于琛琛，張純剛，程 嵐

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600)

白藜蘆醇(C14H12O3)化學(xué)名稱為3，5，4′-三羥基二苯乙烯，是一種無(wú)色針狀晶體，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有機(jī)溶劑[1-2]。其水溶性較差，但細(xì)胞膜通透性很高，屬于BCSⅡ類(lèi)化合物[3]。白藜蘆醇在自然界的存在形式主要有2種：順式和反式白藜蘆醇[4]。白藜蘆醇的順式異構(gòu)體與反式異構(gòu)體均具有光敏性，在光照條件下會(huì)有部分互相轉(zhuǎn)化，故應(yīng)避光保存[5]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗炎、抗血小板聚集、抗細(xì)菌和真菌感染、影響胃酸分泌、調(diào)節(jié)血脂等[6-12]。但是其水中溶解度較差，導(dǎo)致其體內(nèi)生物利用度較低，嚴(yán)重影響了其廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將白藜蘆醇制備成β-環(huán)糊精包合物，提高其水溶性，并進(jìn)行了大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究，進(jìn)而提高其體內(nèi)生物利用度。

1 材料

高效液相色譜(島津SHIMADZU，2010A-HT)；渦旋混合器Vortex-5(IKA，Vortex 3)；高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，TGL-16 g)。

白藜蘆醇原料藥(API)(98%，武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，20171225)；白藜蘆醇-β-環(huán)糊精包合物(自制，白藜蘆醇∶β-環(huán)糊精質(zhì)量比=1∶2)；卡馬西平對(duì)照品(內(nèi)標(biāo)，上海哈靈生物科技有限公司，100142-201605)；白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(南京森貝伽生物科技有限公司，111535-201502)；色譜甲醇和色譜乙腈(SIGMA)；醋酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

雄性SD大鼠12只，體質(zhì)量(250± 20)g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent Extend-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：水∶乙腈=70∶30(v/v)，流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm，進(jìn)樣量30 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 白藜蘆醇系列對(duì)照品溶液的配制 精密稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并定容濃度為250 μg/mL的儲(chǔ)備液，于4 ℃保存。臨用前，用甲醇稀釋定容，濃度分別為100、200、1 000、2 000、5 000、10 000、25 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)液的配制 取卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配置濃度為250 μg/mL的儲(chǔ)備液，于4 ℃保存。臨用前，用甲醇定容成濃度為25 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.3 血漿樣品的處理

取大鼠血漿樣品100 μL，置于2 mL EP管中，加入甲醇10 μL，加入內(nèi)標(biāo)液10 μL，加入醋酸溶液(0.5% v/v)50 μL，加入乙腈200 μL，渦旋混合3 min，離心10 min(12 000 rpm)，取上清液進(jìn)樣。

2.4 給藥方案與血樣采集

將雄性SD大鼠12只隨機(jī)分成2組，給藥前不禁水，禁食12 h，一組口服灌胃原料藥(20 mg/kg)，另一組給予白藜蘆醇β-環(huán)糊精包合物(含白藜蘆醇20 mg/kg)；并于給藥后5、10、15、30、45、60、120、240、 480、720 min眼眶取血0.2 mL置于肝素化的EP管中，離心(4 000 rpm)，取上清液于-20 ℃冰凍保存?zhèn)錅y(cè)。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 方法專(zhuān)屬性 分別取6只雄性SD大鼠空白血漿100 μL，將加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL改為加入甲醇10 μL，其余按“2.3血漿樣預(yù)處理”項(xiàng)下的方法操作，得空白血漿樣品色譜圖1-A；將白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加至空白血漿中，依同法操作，得色譜圖1-B，其中白藜蘆醇和內(nèi)標(biāo)(卡馬西平)的保留時(shí)間分別為3.86和7.25 min；取給藥后的血漿樣品，依同法操作，得色譜圖1-C。結(jié)果表明，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾白藜蘆醇和內(nèi)標(biāo)(卡馬西平)的測(cè)定。

A.大鼠空白血漿；B.大鼠空白血漿加白藜蘆醇和內(nèi)標(biāo)物；C.給藥后30 min的血漿圖1 HPLC法測(cè)定血漿中白藜蘆醇(Ⅰ)和內(nèi)標(biāo)(Ⅱ)的典型色譜

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性關(guān)系及定量下限 配成濃度相當(dāng)于10、20、100、200、500、1 000、2 500 ng/mL的白藜蘆醇血漿對(duì)照品溶液，再按“2.3”項(xiàng)處理后檢測(cè)，所得數(shù)據(jù)以血漿中白藜蘆醇的濃度X對(duì)白藜蘆醇與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值Y進(jìn)行線性回歸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.005 8x+0.211 3(r=0.999 5)。結(jié)果表明，白藜蘆醇在10～2 500 ng/mL線性關(guān)系良好，最低定量為10 ng/mL。

2.5.3 方法精密度和準(zhǔn)確度 取大鼠空白血漿100 μL，加入高、中、低3種質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μL，配制成質(zhì)量濃度分別為 20.0、500.0、2 000.0 ng/mL的質(zhì)量控制(QC)樣品，每一質(zhì)量濃度進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)進(jìn)樣3天，用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得QC樣品的質(zhì)量濃度，與配制質(zhì)量濃度對(duì)照，求得血漿樣品測(cè)定方法的準(zhǔn)確度與精密度，白藜蘆醇低、中、高3個(gè)濃度的日內(nèi)精密度分別為3.26%，4.60%，3.40%；日間精密度分別為4.54%，3.63%，3.98%。準(zhǔn)確度分別為(100.0±3.26)%，(99.0±4.6)%，(97.2±3.3)%，結(jié)果表明白藜蘆醇血漿樣品測(cè)定方法的精密度和準(zhǔn)確度符合要求。

2.5.4 提取回收率 配制低、中、高3種濃度(20.0、500.0、2 000.0 ng/mL)的白藜蘆醇血漿對(duì)照品溶液，每種濃度6份，再按“2.3”項(xiàng)處理后檢測(cè)。另取同樣濃度的白藜蘆醇對(duì)照品各6份于試管中，不加空白血漿，按“2.3”項(xiàng)處理后檢測(cè)，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的濃度，低、中、高3種濃度的相對(duì)回收率分別為(96.6±2.6)%、(100.5±2.2)%和(99.0±4.4)%。內(nèi)標(biāo)卡馬西平的提取回收率為(99.6±2.5)%。

2.5.5 樣品穩(wěn)定性 本實(shí)驗(yàn)考察了白藜蘆醇血漿樣品室溫放置2 h、處理后進(jìn)樣室溫(4 ℃)放置24 h、經(jīng)歷1次和3次冷凍-解凍循環(huán)和-20 ℃冰凍30 d的穩(wěn)定性。進(jìn)行穩(wěn)定性考察時(shí)，取空白血漿100 μL，加入白藜蘆醇低、中、高三個(gè)質(zhì)量濃度的系列質(zhì)量控制溶液10 μL，配制成低(20 ng/mL)、中(500 ng/mL)和高(2 000 ng/mL)的3個(gè)質(zhì)量濃度的QC樣品，每一濃度進(jìn)行3樣本分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明白藜蘆醇血漿樣品在避光條件下室溫放置2 h、處理后進(jìn)樣室溫(4 ℃)放置24 h、經(jīng)歷1次和3次冷凍-解凍循環(huán)和-20 ℃冰凍30 d均可保持穩(wěn)定(相對(duì)偏差均在15%之內(nèi))。數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 在不同條件下白藜蘆醇樣品的穩(wěn)定性

2.6 藥動(dòng)結(jié)果

采用 DAS 3.0藥動(dòng)學(xué)軟件處理口服白藜蘆醇原料藥和制劑的血藥質(zhì)量濃度測(cè)定數(shù)據(jù)，將血藥濃度(C)與時(shí)間(t)數(shù)據(jù)用 DAS3.0擬合，測(cè)得平均血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)見(jiàn)圖2。主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

圖2 RES原料藥和RES-β-環(huán)糊精包合物在大鼠體內(nèi)的藥-時(shí)曲線

表2 白藜蘆醇在大鼠體內(nèi)主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論

根據(jù)白藜蘆醇及卡馬西平的理化性質(zhì)，考察了采用甲醇、乙腈直接沉淀蛋白方法進(jìn)行血漿樣品處理。由于采用甲醇進(jìn)行沉淀蛋白處理血漿樣品，不能完全地除去蛋白，而采用乙腈沉淀蛋白。血漿中加入2倍量的乙腈，可充分沉淀蛋白并且提取RES效率較高，操作簡(jiǎn)單、方便、效率高。最終選定加入2倍量乙腈作為沉淀試劑。

采用HPLC-UV法測(cè)定大鼠血漿中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度，經(jīng)過(guò)流動(dòng)相配比及選擇后確定采用乙腈∶水(30∶70)，可獲得較短的保留時(shí)間，同時(shí)又可以與雜質(zhì)峰分離，樣品分析時(shí)間短，1次測(cè)定只需8.0 min，本方法定量下限為10 ng/mL，能滿足白藜蘆醇體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究。

生物等效性統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)中進(jìn)行Cmax和AUC的方差分析，與RES原料藥比較，白藜蘆醇-β-環(huán)糊精包合物Cmax和AUC都具有顯著性差異(P<0.05)，制劑組的Cmax和AUC都具有較明顯的提高。從表1中可以看出，RES原料藥組AUC0-t和AUC0-∞分別為(514.7±117.5)和(543.7±102.2)ng/mL*h，白藜蘆醇-β-環(huán)糊精包合物組的AUC0-t和AUC0-∞分別為(1 191.4±147.9)和(1 396.4±196.4)ng/mL*h，白藜蘆醇口服制劑與原料藥對(duì)比，其相對(duì)生物利用度為225.6%。RES原料藥組Cmax為(473.3±200.8)ng/mL，白藜蘆醇-β-環(huán)糊精包合物組為(1 135.3±60.6)ng/mL，提高了2.4倍多。與原料藥組相比，達(dá)峰時(shí)間更快。t1/2由原料藥的2.56 h延長(zhǎng)至4.42 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白藜蘆醇經(jīng)過(guò)β-環(huán)糊精包合后，藥物在體內(nèi)的吸收具有較明顯的提高。其吸收峰濃度顯著提高，同時(shí)制備的β-環(huán)糊精包合后半衰期明顯延長(zhǎng)，提示將白藜蘆醇制備成環(huán)糊精包合物是可以較好地提高其口服吸收。本文作者建立了 HPLC-UV法用于測(cè)定大鼠血漿中白藜蘆醇的濃度，首次報(bào)道了白藜蘆醇-β-環(huán)糊精包合物(白藜蘆醇：β-環(huán)糊精質(zhì)量比=1∶2)大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)情況，為白藜蘆醇體內(nèi)血藥濃度的測(cè)定和藥動(dòng)學(xué)的研究提供參考依據(jù)。為了更好地評(píng)價(jià)白藜蘆醇的藥用價(jià)值，對(duì)其在體內(nèi)的分布、排泄及代謝產(chǎn)物特點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。