王玉東，趙拯浩，宋小紅，陳旖，王步森，吳詩坡，侯利華

軍事科學院軍事醫(yī)學研究院生物工程研究所，北京100071

腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA 病毒，基因長度為34～43 kb，直徑70～90 nm，相對分子質量約2×108[1]。迄今已記錄了90 多種人腺病毒血清型，并根據其血清學和分子特征分為7 個亞屬（A～G）[2-3]。腺病毒主要引起人呼吸道、胃腸道、眼睛、膀胱等部位感染[4-5]。近年來，隨著免疫學、微生物學、分子生物學等學科的快速發(fā)展和相互交叉滲透，腺病毒在基因和分子治療上的應用越來越廣泛。由于可實現高水平的外源基因表達、安全性高、可快速激發(fā)高效的特異性免疫反應、易于改構、便于大規(guī)模制備等優(yōu)點，重組腺病毒載體己被廣泛用于疫苗研制[6]。目前重組腺病毒載體已用于研發(fā)多種傳染病疫苗，如埃博拉病毒、馬爾堡病毒、人類乳頭瘤病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、狂犬病毒、流感病毒和瘧原蟲疫苗等[7]。與其他重組載體相比，人5 型腺病毒（human adenovirus type 5，HAdv5）載體的優(yōu)勢在于高重組病毒產量、安全性好，以及在廣泛的真核細胞中均能實現較高的外源基因表達水平[8-9]，并且可以誘導強烈的細胞免疫反應[10-11]。

目前，血清中腺病毒抗體的檢測方法大多是檢測中和抗體，主要有2 種方法。一種是細胞病變法，檢測步驟是將滅活血清與腺病毒孵育后感染細胞，用顯微鏡觀察和計數腺病毒介導的細胞病變效應（cytopathic effect，CPE）[12]。這種方法用時較長，一般需要4～8 d，對病變情況的觀察具有一定的主觀性，且靈敏度較低。另一種方法是報告基因法，血清中的中和抗體能夠抑制病毒感染從而降低報告基因在感染細胞中的表達水平，通過檢測報告基因表達被抑制的程度來確定中和抗體水平。常用的報告基因有LacZ、GFP 和螢光素酶基因等[13]。相比于細胞病變法，報告基因法有用時短、操作簡單、評判指標客觀、靈敏度高的優(yōu)點。然而，無論是細胞病變法還是報告基因法，腺病毒中和抗體檢測方法存在耗時較長、血清用量較大、對實驗設備要求較高、實驗成本高等問題。因此，建立一種靈敏、快速、穩(wěn)定的HAdv5 抗體檢測方法具有重要的應用價值。本研究在制備HAdv5-Hexon 蛋白的基礎上，建立了HAdv5 結合抗體檢測的ELISA 法，可用于SPF 級動物模型HAdv5 載體結合抗體滴度檢測，為HAdv5 載體疫苗的小動物模型評價提供了一種簡單快捷的針對載體的抗體檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

293 F 細胞由本室保存；重組腺病毒以及用于檢測方法建立和驗證的小鼠血清為研究室自備；293F 培養(yǎng)基、BCA 法檢測試劑盒和蛋白marker 購自Thermo Scientific 公司；核酸酶和牛血清白蛋白購自Sigma 公司；HAdv5-Hexon 蛋白和HRP 標記的山羊抗小鼠IgG 抗體購自Abcam 公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和青鏈霉素雙抗購自Gibco 公司；螢光素酶檢測底物和細胞裂解液購自Promega公司；SDS-PAGE 蛋白膠購自金斯瑞生物科技有限公司；脫脂奶粉購自BD 公司；化學發(fā)光液購自Millipore 公司；ELISA 顯色液購自Solarbio 公司；Source 30Q 和Sepharose 4FF 層析柱購自GE 公司；TSK-GEL G3000SWXL 柱購自Tosoh 公司；96孔酶標板和96 孔細胞培養(yǎng)板購自Corning 公司。

1.2 HAdv5 抗原的表達與純化

將復制缺陷型HAdv5 以5～10 MOI 感染293F細胞，于36.5℃、5% CO2搖床120 r/min 搖動培養(yǎng)3～5 d，從感染后第2 d 起每天檢測細胞活率，當細胞活率下降至40%以下時收獲細胞培養(yǎng)液。將細胞培養(yǎng)液于-70℃反復凍融3 次，8000 r/min離心30 min，取上清，加入核酸酶至終濃度10 U/mL，37℃孵育1 h，0.45 μm 濾膜抽濾去除雜質。用AKTA Purifier 純化儀對HAdv5 抗原蛋白進行Source 30Q 和Sepharose 4FF 兩步層析純化。對于Source 30Q 層析，層析柱用平衡緩沖液（20 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，pH7.5）平衡后A 泵上樣，上樣結束后再次平衡至UV 基線，5 mL/min，60 min，0～20% B 梯度洗脫，分管收集洗脫峰，最后100% B 直接洗脫（B 液為20 mmol/L Tris、2 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2，pH7.5）。用Sepharose 4FF 對HAdv5 抗原蛋白進一步純化，流動相為0.1 mol/L PBS，流速5 mL/min，限壓0.3 MPa，收集外水體積峰。將收集到的樣品進行SDS-PAGE，合并蛋白條帶一致的樣品，用30 kDa 超濾管濃縮，BCA 法檢測樣品濃度。

1.3 HAdv5 抗原的鑒定

分別采用HPLC、SDS-PAGE 和Western 印跡鑒定純化的HAdv5 抗原，檢測對象為HAdv5 抗原蛋白、復制缺陷型HAdv5 病毒和市售的HAdv5-Hexon。HPLC 色譜柱為TSK-GEL G3000SWXL，流動相為250 mmol/L PBS（Na2HPO454.65 g、NaH2PO415.25 g、NaCl 8.5 g 溶于1 L 去離子水，pH6.8，0.22 μm 濾膜抽濾），室溫，流速0.8 mL/min，進樣體積20 μL，檢測波長214 nm。SDSPAGE 使用12% PAGE 膠，每孔上樣20 μL，170 V 恒壓電泳約1 h，用金斯瑞eBLOT L1 蛋白染色儀對凝膠進行染色和脫色。Western 印跡檢測一抗為HAdv5 免疫小鼠血清。用12% PAGE 膠完成SDS-PAGE 之后，將凝膠上的蛋白質電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（1∶5000 稀釋）室溫孵育2 h，洗膜4 次，二抗（HRP 標記山羊抗小鼠IgG 抗體，1∶20 000 稀釋）溫室孵育1 h，洗膜4 次，用化學發(fā)光液顯色3～5 min，于化學發(fā)光成像系統(tǒng)上成像。

1.4 ELISA 檢測方法的建立

實驗前1 d，將HAdv5-Hexon 蛋白以適當的濃度包被于96 孔酶標板中，4℃過夜（12～24 h）。實驗當天，將酶標板從冰箱取出，用洗液（PBS+0.2%吐溫20）洗板3 次，2% BSA 于37℃封閉1 h；洗板3 次，待測血清以適當的初始稀釋度于酶標板內進行1∶3 梯度稀釋，根據具體情況設定8～12個稀釋度，酶標板于37℃孵育1 h；洗板5 次，每孔加入1∶10 000 稀釋的HRP 標記山羊抗小鼠IgG 抗體100 μL，37℃孵育1 h；洗板5 次，每孔加入TMB 單組分顯色液100 μL，室溫避光顯色8～10 min，每孔加入50 μL 終止液終止反應；于酶標儀上讀取D450nm值。每板設定4～8 個不加血清樣品的空白對照孔，以空白對照孔D450nm平均值的2.1 倍作為Cut-off 值，用GraphPad Prism 軟件計算血清樣品的抗體滴度。在ELISA 檢測方法建立過程中，分別對包被緩沖液、封閉液、HAdv5-Hexon蛋白包被濃度和二抗工作濃度進行最優(yōu)化篩選。

1.5 ELISA 檢測方法的驗證

開展了特異性和重復性驗證，并分析結合抗體滴度與中和抗體滴度的相關性。重復性驗證包括板內重復、板間重復和日間重復，用以驗證檢測方法的穩(wěn)定性。特異性驗證檢測了不同血清樣品在本檢測方法中的反應情況，包括HAdv5陽性樣品、HAdv5 陰性樣品、其他型別腺病毒陽性樣品和其他病毒陽性樣品，用以驗證檢測方法的特異性反應情況。相關性驗證采用螢光素酶法檢測HAdv5 陽性血清的中和抗體滴度[14]，將ELISA 法檢測的結合抗體滴度與對應樣品的中和抗體滴度進行相關性分析。

1.6 HAdv5 結合抗體檢測方法的應用

用本研究建立的HAdv5 結合抗體檢測ELISA法檢測了重組埃博拉病毒病疫苗（Ad5-EBOV）免疫小鼠血清中HAdv5 的IgG 水平。Ad5-EBOV 免疫劑量分別為每只小鼠106和107IFU，血清樣品為首次免疫后0、2、4、6、8、10、12、16 周和加強免疫后2、4、10 周。計算HAdv5 結合抗體滴度并對抗體滴度隨時間變化進行分析。

1.7 統(tǒng)計分析

用GraphPad Prism 軟件進行制圖和數據分析，數據以x±s表示。用Spearman 相關系數分析相關性，相關系數為0.5～1 時具有強相關性。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HAdv5-Hexon 的表達、純化與鑒定

將293F 細胞稀釋至1×106/mL，調整體積至每瓶1 L。HAdv5 以5 MOI 感染293F 細胞，于5%CO2、36.5℃搖床120 r/min 搖動培養(yǎng)約72 h，至細胞活率低于40%，收獲細胞培養(yǎng)液，經Source 30Q和Sepharose 4FF 兩步柱層析，獲得HAdv5 抗原蛋白。Source 30Q 純化峰圖如圖1A，用高鹽進行梯度洗脫，出現2 個洗脫峰。第1 個峰的出峰電導值為31.9 mS/cm，第2 個峰的出峰電導值為40.2 mS/cm。根據以往經驗，第2 個峰為HAdv5 病毒。SDS-PAGE 結果顯示第1 個峰中含有大量蛋白，相對分子質量約為120×103（結果未示），推測其主要成分為腺病毒Hexon 蛋白。用Sepharose 4FF 對第1 個峰的蛋白進行進一步純化，峰圖如圖1B，經純化除去了該峰中存在的少量HAdv5 病毒，獲得更純的HAdv5 抗原蛋白樣品。

鑒于純化獲得的HAdv5 抗原蛋白與腺病毒Hexon 蛋白相對分子質量相當，我們將其與市售的HAdv5-Hexon 進行比較分析，同時以HAdv5 病毒作為對照。HPLC 結果顯示，純化的HAdv5 抗原蛋白與市售的HAdv5-Hexon 具有完全一致的保留時間，兩者保留時間與HAdv5 病毒不同（圖1C）。HAdv5 抗原蛋白對應峰圖主峰面積占96.7%，市售HAdv5-Hexon 對應峰圖主峰面積占98.5%。SDS-PAGE 結果顯示，純化的HAdv5 抗原蛋白、市售的HAdv5-Hexon 和HAdv5 病毒具有相對分子質量大小相同的主帶，為100×103～130×103，不同之處是HAdv5 病毒在相對分子質量約25×103處有一條明顯的條帶（圖1D）。Western 印跡結果顯示純化的HAdv5 抗原蛋白、市售的HAdv5-Hexon 和HAdv5 病毒在相對分子質量為100×103～130×103處均具有特異性條帶（圖1E）。這些結果表明，純化獲得的HAdv5 抗原蛋白其主要成分是HAdv5 的Hexon 蛋白。

圖1 HAdv5 抗原蛋白的純化和鑒定

2.2 HAdv5 結合抗體檢測方法的建立和優(yōu)化

以純化的HAdv5-Hexon 蛋白為抗原，建立HAdv5 結合抗體檢測ELISA 法，并對包被緩沖液和封閉液進行篩選，對抗原包被濃度和二抗工作濃度進行驗證。

分別檢測了碳酸鹽緩沖液（Na2CO31.59 g，NaHCO32.93 g，去離子水定容至1 L，pH9.6）、磷酸鹽緩沖液和Tris-鹽酸緩沖液（Tris Base 24.2 g，NaCl 80 g，濃鹽酸調節(jié)pH 值為7.6，去離子水定容至1 L）作為包被液的檢測效果。結果如表1，以碳酸鹽緩沖液作為包被液時陽性血清樣品與陰性血清樣品的D450nm比值（P/N 值）最大。確定以碳酸鹽緩沖液作為本檢測方法的包被緩沖液。

分別檢測了以1%、2%、5% BSA 和5%脫脂奶粉作為封閉液時的檢測效果，結果如表2，以2%BSA 封閉，其檢測結果的P/N 值最大。確定2%BSA 作為本檢測方法的封閉液。

檢測不同抗原包被濃度（8、4、2、1、0.5、0.25、0.12、0.06 和0.03 μg/mL）對檢測結果的影響，結果如圖2。在不同血清稀釋率情況下，抗原包被濃度＜2 μg/mL 時，D450nm值隨抗原包被濃度的降低而下降；當抗原包被濃度≥2 μg/mL 時，D450nm值達到飽和。確定抗原包被濃度為2 μg/mL。

根據說明書推薦的HRP 標記的山羊抗小鼠IgG 二抗工作濃度范圍，分別驗證了1∶10 000、1∶20 000 和1∶50 000 等3 個工作濃度對檢測結果的影響。結果如表3，在1∶10 000 的工作濃度條件下，檢測結果P/N 值最大，確定1∶10 000 為本檢測HRP 標記山羊抗小鼠IgG 二抗工作濃度。

圖2 抗原包被濃度對檢測結果的影響

2.3 HAdv5 結合抗體檢測方法的驗證

分別對該檢測方法的特異性和重復性進行驗證，并分析由該檢測方法獲得的結合抗體滴度與HAdv5 中和抗體之間的相關性。

重復性驗證結果見表4～6。板內重復性變異系數（CV）為1.6%～9.3%，板間重復性CV 為4.0%～13.2%，日間重復性CV 為2.8%～13.4%。這些結果表明該檢測方法具有良好的重復性。

表1 不同包被緩沖液條件下陽性血清和陰性血清的D450nm值（x±s）

表2 不同封閉液條件下陽性血清和陰性血清的D450nm值（x±s）

表3 不同二抗工作濃度條件下陽性血清和陰性血清的D450nm值（x±s）

表4 板內重復性驗證結果

表5 板間重復性驗證結果

表6 日間重復性驗證結果

特異性驗證分別檢測了HAdv5 陽性小鼠血清樣品、HAdv5 陰性小鼠血清樣品（NC）、人4 型腺病毒（HAdv4）陽性小鼠血清樣品、人7 型腺病毒（HAdv7）陽性小鼠血清樣品和水皰性口炎病毒（VSV）陽性小鼠血清樣品在該檢測方法中的反應情況。檢測結果如圖3A，HAdv5 陽性小鼠血清樣品具有很高的反應水平，而HAdv5 陰性小鼠血清樣品和VSV 陽性小鼠血清樣品則無反應。值得注意的是，HAdv4 陽性小鼠血清樣品和HAdv7 陽性小鼠血清樣品在本檢測中也具有一定的反應水平。結果說明該檢測方法對非腺病毒病原體感染血清樣品具有良好的特異性，而對其他亞型的腺病毒陽性樣品具有一定水平的交叉反應性。

用相同的小鼠血清樣品分別檢測了HAdv5結合抗體滴度和中和抗體滴度，并對兩者進行相關性分析。結果如圖3B，用Spearman 相關性分析，P=0.0056，r=0.7363。結果表明HAdv5 結合抗體與HAdv5 中和抗體檢測結果之間具有良好的相關性。

2.4 HAdv5 結合抗體檢測方法的應用

圖3 HAdv5 結合抗體檢測方法驗證

將本檢測方法應用于Ad5-EBOV 免疫小鼠血清的HAdv5 IgG 抗體水平檢測。Ad5-EBOV 分別以106或107IFU 的免疫劑量肌肉注射免疫BALB/c 小鼠（n=6），16 周后進行等劑量加強免疫。不同時間點小鼠血清HAdv5 IgG 抗體水平如圖4。免疫前所有小鼠血清呈HAdv5 IgG 抗體陰性。初次免疫后107IFU 劑量組血清HAdv5 IgG 抗體水平呈逐漸升高的趨勢，至免疫后10 周達到高峰；106IFU 劑量組血清HAdv5 IgG 抗體水平很低，平均抗體滴度在100 左右。加強免疫后高低劑量組小鼠血清HAdv5 IgG 抗體水平均迅速升高，于加強免疫后2～4 周達到峰值。同時也可以看到，小鼠血清HAdv5 IgG 抗體水平呈現明顯的劑量依賴關系。

3 討論

特異性抗體檢測在臨床診斷、預防接種效果觀察以及傳染病流行病調查中具有重要意義。腺病毒有多種不同血清型，亞型之間病毒表面抗原同源性較高，結合抗體檢測在型別之間的交叉反應性較強，一般情況下采用中和抗體方法檢測針對某亞型腺病毒的血清抗體水平。通常小動物模型上的疫苗免疫學評價所涉及的實驗動物均為SPF 級，腺病毒感染陰性。因此，在SPF 級動物模型上的腺病毒抗體檢測不涉及自然感染腺病毒而導致的交叉反應的問題，可以使用結合抗體檢測方法來檢測某亞型腺病毒的抗體水平，達到快速、高效的要求。在本研究中，我們表達純化獲得了純度大于95%的HAdv5-Hexon 蛋白，并以此為包被抗原建立了操作簡單、快捷、靈敏度高、穩(wěn)定性好的HAdv5 結合抗體檢測ELISA 法。

雖然中和抗體檢測是腺病毒抗體檢測的金標準，但也存在著一些不方便的操作因素。中和抗體檢測需要進行細胞培養(yǎng)，檢測時間長，操作復雜，檢測成本高，對試驗環(huán)境要求高。相比之下，ELISA 檢測結合抗體的檢測時間短，方法簡單，成本較低，可在普通實驗環(huán)境中開展。此外，ELISA 法具有更高的靈敏性。我們在進行結合抗體滴度和中和抗體滴度相關性分析時，所檢測的13 份小鼠血清樣品中，其結合抗體滴度的幾何平均值約為中和抗體滴度幾何平均值的500 倍（結果未示）。這一結果說明結合抗體檢測的靈敏度更高，一些中和抗體檢測結果為陰性的樣品很有可能具有較高的結合抗體水平。

圖4 Ad5-EBOV 免疫后不同時間小鼠血清HAdv5 IgG 抗體水平

關于腺病毒結合抗體檢測，羅思思等利用大腸桿菌表達4 型禽腺病毒Hexon 蛋白，并以此建立了檢測4 型禽腺病毒抗體的ELISA 方法[15]，但HAdv5 結合抗體檢測的相關方法還未見報道。我們表達純化獲得了高純度的HAdv5-Hexon，建立了適用于SPF 級動物血清樣品的HAdv5 抗體檢測ELISA 法。該方法檢測成本較低、操作簡單、快捷、靈敏度高、穩(wěn)定性好，可用于以HAdv5 為載體的病原體疫苗小動物模型免疫學評價，同時也可為其他型別腺病毒結合抗體檢測方法的建立提供思路。