董 婧 李婷婷 邱志霞 陸 燕 李文艷

1.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院藥劑科，上海 200135；2.中國藥科大學藥學院，江蘇南京 210009；3.中國藥科大學中藥學院，江蘇南京 210009

比阿培南屬于碳青霉烯類抗菌藥物，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、厭氧菌及多重耐藥菌均有效，主要用于中、重度下呼吸道、泌尿道和腹腔等部位感染的治療[1]。甲氨蝶呤通過抑制二氫葉酸還原酶，阻止癌細胞分裂，用于治療急性白血病和乳腺癌等[2]。低劑量甲氨蝶呤也用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎和銀屑病等自身免疫性疾病[3]。呋塞米廣泛應用于治療充血性心力衰竭和水腫[4]，是住院老年患者使用頻率較高的藥物之一[5]。由于比阿培南和甲氨蝶呤、呋塞米在臨床上存在聯(lián)合用藥，而目前還沒有甲氨蝶呤和呋塞米對比阿培南藥代動力學影響的研究報道。因此，本研究通過考察比阿培南和甲氨蝶呤、呋塞米聯(lián)用后在大鼠體內(nèi)的藥代動力學特征，發(fā)現(xiàn)可能存在的藥物相互作用，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

比阿培南（江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司，批號：190111125）；甲氨蝶呤（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：16031416）；呋塞米（純度98%，國藥集團化學試劑有限公司）；內(nèi)標對氨基苯甲酸（PABA，純度99.5%，國藥集團化學試劑有限公司）；穩(wěn)定劑3-（N-嗎啡啉）-丙磺酸（MOPS，純度99%，美國Sigma 公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀、Waters2998二極管陣列檢測器（美國Waters 公司）；XW-80A 旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Thermo ST16R 高速冷凍離心機（美國賽默飛世爾科技有限公司）；XS205標準型分析天平（千分之一，瑞士Mettler Toledoo 公司）。

1.3 實驗動物

健康雄性SD 大鼠15只，體重260～280 g，7～8周齡，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（滬）2013-0016。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SinoChrom ODS-AP（5 μm，4.6 mm×150 mm，大連依利特分析儀器有限公司）；流動相：乙腈-水（3∶97，含0.1 mol/L 醋酸鈉，pH 4.5），采用等度洗脫方式；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：30 μL；紫外檢測波長：300 nm。

2.2 給藥方案與樣品采集

應用隨機數(shù)字表將大鼠隨機分為比阿培南單藥組（A 組）、比阿培南和甲氨蝶呤聯(lián)合給藥組（B 組）、比阿培南和呋塞米聯(lián)合給藥組（C 組），每組5只。A 組尾靜脈注射30 mg/kg 比阿培南，B 組尾靜脈注射30 mg/kg 比阿培南和3 mg/kg 甲氨蝶呤，C 組尾靜脈注射30 mg/kg 比阿培南和30 mg/kg 呋塞米。將大鼠飼養(yǎng)于代謝籠內(nèi)，于給藥前及給藥后0.03、0.08、0.17、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8 h 眼底靜脈叢取血約0.2 mL 置于肝素鈉抗凝的采血管中，4℃下12 000 r/min（離心半徑16.1 cm）離心5 min 后取上層血漿；于給藥前及給藥后0.5、1、2、4、6、8、12、24 h 收集尿液，血漿和尿液加入等體積1 mol/L MOPS 穩(wěn)定劑后，置-80℃冰箱冷凍保存待測。

2.3 樣品處理方法

精密吸取血漿樣品200 μL，加入16 μL（200 mg/L）PABA 溶液和200 μL 30%飽和硫酸銨溶液，渦旋振蕩2 min，12 000 r/min 離心10 min，（離心半徑16.1 cm）取上清液30 μL 進樣測定。大鼠尿液樣品用流動相稀釋5倍后吸取200 μL，其余處理步驟同血漿樣品。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性 比阿培南和內(nèi)標PABA 在本色譜系統(tǒng)中的保留時間分別為3.5、6.4 min，大鼠空白血漿和尿液中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾比阿培南的測定，色譜圖見圖1～2。

圖1 血漿樣品中比阿培南和內(nèi)標PABA 高效液相色譜圖

2.4.2 標準曲線及最低定量下限 取空白大鼠血漿或尿液90 μL，加入比阿培南工作液10 μL，使血漿中藥物濃度分別為0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 mg/L，使尿液中 藥物濃度分別為0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 mg/L，混勻后加入100 μL 1 mol/L MOPS 溶液，再按“2.3”項下操作。另按上述方法配制濃度為0.5、5.0、40 mg/L 的比阿培南血漿質(zhì)控樣品溶液和濃度為1、10、100 mg/L 的尿液質(zhì)控樣品溶液。以測得的比阿培南和內(nèi)標峰面積比為縱坐標，比阿培南濃度為橫坐標，進行權(quán)重擬合后得到血漿中比阿培南回歸方程為Y=0.124X+0.009，線性范圍為0.2～100 mg/L，最低定量下限0.2 mg/L；尿液中比阿培南回歸方程為Y=0.0166X+0.014，線性范圍為0.5～200 mg/L，最低定量下限為0.5 mg/L。

圖2 尿液樣品中比阿培南和內(nèi)標PABA 高效液相色譜圖

2.4.3 提取回收率及精密度 以質(zhì)控樣品中比阿培南測得的峰面積與相同濃度標準品溶液直接進樣測得的峰面積之比，計算提取回收率。比阿培南提取回收率在82.2%～85.6%，日內(nèi)和日間精密度均在10%以內(nèi)，符合生物樣品分析要求。

2.4.4 穩(wěn)定性 質(zhì)控樣品在20℃放置4 h，在-80℃放置30 d，在-80℃放置24 h 后反復凍融處理3次，考察穩(wěn)定性。結(jié)果提示，比阿培南血漿和尿液樣品在各條件下均穩(wěn)定。

2.5 統(tǒng)計學方法

比阿培南主要藥代動力學參數(shù)消除半衰期（t1/2）、血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0-∞）、清除率（CL）和腎清除率（CLr）等藥代動力學參數(shù)采用WinNonlin 6.3非房室模型方法計算。采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)（最小值，最大值）表示。對AUC0-∞（AUC 經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后）進行獨立樣本t 檢驗，對MRT 和t1/2進行Wilcoxon 符號秩和檢驗。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.6 大鼠體內(nèi)藥代動力學研究

與A 組比較，B 組AUC0-∞降低，CL、CLr增加，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）；與A 組比較，C 組各藥代動力學參數(shù)沒有顯著變化（P ＞0.05）。見表1。大鼠聯(lián)合給予比阿培南和甲氨蝶呤、呋塞米后的AUC0-∞見圖3。

表1 大鼠尾靜脈注射給藥后比阿培南藥代動力學參數(shù)（，n=5）

表1 大鼠尾靜脈注射給藥后比阿培南藥代動力學參數(shù)（，n=5）

注：與A 組比較，**P ＜0.01。t1/2：消除半衰期；MRT：平均駐留時間；AUC0-∞：血藥濃度-時間曲線下面積；V：表觀分布容積；CL：清除率；CLr：腎清除率

圖3 大鼠尾靜脈注射給予比阿培南和甲氨蝶呤、呋塞米后的比阿培南平均血藥濃度-時間曲線（n=5）

3 討論

臨床上抗菌藥物與其他藥物的聯(lián)合應用越來越普遍，聯(lián)合用藥會產(chǎn)生一定的藥物相互作用，可能會導致抗菌藥物治療失敗、毒副作用發(fā)生或誘導細菌耐藥[6-8]，藥代動力學相互作用可發(fā)生在藥物吸收、分布、代謝和排泄各階段[9-11]。本研究首次考察了甲氨蝶呤和呋塞米對比阿培南在大鼠體內(nèi)藥代動力學過程的影響，揭示可能存在的藥物相互作用。文獻報道，哌拉西林/他唑巴坦[12]、羥氨芐青霉素[13]、萬古霉素[14]與甲氨蝶呤聯(lián)用，會使甲氨蝶呤在體內(nèi)消除減慢，血藥濃度增加。而頭孢曲松、頭孢他啶[15]、環(huán)丙沙星[16]與甲氨蝶呤不存在藥代動力學相互作用，但也有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星會引起甲氨蝶呤消除減慢[17-18]。呋塞米與頭孢噻啶、頭孢唑啉、頭孢地爾聯(lián)用時，會顯著減少頭孢噻啶和頭孢唑啉的腎清除[19]，但不影響頭孢地爾體內(nèi)的藥代動力學過程[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，甲氨蝶呤使比阿培南在大鼠體內(nèi)的AUC0-∞降低，CL 和CLr增加差異均有高度統(tǒng)計學意義（P <0.01）。呋塞米使比阿培南AUC0-∞增加，CL 和CLr減少，但差異無統(tǒng)計學意義（P >0.05）。提示甲氨蝶呤和比阿培南存在藥代動力學的相互作用，臨床上兩藥合用時需進行劑量調(diào)整，而呋塞米和比阿培南不存在明顯的藥代動力學相互作用，臨床上兩藥合用時無需進行劑量調(diào)整。比阿培南給藥后約60%以原型經(jīng)腎臟排泄，甲氨蝶呤90%以原形經(jīng)腎臟排泄。因此，可以推測比阿培南與甲氨蝶呤的藥代動力學相互作用靶點可能是在腎臟，今后我們將進一步闡明兩藥相互作用的機制。