胡榮飛，陳璐瑤，張小妮，吳均堅(jiān)，何文錦，陳由強(qiáng)，薛婷

福建師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院海洋生物醫(yī)藥與制品產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺(tái)；b.南方海洋研究院福建省微藻種質(zhì)改良工程技術(shù)研究中心；福建福州350117

隨著基因編輯工具的發(fā)展，尤其是近年來(lái)CRISPR/Cas9 技術(shù)[1-2]的開(kāi)發(fā)利用，傳統(tǒng)的DNA 提取方法已經(jīng)無(wú)法滿足高通量的目的基因篩選工作。尤其對(duì)于細(xì)胞壁較厚的真核生物和一些非常規(guī)物種來(lái)說(shuō)，提取DNA 需要進(jìn)行大量摸索，不僅耗費(fèi)試劑，更消耗了寶貴的時(shí)間。DNA 的提取無(wú)非是破除細(xì)胞壁使DNA 釋放出來(lái)，與傳統(tǒng)沸水浴、堿裂解、酶解法、反復(fù)凍融、液氮研磨不同的是，在本研究中，我們意圖更快速有效地破碎細(xì)胞壁來(lái)釋放DNA，因此采用研磨儀研磨的機(jī)械方法破碎細(xì)胞壁，使其中的DNA 釋放出來(lái)，以便用于目的基因快速擴(kuò)增和基因組DNA 測(cè)序。研磨儀研磨法影響細(xì)胞破碎程度的因素主要有2 個(gè)，即研磨頻率和研磨時(shí)間。我們探究了研磨頻率和研磨時(shí)間的不同組合對(duì)DNA 提取效果的影響，建立了更好的DNA 提取方法。同時(shí)，用茂源鏈霉菌[3-5]、三角褐指藻[6-7]、釀酒酵母[8-9]驗(yàn)證了該方法在不同物種中的可行性，以期建立一種全物種通用的快速提取基因組DNA 用于PCR 的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

茂源鏈霉菌（Streptomyces mobaraensis）11019、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y1H（Leu2-）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）CCAP 1055/1 均為本實(shí)驗(yàn)室保存；Biowest Regular Agarose G-10 購(gòu)自上海生工公司；1.1× T3 Super PCR Mix 購(gòu)自擎科生物技術(shù)有限公司；裂解緩沖液（1 mmol/L EDTA 2 mL，50 mmol/L 磷酸緩沖液250 mL，5% 甘油50 mL，加ddH2O 定容到1 L）；1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）。

研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；5424R 4℃離心機(jī)（Eppendorf 公司）；PCR 儀、梯度PCR 儀（Applied Biosystems 公司）；DYY-6C 電泳儀（北京六一儀器廠）；ChemiDOCTMMP 凝膠成像儀（Bio-Rad 公司）。

1.2 引物與PCR 反應(yīng)條件

引物見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：98℃2 min 預(yù)變性；98℃ 10 s 變性，Tm 60～65℃ 10 s 退火，72℃ 5～15 s/kb 延伸，32 個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用0.9%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 用于PCR 的基因組快速提取

取適量樣品于2 mL EP 管中，加入2 顆滅菌的4 mm 鋼珠、100 μL 裂解緩沖液，放入研磨儀中研磨，研磨結(jié)束后將樣品放入70℃烘箱或水浴5 min，加入20 μL 1 mol/L 的Tris-HCl，上下顛倒幾次使混勻，13 000 r/min 離心3 min，取上清液直接作為模板用于PCR。若對(duì)PCR 的模板要求較高，也可用酚氯仿抽提后再進(jìn)行PCR 實(shí)驗(yàn)。

1.4 全基因組的快速提取

在超凈工作臺(tái)中取適量樣品放入液氮中冷凍，同時(shí)將液氮研磨管和研磨球一同放入液氮中快速冷凍，藥匙和2 mL EP 管也一同放入液氮中預(yù)冷備用。帶上防凍手套，用鑷子將樣品和研磨球放入液氮研磨管中旋緊，放入研磨儀中研磨。研磨結(jié)束后，用液氮預(yù)冷的藥匙取適量樣品粉末于2 mL EP 管中，加入400 μL 裂解緩沖液，于70℃烘箱或水浴5～10 min。加入80 μL 1 mol/L的Tris-HCl，上下顛倒幾次使其混勻。加入300 μL DNA 提取液（酚∶氯仿∶異戊醇為25∶24∶1），渦旋2 次，13 000 r/min 離心5 min。將上層水相吸到1.5 mL EP 管中，不要吸到下層有機(jī)相，大約吸300 μL 左右的水相。加入2～2.5 倍體積的無(wú)水乙醇或95%乙醇（預(yù)先在-20℃預(yù)冷沉淀效果更好），-20℃沉淀30 min。4℃，13 000 r/min 離心5 min 沉淀DNA，棄上清，沉淀即為DNA。用75%乙醇（-20℃預(yù)冷）清洗離心后的DNA，無(wú)需將DNA 混起，上下顛倒幾次，僅清洗表面即可。4℃下13 000 r/min 離心1～2 min，棄上清后在超凈工作臺(tái)中吹干或室溫?fù)]發(fā)殘留的乙醇，用100 μL ddH2O 溶解。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

1.5 提取條件的優(yōu)化

DNA 提取效果受研磨頻率和時(shí)間的影響。為確定快速提取DNA 的最優(yōu)條件，設(shè)計(jì)了不同的研磨頻率和研磨時(shí)間組合，見(jiàn)表2。

表2 不同研磨時(shí)間和頻率的組合

2 結(jié)果

2.1 最佳DNA 提取方法的確定

用研磨儀破碎細(xì)胞時(shí)，如果頻率過(guò)低，研磨力度不夠，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法破碎，DNA 無(wú)法釋放出來(lái)；而頻率過(guò)高，則研磨力度過(guò)大，會(huì)將DNA 打碎，同時(shí)還會(huì)縮短研磨儀使用壽命。研磨時(shí)間過(guò)短，研磨不夠充分，DNA 也無(wú)法釋放出來(lái)；研磨時(shí)間過(guò)久也會(huì)打碎DNA，還會(huì)縮短研磨儀使用壽命。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出（圖1），當(dāng)研磨頻率為40、50 Hz 時(shí)，研磨時(shí)間從2 min 增加到5 min 時(shí)，提取出來(lái)的DNA 在0.9%的瓊脂糖凝膠上無(wú)法看到任何條帶，這是由于研磨頻率太低，無(wú)法破碎細(xì)胞，導(dǎo)致DNA 無(wú)法釋放或釋放量極少。將這8個(gè)不同條件提取的無(wú)法看到條帶的DNA 進(jìn)行PCR，卻發(fā)現(xiàn)可以得到SSTI 基因擴(kuò)增條帶，說(shuō)明該方法即使在很低的研磨頻率下，提取到的少量DNA 依然可以用于PCR 實(shí)驗(yàn)。當(dāng)研磨頻率達(dá)到60、70 Hz 時(shí)，研磨時(shí)間無(wú)論是2、3、4 還是5 min，提取出來(lái)的DNA 在0.9%的瓊脂糖凝膠上均可看到彌散的拖尾條帶，在相同研磨頻率下，隨著研磨時(shí)間的增加，DNA 條帶越亮；在相同的研磨時(shí)間下，隨著研磨頻率的增大，DNA 條帶也越亮。同樣利用這8 個(gè)條件下提取的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，亦都能獲得SSTI 基因擴(kuò)增條帶。

由此證明利用研磨儀破碎細(xì)胞提取DNA 用于PCR 完全可行，為了降低儀器的損耗和提高PCR 效果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取的研磨頻率為60 Hz,研磨時(shí)間為2 min。

圖1 不同研磨頻率和時(shí)間下提取的DNA 電泳圖和PCR 電泳圖

2.2 全基因組的提取

為了滿足基因組測(cè)序以及重測(cè)序的要求，提取的基因組必須片段完整、純度高。因此，本實(shí)驗(yàn)利用研磨儀結(jié)合液氮研磨法來(lái)提取茂源鏈霉菌的完整基因組DNA。機(jī)械研磨省去了手工研磨的費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且研磨更加充分，液氮冷凍過(guò)的樣品很容易磨碎，因而實(shí)驗(yàn)中只選取研磨頻率作為變量，選取的頻率為40、50、60、70 Hz，研磨時(shí)間固定為2 min。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）可以看出，當(dāng)研磨頻率為40 Hz 時(shí)就足以磨碎細(xì)胞壁，釋放出DNA，隨著研磨頻率的增大反而會(huì)打碎DNA，出現(xiàn)拖尾彌散甚至較小的DNA 條帶。為了提高DNA 的提取質(zhì)量，降低儀器損耗，綜合考慮，用研磨儀液氮研磨樣品提取全基因組DNA 時(shí)，采用的頻率為40 Hz，研磨時(shí)間為2 min。

2.3 用于PCR 的基因組快速提取方法在不同物種中的驗(yàn)證

2.3.1 在茂源鏈霉菌中的驗(yàn)證 在用研磨儀快速破碎茂源鏈霉菌細(xì)胞后，我們選取了2 個(gè)基因片段（447 bp 的SSTI 基因和941 bp 的SSTI 基因加上游片段）對(duì)粗提的基因組進(jìn)行PCR 實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證該方法在霉菌中的可行性，結(jié)果選取的2 段目的基因均能從快速提取的茂源鏈霉菌基因組中擴(kuò)增出來(lái)（圖3）。

圖2 茂源鏈霉菌全基因組DNA 提取的電泳結(jié)果

2.3.2 在三角褐指藻中的驗(yàn)證 該方法可以在茂源鏈霉菌中成功進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，我們又將該方法應(yīng)用于低等植物進(jìn)行PCR 以驗(yàn)證該方法的可行性。在用研磨儀破碎三角褐指藻粗提取基因組DNA 后，我們選取2 個(gè)目的基因片段（Δ5-fatty acid elongase 基因長(zhǎng)936 bp，acetyl-CoA acyltransferase 基因長(zhǎng)1374 bp）對(duì)粗提的基因組進(jìn)行PCR 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果2 個(gè)目的基因片段均能從快速提取的三角褐指藻基因組中擴(kuò)增出來(lái)（圖4）。

2.3.3 在釀酒酵母中的驗(yàn)證 我們將該方法進(jìn)一步應(yīng)用到酵母中。選取釀酒酵母Y1H 作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用研磨儀破碎細(xì)胞粗提基因組后，同樣選取2 個(gè)目的片段（CYC1 基因長(zhǎng)約300 bp，GPD1 基因加上下游共1577 bp）對(duì)粗提的基因組進(jìn)行PCR，以驗(yàn)證該方法在酵母中的可行性，結(jié)果見(jiàn)圖5，選取的2 個(gè)目的基因均能從粗提的基因組中擴(kuò)增出目的片段。

2.4 用快速提取的基因組擴(kuò)增較大的目的片段

基于快速提取的基因組在多個(gè)物種中實(shí)現(xiàn)目的基因擴(kuò)增后，我們嘗試用該方法提取的基因組進(jìn)行較大片段的擴(kuò)增。選取茂源鏈霉菌中SSTI 基因上下游共4023 bp 的一段序列作為擴(kuò)增的目的基因，結(jié)果見(jiàn)圖6，快速提取的基因組雖然被打碎，但對(duì)于較大片段的擴(kuò)增仍是可行的。

圖3 茂源鏈霉菌基因組快速提取PCR 驗(yàn)證結(jié)果

圖4 三角褐指藻基因組快速提取PCR 驗(yàn)證結(jié)果

圖5 釀酒酵母Y1H 基因組快速提取PCR 驗(yàn)證結(jié)果

圖6 茂源鏈霉菌中較大目的基因片段PCR 驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，提取樣本DNA 是實(shí)驗(yàn)的首要任務(wù)，目前已有很多成熟的方法[10-11]。DNA 提取的難點(diǎn)又在于怎樣更有效率地破除細(xì)胞壁，釋放里面的DNA，比較常用的方法有液氮研磨、酶解法、反復(fù)凍融、沸水浴、玻璃珠研磨、各種成品試劑等，但這些方法均須花費(fèi)大量的時(shí)間、人力和物力，而且很難適用于多個(gè)不同樣品的一次性提取。在本實(shí)驗(yàn)中，我們大膽嘗試將機(jī)械研磨應(yīng)用于DNA 提取，對(duì)于僅用于PCR 的DNA提取，利用研磨儀可以同時(shí)提取64 個(gè)樣品，研磨時(shí)間2 min，加上水浴5 min、離心3 min，整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程下來(lái)只需10 min，即可輕松得到PCR 模板，而且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)需使用有機(jī)溶劑，大大提高了DNA 的提取效率，同時(shí)也節(jié)約了大量時(shí)間，不使用有機(jī)溶劑更加環(huán)保健康，符合發(fā)展理念。對(duì)于需要測(cè)序的DNA 樣本，采用研磨儀液氮研磨，可在2 min 內(nèi)磨好4 個(gè)樣品，相比于手工液氮研磨，不僅節(jié)約了時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)效率，而且研磨更加充分，同時(shí)也減少了因在研缽里研磨而造成的樣品損耗。在茂源鏈霉菌SSTI 基因敲除過(guò)程中，培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出無(wú)數(shù)轉(zhuǎn)化子，需要驗(yàn)證目的基因是否被敲除以及敲除效率有多少。由于茂源鏈霉菌細(xì)胞壁較厚且結(jié)構(gòu)緊密，沸水浴、堿裂解、反復(fù)凍融均無(wú)法達(dá)到快速提取基因組DNA 進(jìn)行PCR 的目的，面對(duì)幾百個(gè)轉(zhuǎn)化子，如果用傳統(tǒng)的手工液氮研磨，再加上PCR 驗(yàn)證，至少需要花費(fèi)1 個(gè)月的時(shí)間，但采用研磨儀快速提取基因組進(jìn)行PCR，僅在1 周內(nèi)就完成了這個(gè)巨大的任務(wù)。

目前快速PCR 應(yīng)用于山藥、人參等鑒別真?zhèn)螘r(shí)[12-13]，仍采用傳統(tǒng)方法提取總基因組后建立快速PCR，需要花費(fèi)大量時(shí)間，與本實(shí)驗(yàn)方法相比仍是繁瑣的，且針對(duì)單一物種，未在其他物種中驗(yàn)證。王學(xué)仁等[14]建立的改進(jìn)的DNA 提取方法，雖然可用于植物和真菌的DNA 提取，但仍只是在傳統(tǒng)方法上進(jìn)行改進(jìn)，所花費(fèi)的時(shí)間精力相比于本實(shí)驗(yàn)方法仍較多。陳吉良等[15]建立的高效快速提取病原真菌DNA 用于PCR 的方法，相對(duì)于傳統(tǒng)方法確實(shí)簡(jiǎn)便很多，但還是需要手工液氮研磨，相比較本實(shí)驗(yàn)方法的機(jī)械研磨無(wú)需手工、無(wú)需液氮，仍顯繁瑣。柴海云等[16]用自己配制的DNA 快速提取液可以直接裂解真菌，可用其作為PCR 模板，但有些細(xì)胞壁較厚的真菌無(wú)法用該方法提取出DNA，而本實(shí)驗(yàn)采用研磨儀破碎細(xì)胞則不存在類似問(wèn)題，只要研磨頻率夠高，再厚的細(xì)胞都可以破碎。孫立夫等[17]采用手電鉆在冰上研磨細(xì)胞，已達(dá)到破碎細(xì)胞快速提取DNA 的目的，但相比于本實(shí)驗(yàn)中采用研磨儀研磨仍是效率低，不安全的。L?oke 等[18]也在酵母中建立了快速提取基因組DNA 用于PCR 的方法，方法足夠簡(jiǎn)便，利用醋酸鋰和SDS 進(jìn)行裂解細(xì)胞，水浴離心，無(wú)水乙醇抽提，但該方法僅在酵母中使用，很難適用于細(xì)胞壁較厚的非常規(guī)物種。

我們用研磨儀對(duì)茂源鏈霉菌進(jìn)行研磨破碎，不僅建立了快速提取DNA 用于PCR 的方法，同時(shí)也建立了快速提取完整基因組DNA 的方法。以研磨儀快速提取的基因組DNA 為模板在茂源鏈霉菌中擴(kuò)增目的基因取得成功后，又將該方法應(yīng)用于三角褐指藻和釀酒酵母，并對(duì)同一物種中的2 個(gè)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，均取得成功。最后，利用快速提取的茂源鏈霉菌基因組DNA 對(duì)4023 bp 的大片段目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，也成功擴(kuò)增出目的條帶，這充分證明了利用研磨儀研磨提取DNA 進(jìn)行PCR 的可行性。由于是機(jī)械研磨，所以不必考慮細(xì)胞壁的組成、厚度等問(wèn)題，只要頻率夠高，足以磨碎所有的細(xì)胞，因此該方法可以推廣到更多的物種，為快速PCR 和提取完整基因組等試驗(yàn)節(jié)約大量的人力物力。