閻春蘭，唐豪，陳榮清，劉虹杉，吳麗娜

(中南民族大學 生命科學學院 微生物資源與利用湖北省工程技術研究中心， 武漢 430074)

人類發(fā)現抗生素并對其大規(guī)模生產使用是人類醫(yī)學史上的偉大進步，自抗生素投入使用至今挽救了數以億計的生命.在20世紀第一代青霉素投入使用的同時，就出現了對青霉素具有抗性的細菌.事實上，耐藥性的產生是微生物自然進化的結果，然而抗生素的大量使用、濫用，導致這一進程大大加快[1].一種新的抗生素從臨床到使用需要5～10年，而細菌對其產生耐藥性僅需2年[2]. 胡付品等[3]對國內主要地區(qū)30所教學醫(yī)院臨床分離的153059株細菌進行抗菌藥物敏感性試驗，結果顯示檢測細菌中除革蘭氏陽性菌對萬古霉素、革蘭氏陰性菌對碳青霉烯類抗菌藥物比較敏感外，其余細菌均對現有抗生素具有不同程度的耐藥性，并且臨床分離菌對常用抗菌藥物的耐藥性仍呈增長趨勢.針對目前日益嚴重的環(huán)境微生物和致病菌的耐藥性問題，目前有以下策略應對：加強藥政管理，合理使用抗生素，建立細菌耐藥監(jiān)測網，加強實驗室內質控，開發(fā)新治療方法，尋找新型的抗耐藥菌抗生素等[4-6].

本項目以從實驗室保存的金黃色葡萄球菌平板上發(fā)現的一株對其有較強抑制作用的菌株YZ-02為研究材料，對YZ-02的形態(tài)特征、生長特性、耐藥性、抑菌性等進行研究，并利用16S rRNA基因序列對其進行分子鑒定，測定其基因組框架圖，探究其可能的抑菌機制，為該菌株的開發(fā)利用奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗樣品來源于實驗室保存的金黃色葡萄球菌平板上發(fā)現的一株對其有較強抑制作用的菌株YZ-02.常見菌株包括枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、嗜線蟲沙雷氏菌、產氣腸桿菌、大腸桿菌等均為本實驗室保存；各菌株用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng).碳源或氮源實驗采用MSM基本培養(yǎng)基[7].Taq聚合酶(Takara)；PCR產物及DNA凝膠回收試劑盒(博大泰克)； 16S rDNA的基因測序和表1中引物合成(天一輝遠)；反轉錄所用試劑為PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)，FastStart Universal SYBR Green Master (Rox). PCR儀 (T-personal 48，Biometra)；熒光定量PCR儀(Applid Biosystems).

表1 PCR引物序列Tab.1 Sequences of the PCR primers

1.2 YZ-02菌株的分離純化與鑒定

從實驗室平板上挑取YZ-02菌株，再在牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上進行劃線分離純化3～4次，進行革蘭氏染色后在光學顯微鏡下鏡檢，檢測是否純化完全，以及觀察菌體形態(tài)特征.

提取菌株YZ-02的基因組DNA[8]為PCR模板，采用通用引物16S-F/16S-R進行16S rDNA擴增.PCR擴增條件參考文獻[9].PCR產物回收后送測序，獲得該菌株的16S rDNA序列后，選取GenBank數據庫中代表性菌株的16S rDNA 序列，利用Blast軟件與該菌株的16S rDNA序列進行比較分析，構建系統進化樹.采用Mega 5.0程序對系統進化樹進行分析.

1.3 YZ-02菌株的生長實驗

采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，菌種接種量為5%，在37 ℃，200 r/min下分別培養(yǎng)0,2,4,8,12,16,20,24 h，在分光光度計中測量OD600值，繪制以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600值為縱坐標的生長曲線.

1.4 YZ-02菌株的碳源與氮源利用實驗

采用MSM基本培養(yǎng)基，菌種接種量為5%，探究碳源實驗時，以0.1%氯化銨為氮源，分別以葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、淀粉、蔗糖、牛肉膏、酵母提取物、蛋白胨、碳酸氫鈉作為碳源，加入量為0.5%；探究氮源實驗時，以0.5%葡萄糖為碳源，分別以蛋白胨、亞硝酸鈉、酵母提取物、硝酸鉀、氯化銨作為氮源，加入量為0.1%，在37 ℃，200 r/min下培養(yǎng)0,24,48,72 h，在分光光度計中測量OD600值[7,10].

1.5 YZ-02菌株的生理生化特性

1.5.1 IMViC試驗

采用大腸桿菌IMViC生化鑒定試劑盒鑒定菌株的生化特征，其中包括吲哚試驗、甲基紅試驗、伏普試驗和檸檬酸鹽試驗.

1.5.2 淀粉水解試驗

將YZ-02菌株劃線接種于淀粉培養(yǎng)基上，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h，觀察菌種生長情況，在平板上滴加碘液，觀察是否出現無色透明圈.

1.5.3油脂水解試驗

將YZ-02菌株劃線接種于油脂培養(yǎng)基上，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h，觀察菌苔顏色.

1.5.4 尿素試驗

將YZ-02菌株劃線接種于尿素培養(yǎng)基上，35 ℃溫箱培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)基顏色變化.

1.5.5 硫化氫試驗

將YZ-02菌株在醋酸鉛試管培養(yǎng)基中做穿刺培養(yǎng)，37 ℃溫箱培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)基顏色變化.

1.6 YZ-02菌株的抑菌性實驗

采用牛津杯法[11]測定YZ-02菌株對常見菌株的抑制作用，常見菌株包括枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、嗜線蟲沙雷氏菌、產氣腸桿菌、大腸桿菌.

1.7 YZ-02菌株的耐藥性實驗

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入相應抗生素制成抗生素平板，采用的抗生素為四環(huán)素、氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、慶大霉素和壯觀霉素等，將YZ-02菌株劃線接種到抗生素平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察其生長情況.

1.8 YZ-02抑菌機制初步探究

將YZ-02菌株大量接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)過夜，冷凍離心收集菌體，測定完成YZ-02菌株的全基因組框架圖.分析框架圖結果和查閱文獻，合成引物，對YZ-02菌株中可能產生的細菌素基因進行PCR驗證，回收擴增成功的基因并測序，與Genbank中序列進行比對.抗生素基因引物[12,13]如表1所示.

加入大腸桿菌或金黃色葡萄球菌誘導后的YZ-02菌株，采用Trizol法提取菌株總RNA，再用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，以YZ-02菌株為對照，對菌株中的擴增成功的細菌素基因進行熒光定量PCR分析.qRT-PCR引物見表1，以16S rDNA基因為內參.

2 結果與分析

2.1 YZ-02菌株的分離鑒定

YZ-02菌落分布密集，菌落較大，不透明，菌落表面形成褶皺，不易挑起；YZ-02菌體為桿菌，形成芽孢，菌體長0.3～0.7 μm，寬0.1～0.15 μm，芽孢長約0.5 μm，寬約0.1 μm；革蘭氏染色結果為陽性.

將YZ-02菌株的16S rDNA序列與GenBank中的序列進行比對，發(fā)現該菌株與Bacillus屬中的多株細菌的相似性均在99%以上；選取同源性高的菌株用于系統發(fā)育樹的構建，結果如圖1所示.由圖1可見：YZ-02菌與Bacillus屬的多種菌株，如B.methylotrophicusL07，B.vallismortis263XY1，B.velezensisYK50，B.amyloliquefaciensRx-35，B.subtilisATCC19217，均聚在一起，細菌序列高度吻合，因此可以鑒定YZ-02細菌為芽孢桿菌屬細菌 (Bacillus).

圖1 YZ-02菌株基于16S rDNA序列的系統發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic analysis of the strain YZ-02 based on 16S rDNA sequence

2.2 YZ-02菌株的生長及生理生化特征

以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600值為縱坐標繪制了YZ-02在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中的生長曲線，如圖2a所示.從圖2a中可見：0～2 h為菌株生長的延滯期，2～12 h為菌株生長的指數期，菌株在此期間生長迅速，12 h后生長呈下降趨勢.

YZ-02菌株的碳源利用實驗如圖2b所示，YZ-02 菌株除不能利用碳酸氫鈉之外，對于麥芽糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、葡萄糖、酵母提取物、牛肉膏和蛋白胨均可利用，其中對淀粉利用效果最佳；在氮源利用實驗(見圖2c)中，YZ-02 菌株不能利用酵母提取物，但可利用蛋白胨、亞硝酸鈉、硝酸鉀和氯化銨作為氮源，且利用效果差不多.

a) YZ-02菌株的生長曲線；b) YZ-02菌株碳源利用實驗結果；c) YZ-02菌株氮源利用實驗結果圖2 YZ-02菌株的生長曲線和碳源與氮源利用實驗結果Fig.2 Growth curve,carbon sources and nitrogen sources utilization of strain YZ-02

YZ-02菌株的生理生化特征結果如表2所示.

表2 YZ-02菌的生理生化實驗結果Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of YZ-02

注：“+”為陽性，“-”為陰性

在IMViC試驗中，吲哚試驗結果為陰性，說明該菌株不具有色氨酸酶，不能利用色氨酸；甲基紅試驗和伏普試驗結果為陰性，說明該菌株在利用葡萄糖的過程中既不能進行混合酸發(fā)酵也不能進行丁二醇發(fā)酵；檸檬酸鹽的結果顯示該菌株不能利用檸檬酸鹽.在大分子水解試驗中，淀粉水解和油脂水解試驗結果為陽性，說明YZ-02菌株可利用淀粉和油脂，而尿素和硫化氫試驗結果為陰性，說明該菌株不能產生尿素酶，也不能利用含硫化合物產生硫化氫.

2.3 抑菌性實驗和耐藥性結果分析

YZ-02對常見細菌的抑制作用結果見表3.由表3可知：YZ-02菌株對金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、嗜線蟲沙雷氏菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌均能產生抑菌圈，且產生的抑菌圈的大小基本相同，在產氣腸桿菌平板上牛津杯周圍無抑菌圈產生，說明YZ-02菌株能夠抑制除產氣腸桿菌之外的幾種常見細菌的生長.

表3 YZ-02對常見細菌的抑制作用Tab.3 Inhibition of strain YZ-02 on the common bacteria

注：“-”表示無抑菌圈

YZ-02的耐藥性檢測結果見表4.由表4可知，YZ-02菌株對不同抗生素的耐藥性不同.YZ-02菌株在壯觀霉素(Sp10)、卡那霉素(Km20)、鏈霉素(St50)、慶大霉素(Gm5)平板上不能生長，說明該菌株對這4種抗生素不具有耐藥性；YZ-02菌株在氨芐青霉素(Ap20)平板上生長，但生長較差，說明該菌株對氨芐青霉素具有一定的耐藥性；YZ-02菌株在四環(huán)素(Tc2)和氯霉素(Cm2)平板上長勢良好，說明YZ-02菌株對這兩種抗生素具有較強的耐藥性.

表4 YZ-02的耐藥性檢測結果Tab.4 Antibiotic resistance of strain YZ-02

注：“-”表示沒有生長，“+”表示長勢較弱，“+++”表示長勢良好

2.4 YZ-02菌株抑菌機制的初步探究

YZ-02菌株全基因組大小約為3.89 Mbp，GC含量為46.58%，共有3899個ORF，利用不同的數據庫，對YZ-02基因組中所有蛋白編碼基因進行了功能注釋，發(fā)現基因組中含有多個細菌素基因的相似序列，如mycosubtilin (contig1_968)、surfactin (contig5_3268)、flagellin (contig2_1468)、TasA (contig2_1469)、lantibiotic (contig2_1305) 等.

結合基因組框架圖結果和文獻，合成6對引物 (見表1) 進行PCR擴增，發(fā)現YZ-02中可擴增獲得tasA基因、hag基因和ituA基因 (圖3).

M) DL2000 marker; 1)masA基因; 2) tasA基因; 3) hag基因; 4) spaS基因; 5) ituA基因; 6) sfp基因a)針對抗生素基因進行PCR驗證；b)PCR產物回收圖3 YZ-02菌株中抗生素基因PCR驗證和回收Fig.3 PCR confirmation and recovery of bacteriocin genes in strain YZ-02

將YZ-02中的tasA基因、hag基因和ituA基因測序后，與Genbank中的tasA基因 (JF791687.1)、hag基因 (AB033501.1)、ituA基因 (D21876.1) 分別進行比對發(fā)現，分別具有98%、95%、98%的相似性.

用熒光定量RT-PCR分析hag基因和ituA基因在YZ-02菌株中的表達量，結果如圖4所示.如圖4可見：在加入大腸桿菌誘導后，hag基因和ituA基因的表達量均為對照的4.14±0.35倍和10.27±0.76倍；在加入金黃色葡萄球菌誘導后，hag基因和ituA基因的表達量均為對照的2.45±0.23倍和2.67±0.43倍.統計分析表明，hag基因和ituA基因的表達達到顯著差異(P<0.05)，表明hag基因和ituA基因的表達在大腸桿菌或金黃色葡萄球菌的誘導下表達增加.

C：對照；Ec：大腸桿菌；Sa：金黃色葡萄球菌圖4 hag基因和ituA基因的RT-PCR結果 Fig.4 RT-PCR result of hag gene and ituA gene

3 討論

全球細菌耐藥性問題日益嚴重，應對這一危機需要多管齊下，其中，不斷地對新型的抗耐藥菌抗生素的研發(fā)是救治感染患者的主要手段和方法[5]，尤其是研究開發(fā)一些新結構類別抗生素和(半)合成抗生素，以及非抗生素療法，如CRISPR-Cas9等的應用[6]、噬菌體及噬菌體裂解酶療法[14]等.研究表明：細菌產生的細菌素，與其他的細菌素、抗生素、噬菌體裂解酶或抗微生物藥物結合，可以用于防治病原菌[15].

作為一種廣泛存在于自然界的非致病細菌，芽孢桿菌可產生多種抗菌素，包括磷酯類抗生素，肽類抗生素，聚酮化合物，脂肽類抗生素等，具有抗菌譜廣、物理化學性質穩(wěn)定等特點，既可直接作用于其它病原菌的核酸、蛋白質、細胞膜、細胞壁等，也可干擾其生物合成系統，能夠克服病原菌對現有抗生素的耐藥性問題[16,17]，具有十分誘人的應用前景和不可低估的開發(fā)潛力，尤其是生物工程利用價值極高的肽類和脂肽類抗生素.Subtilin是芽孢桿菌菌株中最早發(fā)現的抗菌肽(肽類抗生素)之一，是一種硫醚抗生素，能夠通過核糖體合成途徑進行合成，其結構與廣泛應用的乳鏈菌素(nisin)類似[18]，其前體肽鏈由SpaS基因編碼[19]；Iturin是一類可以強烈抑制病原體生長的脂肽，通過非核糖體途徑合成，該家族成員都具有環(huán)狀結構，并且由7個氨基酸和1個β-氨基脂肪酸組成[20]；由TasA基因編碼的31 kDa的孢子形成蛋白，在環(huán)境中具有廣譜抗菌活性，賦予孢子競爭優(yōu)勢[21].Asano等[22]克隆了hag基因，其表達產物是鞭毛蛋白flagellin，也具有抑菌活性，鞭毛蛋白flagellin的抑菌活性可以解釋多種芽孢桿菌的抑菌作用.

本文從金黃色葡萄球菌平板上發(fā)現的這一株有較強抑制作用的芽孢桿菌屬細菌，可抑制多種常見細菌如金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、嗜線蟲沙雷氏菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等的生長，抑菌性較強；同時，該菌對現有的抗生素的耐藥性不強；對其基因組框架圖進行分析發(fā)現基因組中存在多種芽孢桿菌特有的細菌素基因如mycosubtilin、surfactin、flagellin、TasA、lantibiotic 等，通過PCR驗證獲得tasA基因、hag基因和ituA基因，與Genbank中的tasA基因 (JF791687.1)、hag基因 (AB033501.1)、ituA基因 (D21876.1) 分別進行比對發(fā)現，分別具有98%、95%、98%的相似性，RT-PCR的結果顯示在大腸桿菌或金黃色葡萄球菌誘導后hag基因和ituA基因的表達量增加，YZ-02菌株對多個常見細菌的抑菌作用可能是這些細菌素單個或聯合作用的結果.本研究結果為后續(xù)進一步開發(fā)利用該菌株奠定了基礎.