余光輝,向宇,宮雅昕,李剛

(中南民族大學 生命科學學院，南方少數民族地區(qū)生物資源保護與綜合利用聯合工程中心，武漢 430074)

根毛是根部表皮細胞分化形成的一種單細胞管狀物, 根毛可以增加根的表面積,有助于植物對水分和營養(yǎng)物質的吸收以及植物在土壤中的固定[1].

γ-氨基丁酸(GABA)是一種含有四碳的非蛋白氨基酸[8],研究發(fā)現植物在脅迫的條件下，GABA可以作為一種代謝物積累,并抑制ROS的產生[9].此外GABA還可以作為一種信號分子誘導氣孔的關閉[10].

為研究GABA在擬南芥根毛發(fā)育中的調控作用，本研究以擬南芥特異性表達的GABA合成酶基因突變體(gad1)的根為材料,通過外源施加GABA，對根部活性氧進行染色和對活性氧合成及清除相關基因表達水平的分析,探討GABA和根毛發(fā)育調控的潛在機制.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

擬南芥(Arabidopsisthaliana)包括野生型Columbia(Col)和內源性GABA合成突變體(gad1).

將擬南芥的種子用氯氣消毒2～3 h. 在超凈臺中,用無菌牙簽將擬南芥種子分別接種于1/2MS和含有不同濃度GABA的1/2MS(pH=5.8)固體培養(yǎng)基上,用膠帶對方形塑料培養(yǎng)皿(10 cm×10 cm)進行密封,放于4 ℃冰箱，春化2 d. 然后放入溫室(16 h/8 h光/暗循環(huán),溫度22 ℃)垂直培養(yǎng)8 d.

1.2 擬南芥根部根毛形態(tài)及長度的測量

將擬南芥幼苗(8 d)培養(yǎng)皿置于體視顯微鏡(V8,德國蔡司)下,對距根尖前8 mm區(qū)域上的根毛進行拍照. 用軟件SPOT Advanced對根毛長度進行測量(每條根上選取25～30個完全伸長的根毛的進行統(tǒng)計). 每個株系統(tǒng)計20株以上的幼苗.

1.3 活性氧(ROS)染色觀察

植物體內活性氧(ROS)的水平可以通過H2DCFDA(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate)熒光探針進行檢測[11]. H2DCFDA進入細胞后能被活性氧基團分解為DCF而產生熒光,其熒光強度與活性氧濃度成正比.

將生長8 d的擬南芥幼苗放入含有10 μmol·L-1H2DCFDA染液的溶液中,避光孵育1 h. 隨后用蒸餾水沖洗3次,將染好的幼苗制片后放入IX73熒光顯微鏡(日本奧林巴斯 )的載物臺上,在相同的曝光時間和背景下觀察熒光并拍照.

1.4 超氧陰離子染色

將8 d齡的擬南芥幼苗置于含有2 mmol·L-1NBT(氮藍四唑)的磷酸鹽緩沖液(pH=6.1)中[12]. 避光染色15 min,用蒸餾水沖洗,將染好的幼苗制片后放入IX73熒光顯微鏡下觀察并拍照.

1.5 實時熒光定量PCR分析

采用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒(康寧公司)提取擬南芥根部總RNA,利用反轉錄試劑盒(Goldenstartm RT6)用于cDNA的合成. 實時熒光定量PCR采用2×T5 Fast qRT-PCR Mix (SYBR Green Ⅰ)試劑盒(北京擎科),操作按照說明書進行,引物參見表1. 用MyGo Pro 定量PCR儀 (英國IT-IS公司)進行實時熒光定量PCR,反應條件為：95 ℃預變性1 min,95 ℃變性10 s,53 ℃退火15 s,72 ℃延伸10～15 s,40次循環(huán). 基因相對表達水平用2-ΔΔCq進行計算分析.

表1 本研究所用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.6 數據統(tǒng)計分析

根毛長度統(tǒng)計每組實驗單獨重復3次,每次統(tǒng)計9棵擬南芥幼苗. 利用SPSS 23軟件對統(tǒng)計的根毛長度及qRT-PCR結果進行顯著性分析(t-檢驗),用Image J軟件對熒光和染色強度進行量化.

2 結果與分析

2.1 gad1突變體根毛長度高于野生型

在培養(yǎng)基(1/2MS)上垂直生長8 d后,測量野生型和gad1突變體根毛的長度. 野生型根毛平均長度為490 μm,gad1突變體根毛平均長度為700 μm, 是野生型的1.5倍, 顯著大于野生型(P<0.05) (圖1A～C). 說明GABA合成缺陷促進了擬南芥根毛的頂端生長,導致其根毛的長度增加.

A)8 d齡的野生型擬南芥初生根和根毛;B)8 d齡的gad1突變體初生根和根毛;Bar=1 mm;C)根毛長度的測量，各柱形圖上不同小寫字母標識表示數據間差異顯著(P<0.05)圖1 野生型和gad1突變體的根毛長度Fig.1 Root hair length of wild type and gad1 mutants

2.2 外源性GABA抑制野生型根毛伸長

用不同濃度的GABA處理野生型擬南芥,在生長8 d后在體視顯微鏡下觀察根毛生長情況. 結果表明, 不同濃度的外源GABA (1、10、100和1000 μmmol·L-1)的添加均顯著抑制了野生型擬南芥根毛的生長，處理組長度明顯低于對照組,分別比對照組降低了44.8%、53.9%、57.1%、73%，抑制呈現明顯的劑量依賴效應(P<0.05)(圖2，A～F).

A)、B)、C)、D)和E)分別為0、1、10、100和1000 μmol·L-1 GABA處理后生長8 d的野生型擬南芥,Bar =1 mm; F) 不同濃度GABA處理下野生型擬南芥根毛長度的測量，各柱形圖上不同小寫字母標識表示數據間差異顯著(P<0.05)圖2 不同濃度GABA處理下野生型擬南芥根毛的長度Fig.2 Length of root hair of wild type Arabidopsis thaliana treated with different concentrations of GABA

2.3 外源 GABA一定程度上抑制gad1突變體的根毛生長

為進一步證實根毛生長和GABA代謝的關系,用外源GABA處理gad1突變體.結果表明,10 μmol·L-1GABA處理情況下,gad1突變體中快速生長的根毛生長得到顯著抑制, 其長度也短于野生型(P<0.05)(圖3，A～E). 以上結果說明GABA代謝參與了擬南芥根毛生長的調節(jié).

2.4 gad1突變體根部ROS的水平高于野生型

活性氧(ROS)是調控根毛發(fā)育的重要信號[2].為證實gad1根毛生長和ROS的關系，用H2DCFDA探針來檢測ROS的水平.在培養(yǎng)8 d的野生型擬南芥和gad1突變體進行H2DCFDA標記后,在根尖和根毛區(qū)都觀察到ROS的熒光分布,但gad1突變體中ROS的熒光信號強度明顯高于野生型(P<0.05) (圖4A～D;E,F).上述結果表明,ROS介導了gad1突變體根毛伸長的過程.

2.5 gad1突變體根部超氧陰離子水平高于野生型

A) 1/2MS培養(yǎng)基上野生型生長的根;B) 1/2MS培養(yǎng)基上gad1突變體生長的根; C)添加10 μmol ·L-1 GABA的生長的野生型的根; D)添加10 μmol ·L-1 GABA的生長的gad1突變體的根,Bar =1 mm; E) 根毛長度的統(tǒng)計，各柱形圖上不同小寫字母標識表示數據間差異顯著(P<0.05)圖3 10 μmol·L-1GABA處理下gad1突變體根毛的長度Fig.3 Length of root hair of gad1 mutant treated with 10 μmol ·L-1 GABA

A)、C)分別代表野生型和gad1突變體擬南芥根尖的ROS染色結果;B)、D)分別代表野生型和gad1突變體根毛區(qū)的ROS染色結果， Bar =50 μm;E)、F)根尖和根毛尖端平均熒光強度的量化統(tǒng)計，各柱形圖上不同小寫字母標識表示數據間差異顯著(P<0.05)圖4 根尖和根毛區(qū)ROS的分布Fig.4 Distribution of ROS in root tip and root hair region

A)、B)分別為野生型和gad1突變體根尖NBT染色的結果;C)、D)分別為野生型和gad1突變體根毛區(qū)域NBT染色的結果， Bar=100 μm,箭頭指向根毛尖端; E)根毛尖端NBT染色信號的量化統(tǒng)計，各柱形圖上不同小寫字母標識表示數據間差異顯著(P<0.05)圖5 根部的NBT染色Fig.5 NBT staining for in root

2.6 外源GABA抑制根毛尖端ROS的產生

A)、B)分別為根毛尖端ROS熒光染色和NBT染色信號的量化統(tǒng)計，各柱形圖上不同小寫字母標識表示數據間差異顯著(P<0.05)圖6 外源GABA對根毛尖端ROS熒光染色和NBT染色的抑制效應Fig.6 Inhibition of exogenous GABA on the staining of ROS fluorescence and NBT staining for

2.7 根部ROS合成及清除相關基因的表達變化

各柱形圖上不同小寫字母標識表示數據間差異顯著(P<0.05)圖7 野生型和gad1突變體根部合成及清除ROS基因的表達變化Fig.7 Gene expression involving in synthesis and scavenging ofROS in the roots of wild type and gad1 mutants

2.8 外源GABA誘導根部ROS清除基因的表達

各柱形圖上不同小寫字母標識表示數據間的差異顯著(P<0.05)圖8 外源GABA處理對ROS清除基因表達的影響Fig.8 Effect of exogenous GABA treatment on the expression of ROS scavenging genes

3 討論

根毛是植物吸收土壤水分和營養(yǎng)的關鍵器官,根毛的發(fā)育直接關系到植物吸收養(yǎng)分的能力. 研究表明,γ-氨基丁酸(GABA)在植物細胞中產生，具有調控生長和抗逆性的作用[13].本文利用GABA合成突變體gad1及外源性GABA的添加證明了GABA在擬南芥根毛生長中的調控作用.

脅迫條件下, GABA與ROS有著密切的聯系.脅迫導致線粒體中的ROS水平升高從而激活GABA的產生,大量積累的GABA又會對ROS進行清除[15]. 研究表明,在萵苣幼苗中,外源GABA的應用可以降低ROS的產生,使自身的耐鹽性增強[16]. 在大麥幼苗中,鋁和質子的脅迫會造成大麥的氧化損傷,外源GABA的添加可以減輕這種損傷[17].所以在脅迫的條件下, GABA確實可以作為一種抑制ROS產生的調節(jié)器發(fā)揮功能;前期的研究證實了外源GABA對ROS具有抑制和清除效應[9,18].