)查結(jié)果，對(duì)300 份陸地棉種質(zhì)資源的生育期、單鈴重、株高、衣分、鈴數(shù)、皮棉產(chǎn)量、子棉產(chǎn)量、發(fā)病指數(shù)等產(chǎn)量性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表3）。上述8 個(gè)主要農(nóng)藝性狀中，300 份種質(zhì)資源的生育期、單鈴重、株高、衣分、鈴數(shù)、皮棉產(chǎn)量、子棉產(chǎn)量等性狀都有極顯著差異，只有發(fā)病指數(shù)不參與顯著性分析；鈴數(shù)、皮棉產(chǎn)量、子棉產(chǎn)量、發(fā)病指數(shù)等的變異系數(shù)很大，均超過(guò)20%；單鈴重的變異系數(shù)大于10%；生育期、衣分、株高的變異系數(shù)均低于10%；8 個(gè)表型性狀變異系數(shù)大小依次為發(fā)病指數(shù)＞皮棉產(chǎn)量＞鈴數(shù)＞單鈴重＞株高＞衣分＞子棉產(chǎn)量＞生育期；300 份種質(zhì)資源間的大部分表型性狀存在顯著差異，說(shuō)明所選用的陸地棉種質(zhì)資源的表型性狀差異明顯、變異范圍大，具有比較好的代表性。對(duì)300 份棉花供試材料依據(jù)Shannon-Weaver 信息指數(shù)公式計(jì)算形態(tài)多樣性指數(shù)，從結(jié)果可以看出300 份供試材料的平均多樣性指數(shù)為5.597，8 個(gè)形態(tài)指標(biāo)的多樣性指數(shù)依次為5.703、5.696、5.700、5.699、5.633、5.608、5.622、5.117，均表現(xiàn)出較高的多樣性；多樣性水平依次為生育期＞衣分＞株高＞單鈴重＞鈴數(shù)＞子棉產(chǎn)量＞皮棉產(chǎn)量＞發(fā)病指數(shù)。變異系數(shù)和Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)在表型性狀方面，2 個(gè)計(jì)算方法所得結(jié)果并不一致，這與前人的研究結(jié)果相同。原因可能是因?yàn)槎鄻有灾笖?shù)和變異系數(shù)的性質(zhì)以及計(jì)算方法不同。Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)強(qiáng)調(diào)的是不同層次分布的均勻度，而變異系數(shù)強(qiáng)調(diào)的是數(shù)值變異的大小。

2.2 300 份種質(zhì)的表型性狀聚類分析

表2 38 對(duì)多態(tài)性引物信息

表3 300份種質(zhì)資源表型性狀差異

利用SPSS19.0 軟件，根據(jù)調(diào)查的形態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，得到親緣關(guān)系聚類圖（圖1）?？梢钥闯?，300 份種質(zhì)資源被分為Ⅰ和Ⅱ兩大類，Ⅰ包括151 份品種，Ⅱ包括149 份品種。Ⅰ和Ⅱ又各自被分成Ⅰ-1、Ⅰ-2 和Ⅱ-1、Ⅱ-2，它們又分成Ⅰ-1-A、Ⅰ-1-B、Ⅰ-2-A、Ⅰ-2-B、Ⅱ-2-A、Ⅱ-2-B 等類別。

Ⅰ-1-A1 主要是一些抗蟲、抗黃萎病、中大鈴的優(yōu)質(zhì)品種，包括75、104、188、272、57、198、72、133、288、135、267 等46 份材料。

Ⅰ-1-A2 包括79、169、12、94、146、176、4、42、50、69、168、286 等27 份材料，該類群的特征不太統(tǒng)一，主要是色澤比較差的品種，還有一些高蛋白耐鹽優(yōu)質(zhì)品種、高抗黃萎病品種，如DES926；還有一個(gè)是國(guó)內(nèi)引進(jìn)品種，紅桃。

Ⅰ-1-B1 包括148、268、144、278、172、237、242、256、277、128、56、250、282 等13 份材料，主要是一些創(chuàng)新種質(zhì)及OLD 品種，生育期比較長(zhǎng)，鈴重居中，株高比較低，棉鈴蟲抗性較低。

Ⅰ-1-B2 包括183、293、190、255、35、187、129、232、260、67 等28 份材料。只有長(zhǎng)德184、抗黃萎164 兩個(gè)品種抗蟲，其他均不抗蟲；生育期都很長(zhǎng)，株高低。

Ⅰ-2-A 包括88、197、95、155、159、58、140、249、264、248、269 等17 份材料。株高偏低，均為不抗蟲品種。

Ⅰ-2-B1 包括283、284、36、231、234、139、161、38、292、285、296、280 等12 份材料，主要是一些豐產(chǎn)品種，不抗蟲，大部分為國(guó)外引進(jìn)品種。

Ⅰ-2-B2 包括48、127、138、257、167、126、273、136 等8 份材料。產(chǎn)量很低，鈴數(shù)少，衣分低，不抗蟲。

Ⅱ-2-A 包括142、264、201、62、130、65、212、60、173、37、195、73 等20 份材料，個(gè)別抗蟲，整體生育期較長(zhǎng)，矮桿，豐產(chǎn)。

Ⅱ-2-B1 包括218、241、131、238、253、30、177、243、270、281、107 等22 份材料。該亞類的特征是不抗蟲。

Ⅱ-2-B21 包括24、109、157、196、90、215、74、125、118、91、96、5、6 等34 份材料。該類群的品種大部分高產(chǎn)，株高偏低。

Ⅱ-2-B22 包括251、294、14、244、290、3、236、97、210、233、77、240 等32 份材料。衣分高，抗黃萎病指數(shù)比較高。

2.3 SSR 標(biāo)記多態(tài)性分析

在篩選出的38 對(duì)引物中，共檢測(cè)出126 個(gè)等位位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)為90 個(gè)，占71.43%，多態(tài)性比例較低。每個(gè)標(biāo)記等位位點(diǎn)的數(shù)量范圍為2～10 個(gè)，平均3.66 個(gè)；每個(gè)標(biāo)記的多態(tài)性位點(diǎn)為1～6個(gè)，平均2.42 個(gè)；引物JESPR291 擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶最多，為6 條，其次為引物NAU2679、NAU3888，均為5 條。

2.4 成對(duì)相似系數(shù)分析

利用NTSYS-pc2.10e 和Excel 軟件計(jì)算品種對(duì)間的遺傳相似系數(shù)，相似系數(shù)矩陣由于過(guò)大沒(méi)有列出，僅列出品種間的相似系數(shù)統(tǒng)計(jì)分析表（表4）。結(jié)果顯示，各品種對(duì)的相似系數(shù)為0.175～0.905，平均值0.533。遺傳差異較大（相似系數(shù)小于0.500）的品種對(duì)占46.31%，比例適中。46%品種對(duì)的遺傳相似系數(shù)較小，說(shuō)明品種對(duì)之間的遺傳多樣性比較豐富。其中，M183 和M82 的遺傳相似系數(shù)最小，為0.175，遺傳差異最大；M101 和M81 的遺傳相似系數(shù)最大，為0.905，遺傳相似度極高。

2.5 SSR 標(biāo)記的聚類分析

通過(guò)遺傳相似系數(shù)進(jìn)行UPGMA 聚類（圖2），閾值為0.400 時(shí)，300 個(gè)品種被聚為Ⅰ和Ⅱ兩大類群。類群Ⅰ包括150 份種質(zhì)，閾值為0.590 時(shí)又被分為Ⅰ-1、Ⅰ-2 兩大類。Ⅰ-1 在閾值為0.616 時(shí)被分為兩類，Ⅰ-A 包括148 份種質(zhì)，遺傳相似系數(shù)為0.632～0900；Ⅰ-B 僅有1 份種質(zhì)蘇聯(lián)棉91系。Ⅰ-2 僅包括1 個(gè)品種博樂(lè)07-301。

Ⅰ-A 在閾值為0.65 時(shí)被分為9 個(gè)亞類。Ⅰ-A1 包括1、22、21、9、71 等68 份種質(zhì)，來(lái)源比較復(fù)雜，大部分為抗蟲品種，產(chǎn)量高。Ⅰ-A2 包括6、15、116、41、123 等24 份種質(zhì)，品種復(fù)雜，無(wú)明顯的共同特征，但大體上大部分均為抗蟲品種。Ⅰ-A3 只有庫(kù)車T94-6、魯農(nóng)9648 兩個(gè)品種。Ⅰ-A4 包括新陸早6 號(hào)、陜?cè)?786、新陸棉201、徐州219、冀遠(yuǎn)12-13，為OLD，不抗蟲品種。Ⅰ-A5 包括山農(nóng)豐抗6 號(hào)、R01/中三都4121 F9、宿9108/R03 F9。Ⅰ-A6 包括PD6186、新陸早38 號(hào)、中R1029、豫棉19、遼棉15 號(hào)、LA887/宿Bt F9、A41772BBt F7、中資9103、運(yùn)93 抗393，豐產(chǎn)耐旱品種。Ⅰ-A7 包括時(shí)09、中1816、抗黃萎164、中R014121。Ⅰ-A8 包括Ari971、中RI015、CZA（70）33、中AR40772、TM1-IPR、中遠(yuǎn)9115、L142-9、十五創(chuàng)新種質(zhì)，耐旱、耐鹽、抗蟲。Ⅰ-A9 包括6 份種質(zhì)，魯棉2 號(hào)、徐州514、A41772152 F6、14214612 F5、SGK 石選321、遼棉-5 號(hào)。

表4 相似系數(shù)統(tǒng)計(jì)分析

圖1 基于表型性狀的聚類圖

圖2 基于SSR 的聚類圖

類群Ⅱ包括150 個(gè)品種，閾值為0.594 時(shí)又被分為Ⅱ-1、Ⅱ-2 兩大類。Ⅱ-1 在遺傳相似系數(shù)為0.632 時(shí)被分為兩類，Ⅱ-A 包括136 個(gè)品種，遺傳相似系數(shù)變幅為0.635～0.891；Ⅱ-B 包括11 個(gè)品種，遺傳相似系數(shù)變幅為0.655～0.828。Ⅱ-2 包含3 個(gè)品種，分別為838、川棉-239、納上區(qū)大花，遺傳相似系數(shù)為0.638～0.683。

Ⅱ-A 又被分為8 個(gè)亞類。Ⅱ-A1 包括11 個(gè)品種，塔什干6 號(hào)、湘163、川R128、蘇BR6202Bt、J02-247、石抗278、澳B 資10、鄂沙28、泗長(zhǎng)2 系、CS50、蘇農(nóng)6 號(hào)，大部分為創(chuàng)新種質(zhì)。Ⅱ-A2 包括豫284、中遠(yuǎn)911、中G5。Ⅱ-A3 包括奎屯80-2056W、AcalaSJ-1-9、34 系、Miscot7803-52。Ⅱ-A4 包括永濟(jì)1 號(hào)、中31-204。Ⅱ-A5 包括229、285、296、298、186、277、279、292、248、234、297 等11 個(gè)品種，無(wú)鮮明特點(diǎn)。Ⅱ-A6 包括181、177、172、164 等28 個(gè)品種，大部分為創(chuàng)新種質(zhì)，豐產(chǎn)，來(lái)源較近。Ⅱ-A7 包括158、214、181、202、231 等45 個(gè)品種，大體上均抗蟲，豐產(chǎn)，抗黃萎病。Ⅱ-A8 包括180、281、190、212、154 等43 個(gè)品種，株高比較高，主要是一些具有不同特殊品質(zhì)的高蛋白、高酚等優(yōu)質(zhì)品種。

3 討論

前人大量研究表明，聚類分析結(jié)果與該試驗(yàn)所選用的引物本身及引物數(shù)量有很大關(guān)系，考慮成本和效率的前提下，引物數(shù)量越多越好[15-17]。為了提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，我們盡可能多地使用SSR 引物。篩選出的38 對(duì)多態(tài)性引物均已定位在棉花染色體上，如果這些引物能夠覆蓋全部連鎖群，試驗(yàn)結(jié)果將會(huì)更加理想。

本試驗(yàn)所篩選出的多態(tài)性引物數(shù)量比較少，多態(tài)性比率不高，很可能與采用隨機(jī)選取法選取16 個(gè)品種進(jìn)行引物初篩有關(guān)，應(yīng)選用地理來(lái)源或表型性狀差異較大的品種進(jìn)行初篩。

表型性狀和SSR 分子標(biāo)記分析均被應(yīng)用于棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究，但2 種類型的分析結(jié)果各有側(cè)重。表型性狀調(diào)查結(jié)果是對(duì)觀測(cè)性狀的直接表現(xiàn)，而分子標(biāo)記則揭示了個(gè)體在基因組水平上的基因結(jié)構(gòu)之間的部分差異，只有將不同類型的數(shù)據(jù)結(jié)合起來(lái)使用，才能比較全面準(zhǔn)確地闡明品種之間的遺傳關(guān)系[18-21]。

本試驗(yàn)就將這2 種分析方式結(jié)合，通過(guò)分析可知，這2 種聚類結(jié)果既有一致的地方，也存在差異。例如，在2 種聚類結(jié)果中，總的大類聚類結(jié)果是一致的，43、26 和33 號(hào)等材料在表型聚類和分子標(biāo)記聚類中被聚在同一類，類似的在2 種分類結(jié)果中得到相同聚類結(jié)果的材料所占比例很高。但是有些試驗(yàn)材料在2 種聚類方法中卻表現(xiàn)出較大的差異，如1、109 號(hào)材料在形態(tài)性狀聚類中的親緣關(guān)系極近，但在SSR 分子標(biāo)記聚類中卻被聚在了同一大類的2 個(gè)亞類。

總之，2 種方法在大的類群劃分上表現(xiàn)出比較好的一致性，但在類群內(nèi)的劃分出現(xiàn)了較大差異。這表明所選試驗(yàn)材料之間的遺傳差異大小的變化，很可能會(huì)導(dǎo)致用遺傳相似系數(shù)與遺傳距離來(lái)確定的品種之間的遺傳差異的變化。分子標(biāo)記從DNA 分子水平揭示的多樣性信息量大，更能比較真實(shí)地反映多態(tài)性的水平，本試驗(yàn)表明了分子標(biāo)記用于檢測(cè)遺傳多樣性的可靠性。在育種選種時(shí)，可以依據(jù)品種之間的遺傳相似系數(shù)的高低來(lái)選擇。但是，在實(shí)際中很難評(píng)定哪種聚類方法更好，要根據(jù)研究目的而定，對(duì)于以遺傳多樣性為基礎(chǔ)的核心種質(zhì)的構(gòu)建來(lái)說(shuō)，既要考慮基因型，又要考慮表現(xiàn)型，同時(shí)還要兼顧一些特異種質(zhì)資源，所以要多層面、多角度地分析研究，多種方法結(jié)合使用并相互印證，才能比較全面地了解種質(zhì)之間的親緣關(guān)系。

綜上，表型和SSR 聚類分析表明本實(shí)驗(yàn)室保存的300 份棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性指數(shù)較高，表現(xiàn)出較豐富的遺傳多樣性，為培育高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)早熟的棉花新品種提供了理論依據(jù)。