丁曉霞，馬生軍，楊建波，馬留純，李淑珍，范金蕾，宋婷婷

1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052；2.中國食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所，北京100050

新疆紫草［Arnebia euchroma（Royle） Johnst］是紫草科多年生草本植物，生長于海拔2000～4200 m 高山草甸或向陽坡地，集中分布于新疆天山山脈有限的區(qū)域[1]。雖然對新疆紫草的歷史記載甚少，但是因其資源豐富，品質(zhì)最佳，現(xiàn)已成為商品紫草的主要來源。新疆紫草的根粗壯，外表紫紅色，作為中藥在《本草綱目》中以解表涼血、清熱解毒、活血化瘀等廣譜療效被列為上品[2]。由于新疆紫草色素的色價高、附著力強(qiáng)，并具有較強(qiáng)的吸收紫外輻射的功能，被譽(yù)為紅色素之王，具有廣泛的應(yīng)用價值[3]。

目前尚未見關(guān)于新疆紫草種子及其萌發(fā)過程中酶類物質(zhì)變化的報道[4-5]。在本研究中，我們比較了新疆紫草種子在不同物理處理?xiàng)l件下的發(fā)芽情況，并對其萌發(fā)過程中過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）酶活力的變化進(jìn)行探討，以期為下一步人工大面積栽培提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

新疆紫草種子分別于2016、2017 年采自新疆巴音郭楞蒙古族自治州和靜縣成熟果實(shí)；供試基質(zhì)河沙購自新疆烏魯木齊市明珠花卉市場。

1.2 方法

選取結(jié)構(gòu)完整、均勻飽滿的新疆紫草種子，分別設(shè)置不同貯藏時間（1、2 年）、不同光照（白熾燈光照、半遮蔭、全遮蔭）、不同溫度［室溫，60℃、90℃、110℃短時高溫（5 min）］，然后在清水中浸泡24 h 后播種于河沙中，于光照培養(yǎng)箱中（25±1）℃全天光照培養(yǎng)。觀察每日發(fā)芽情況，記錄相關(guān)發(fā)芽指標(biāo)[6-10]。同時，于種子置床后第11 d 開始發(fā)芽時測定CAT、POD、SOD 活力，直至種子停止發(fā)芽，共21 d。每個處理設(shè)3 個重復(fù)，每個重復(fù)30 粒種子。

1.3 指標(biāo)測定

種子置于培養(yǎng)皿中，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d，待培養(yǎng)皿中露第一個芽尖起（1～2 cm），記錄該培養(yǎng)皿中每天的發(fā)芽率。發(fā)芽率指在規(guī)定條件下（21 d 內(nèi)）能正常發(fā)芽的種子數(shù)占提供檢測的種子總數(shù)量的百分?jǐn)?shù)。每日發(fā)芽率是指在規(guī)定條件下（21 d）當(dāng)日發(fā)芽的種子數(shù)占提供檢測的種子總數(shù)量的百分比。

試驗(yàn)結(jié)束后，每個處理隨機(jī)選取8 株幼苗（不足8 株，則每株均測定），用毫米直尺測量幼苗根長，計算平均值，作為評價幼苗生長情況的依據(jù)。

1.4 酶活力測定方法

參考李合生等的方法，采用紫外吸收法、愈創(chuàng)木酚法、氮藍(lán)四唑光化還原（NBT）法，分別測定CAT、POD、SOD 活力，并做合理性修改[11]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用WPS Excel 2019 和SPSS Statistics 17.0進(jìn)行做圖和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 不同貯藏時間對新疆紫草種子萌發(fā)特性的影響

不同貯藏時間新疆紫草種子萌發(fā)過程中生長指標(biāo)的統(tǒng)計結(jié)果見表1，CAT、POD、SOD 活力變化見圖1。

由表1 可知，貯藏1 年和2 年的新疆紫草種子總發(fā)芽數(shù)、發(fā)芽率間存在顯著性差異（P＜0.05），而根長間差異不顯著。貯藏2 年的種子發(fā)芽率為63.33%，相比貯藏1 年的種子發(fā)芽率（74.11%）下降了10.78%。由此說明，貯藏年限對新疆紫草種子的萌發(fā)存在一定的影響，種子貯藏年限越短發(fā)芽率越高。

由圖1 可知，貯藏1 年的新疆紫草種子日均發(fā)芽率略高于貯藏2 年的種子，貯藏1 年和2 年的種子最大日均發(fā)芽率分別為5.33%、4.00%，二者相差1.33%。貯藏2 年的種子從第17 d 開始停止萌發(fā)，萌發(fā)持續(xù)時間7 d；而貯藏1 年的種子從第21 d 開始停止萌發(fā)，萌發(fā)持續(xù)時間11 d，其萌發(fā)持續(xù)天數(shù)也較前者更長。還可以看出，不同貯藏時間下新疆紫草種子萌發(fā)過程中CAT、POD、SOD活力整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在相同時間貯藏1 年的種子3 種酶的活力均高于貯藏2 年的種子。CAT、POD、SOD 活力除貯藏1 年的種子其SOD 活力最大值在發(fā)芽后第7 d 外，其余均出現(xiàn)在發(fā)芽后第5 d。貯藏1 年和2 年的新疆紫草種子的CAT 活力最大值分別為78.88、65.79 U/（g·min），貯藏1 年的種子比2 年的高13.09 U/（g·min）；POD 活力最大值分別為100.86、69.79 U/（g·min），貯藏1 年的種子比2 年的高31.07 U/（g·min）；SOD 活力最大值分別為78.67、65.79 U/g，貯藏1 年的種子比2 年的高12.88 U/g。

表1 不同貯藏時間對新疆紫草種子萌發(fā)的影響（x±s，n=3）

圖1 不同貯藏時間新疆紫草種子萌發(fā)過程中CAT（A）、POD（B）、SOD（C）活力的變化

2.2 不同光照處理對新疆紫草種子萌發(fā)特性的影響

不同光照處理貯藏1 年的新疆紫草種子萌發(fā)過程中生長指標(biāo)的統(tǒng)計結(jié)果見表2，CAT、POD、SOD 酶活力變化結(jié)果見圖2。

由表2 可知，白熾燈光照、半遮蔭和全遮蔭處理的新疆紫草種子總發(fā)芽數(shù)、發(fā)芽率間存在顯著性差異（P＜0.05）；白熾燈光照和半遮蔭處理間根長不存在顯著性差異，但全遮蔭處理與前二者間差異顯著（P＜0.05）。白熾燈光照處理的種子發(fā)芽率最高為78.89%，其次為半遮蔭處理為53.33%，全遮蔭處理的種子發(fā)芽率最低僅為10.00%，相比白熾燈光照和半遮蔭處理的種子其發(fā)芽率分別下降了68.89%、43.33%；白熾燈光照和半遮蔭處理的種子根長分別為6.89、5.03 cm，是全遮蔭處理種子根長（1.93 cm）的3.57 倍和2.61 倍。由此說明，光照和適度的遮蔭處理（半遮蔭）對新疆紫草種子的發(fā)芽有利，而全遮蔭處理將嚴(yán)重阻礙其種子的萌發(fā)。

表2 不同光照處理對新疆紫草種子萌發(fā)的影響（x±s，n=3）

圖2 不同光照處理新疆紫草種子萌發(fā)過程中CAT（A）、POD（B）、SOD（C）活力的變化

由圖2 可知，全遮蔭處理的新疆紫草種子日均發(fā)芽率在剛開始發(fā)芽階段與白熾燈光照和半遮蔭處理基本相同，但隨著發(fā)芽時間的延長其日均發(fā)芽率持續(xù)下降，于發(fā)芽后第7 d 停止發(fā)芽不再有新的種子萌發(fā)；而白熾燈光照和半遮蔭處理的種子日均發(fā)芽率則是先隨發(fā)芽時間的延長持續(xù)增加，到第15 d 后才開始下降，且發(fā)芽持續(xù)天數(shù)也較全遮蔭處理更長。還可以看出，不同光照處理下新疆紫草種子萌發(fā)過程中CAT、POD、SOD活力整體亦呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在相同時間3 種酶活力依次為白熾燈光照＞半遮蔭＞全遮蔭處理。白熾燈光照和半遮蔭處理的CAT、POD、SOD 活力最大值均出現(xiàn)在發(fā)芽后第5 d，而全遮蔭處理的種子3 種酶活力最大值均出現(xiàn)在發(fā)芽后第3 d。各處理3 種酶活力最大值均為白熾燈光照＞半遮蔭＞全遮蔭處理，從大到小CAT 活力最大值分別為152.21、117.13、67.86 U/（g·min），白熾燈光照和半遮蔭處理的種子比全遮蔭處理的種子分別高84.35、49.27 U/（g·min）；POD 活力最大值分別為329.27、256.52、139.51 U/（g·min），前兩者比后者分別高189.76、117.01 U/（g·min）；SOD 活力最大值分別為117.43、57.94、28.44 U/g，前兩者比后者分別高88.99、29.50 U/g。

2.3 不同溫度處理對新疆紫草種子萌發(fā)特性的影響

不同溫度處理貯藏1 年的新疆紫草種子萌發(fā)過程中生長指標(biāo)的統(tǒng)計結(jié)果見表3，CAT、POD、SOD 酶活力變化結(jié)果見圖3。

由表3 可知，60℃短時高溫和室溫、90℃短時高溫處理的新疆紫草種子間總發(fā)芽數(shù)不存在顯著性差異，但與110℃短時高溫間差異顯著（P＜0.05）；60℃短時高溫和其他3 個處理的種子發(fā)芽率間存在顯著性差異（P＜0.05）；60℃短時高溫處理的種子根長與室溫、90℃、100℃短時高溫3 個處理間存在顯著性差異（P＜0.05）。60℃短時高溫處理的種子發(fā)芽率最高為81.11%，其次室溫處理為76.49%，110℃短時高溫處理的種子發(fā)芽率最低為46.00%，相比60℃短時高溫和室溫處理的種子其發(fā)芽率分別下降了35.11%、30.49%；60℃短時高溫和室溫處理的種子根長分別為6.96、5.59cm，是110℃短時高溫處理種子根長（4.45 cm）的1.56 倍和1.26 倍。由此說明，適度的短時高溫處理（60℃）對新疆紫草種子的發(fā)芽有促進(jìn)作用，而處理溫度過高則會抑制其種子的萌發(fā)。

表3 不同溫度處理對新疆紫草種子萌發(fā)過程的影響（x±s，n=3）

圖3 不同溫度處理新疆紫草種子萌發(fā)過程中CAT（A）、POD（B）、SOD（C）活力的變化

由圖3 可知，室溫和60℃、90℃、110℃短時高溫處理的新疆紫草種子日均發(fā)芽率整體上呈先升高后下降的趨勢；室溫和60℃、90℃短時高溫處理的種子于開始發(fā)芽后第11 d 停止發(fā)芽不再有新的種子萌發(fā)，而110℃短時高溫處理的種子則于開始發(fā)芽后第9 d 停止萌發(fā)，其發(fā)芽持續(xù)時間與前3 者相比更短。還可以看出，不同溫度處理下新疆紫草種子萌發(fā)過程中CAT、POD、SOD 活力整體亦呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且相同時間3種酶活力均為60℃短時高溫處理的種子最高，110℃短時高溫處理的種子最低。CAT、POD、SOD活力最大值出現(xiàn)時間變化不一，其中CAT 活力最大值為60℃短時高溫＞90℃短時高溫＞室溫＞110℃短時高溫處理，從大到小CAT 活力最大值分別為70.03、57.83、40.72、31.62 U/（g·min），60℃短時高溫處理的種子比110℃處理的種子高38.41 U/（g·min）。POD 和SOD 活力最大值則為60℃短時高溫＞室溫＞90℃短時高溫＞110℃短時高溫處理，從大到小POD 活力最大值分別為166.60、148.41、138.79、73.26 U/（g·min），60℃短時高溫處理的種子比110℃處理的種子高93.34 U/（g·min）；SOD活力最大值分別為156.23、146.42、140.25、64.87 U/g，60℃短時高溫處理的種子比110℃處理的種子高91.36 U/g。

3 討論

過氧化氫酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶一起被稱為酶保護(hù)系統(tǒng)[12]。CAT 是生物演化過程中建立起來的生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，它可以催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的分解。POD 是一類以過氧化氫為底物，氧化其他化合物的氧化還原酶，它存在于植物從萌發(fā)到衰老的整個生長發(fā)育過程，參與植物的生長代謝，木質(zhì)素、細(xì)胞壁的生物合成，對植物的生長起到促進(jìn)作用[13]。SOD 是活性氧清除反應(yīng)中的參與者，在抗氧化酶系統(tǒng)中處于核心地位，廣泛分布于植物細(xì)胞中[14]。因此，在種子萌發(fā)過程中普遍以這3 種酶活性的變化來衡量植物種子的發(fā)芽情況。

在種子萌發(fā)前期，酶活性普遍較低，表明種子內(nèi)各種酶都在積蓄為種子的萌發(fā)做準(zhǔn)備，隨著種子的持續(xù)萌發(fā)其活性逐漸提高，繼而促進(jìn)種子的發(fā)芽[15]。本研究結(jié)果表明，新疆紫草種子萌發(fā)過程中CAT、POD、SOD 的活力整體呈先上升后下降的趨勢，在3 種酶活性增加過程中日均發(fā)芽率也逐漸增加，種子發(fā)芽率也相應(yīng)增大。新疆紫草種子貯藏1 年時的發(fā)芽率明顯高于貯藏2 年的種子，其對應(yīng)的3 種酶活力也相對更高，說明酶作為一類具有催化能力的蛋白質(zhì)其催化作用具有一定的時效性，CAT、POD、SOD 促進(jìn)種子發(fā)芽的作用會隨貯藏時間的延長而不斷下降。酶活力受多種因素的調(diào)節(jié)控制，有些酶的活性與輔助因子密切相關(guān)，光合作用、呼吸作用均離不開酶的參與，反之酶活性的大小亦受光照強(qiáng)弱的影響[16]。新疆紫草種子在白熾燈光照處理時其發(fā)芽率和3種酶的活性較半遮蔭和全遮蔭處理更高，說明白熾燈全天光照培養(yǎng)能更好地激活種子內(nèi)3 種酶的活性，繼而促進(jìn)其種子的萌發(fā)。酶具有易變性失活的特性，尤其在受到外界高溫、高壓、強(qiáng)酸等因素影響時其結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，不同植物體內(nèi)酶的最適溫度也不相同[16]。新疆紫草種子在60℃短時高溫處理時發(fā)芽率顯著高于室溫和90℃、110℃短時高溫處理便很好地證明了這一點(diǎn)，說明在該溫度范圍內(nèi)其3 種酶的活性更強(qiáng)、酶促反應(yīng)速度更大，對種子萌發(fā)的促進(jìn)作用也更明顯。

綜上，貯藏1 年、白熾燈光照和60℃短時高溫處理的新疆紫草種子發(fā)芽率更高、酶活力更大、長勢也相對更好，綜合考慮可作為促進(jìn)其種子萌發(fā)的最佳物理處理方法推廣應(yīng)用。