吳世婷，劉麗芳，熊家青

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007)

銀屑病(psoriasis，PS)是一種慢性炎癥性皮膚病，西醫(yī)俗稱“牛皮癬”，其病程長、易反復(fù)發(fā)作，皮損表現(xiàn)多為紅斑、鱗屑。中醫(yī)病名最早見于《外科證治全書》：“白疕，一名疕風(fēng)……?！贝送?，原文還述“漸至肢體枯燥坼裂，血出痛楚……”，認為本病最基本的病因為“血虛”，“因歲金太過，至深秋燥金用事，乃得此證”，則進一步指出本病的發(fā)病是在“血虛”的基礎(chǔ)上“生燥”。而潤膚止癢乳正是以養(yǎng)血潤燥為原則組方配制而成，臨床上用于治療銀屑病，同時還取得了不錯的療效。在銀屑病的綜合治療中，中醫(yī)藥優(yōu)勢明顯且效果良好，但其作用機制尚不完全明確。本實驗應(yīng)用免疫組化探討潤膚止癢乳對銀屑病皮損中干擾素調(diào)節(jié)因子-4(IRF-4)表達的影響，以期為中醫(yī)中藥治療銀屑病提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雌性BALB/C小鼠(長沙市天勤生物技術(shù)有限公司)，72只，合格證號：No.43006700013161，許可證號：SCXK(湘)2014-0011，SPF級，鼠齡5周，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級實驗室，環(huán)境許可證號：SYXK(湘)2015-0003。

1.2 藥物及試劑

咪喹莫特乳膏(湖南科益藥業(yè))；低、高濃度潤膚止癢乳(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心配置)；中濃度潤膚止癢乳(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心自制)；他扎羅汀乳膏(重慶華邦制藥)；蘇木素-伊紅染液套裝(武漢谷歌生物科技有限公司)；氨水(國藥集團)；鹽酸(國藥集團)；中性樹膠(國藥集團)；HRP山羊抗兔二抗(servicebio，TBS緩沖液(武漢谷歌)。

1.3 儀器及軟件

勻漿儀(康濤科技，型號：KZ-II)；冰箱(西門子，型號：BCD-186)；超凈工作臺(蘇凈安泰，型號：SW-CJ-1FD)；病理切片機(上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016)；超微量分光光度計(Thermo，型號：NanoDrop2000)；正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康，型號：Eclipse E100)；成像系統(tǒng)(日本尼康，型號：Nikon DS-U3)；掃描儀(EPSON，型號：V300)；電子天平(梅特勒-托利多儀器，型號：PL-203)。

1.4 動物造模及標本制作

1.4.1 建立動物模型 以區(qū)間分組法將72只小鼠隨機分為6組各12只：正常對照組，空白模型組，潤膚止癢乳高濃度組(0.48 g/mL)、中濃度組(0.24 g/mL)、低濃度組(0.12 g/mL)及他扎羅汀組。硫化鈉脫去小鼠背部約2 cm×2 cm面積毛發(fā)。正常對照組每日以0.5 mL蒸餾水外涂，其余組小鼠每日以62.5 mg咪喹莫特乳膏外涂8天，造模。

1.4.2 實驗給藥方法 正常對照組及空白模型組以每日0.5 mL蒸餾水外涂小鼠背部脫毛區(qū)皮膚，其余組以相應(yīng)藥物外涂。

1.4.3 制作標本 以1.4.2方法于藥物作用后的第3天和第8天處死每組小鼠6只，剪取背部皮損。取1/3用福爾馬林固定，剩余于-80 ℃冰箱備用。

1.5 觀察皮損變化

1.5.1 脫毛區(qū)皮損評價 觀察每只小鼠的生命體征，拍照記錄脫毛區(qū)皮損的變化、紅斑鱗屑的情況等。

1.5.2 蘇木素-伊紅HE切片染色觀察 以“1.4”中方法取標本，固定液固定標本24 h，自來水反復(fù)沖洗，低到高濃度梯度逐級置于乙醇中脫水，二甲苯浸泡至透明。蠟包裹標本。包埋后，制成3 μm切片，脫蠟脫水。蘇木素染色3～5 min，鹽酸及氨分色，沖洗；再用酒精脫水，伊紅染液中染色2～5 min。脫水后中性樹膠封片，顯微鏡下采集圖像及分析圖像。

1.5.3 免疫組化檢測IRF-4 方法同“1.5.2”，先將石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)緩沖液浸泡，PBS洗滌玻片；50 μL 3%H2O2溶液滅活10 min；小牛血清封閉10～30 min；一抗4 ℃孵育過夜；再二抗37 ℃孵育50 min；DAB顯色液浸泡至棕黃色；蘇木素復(fù)染1～3 min，鹽酸酒精分化，自來水沖洗，氨水反藍；低到高濃度梯度二甲苯和酒精中浸泡，封片。顯微鏡鏡下觀察進行圖像采集和分析。分析累積光密度值(integral optical density mean，IOD)，IOD值越大表明IRF-4表達越多，越小則反之。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 外觀及HE染色判斷造模成功與否[1-4]

正常對照組小鼠脫毛區(qū)皮膚正常，未見明顯改變；模型組小鼠的背部脫毛區(qū)皮膚出現(xiàn)紅斑、丘疹、鱗屑，具體見圖1。以“1.4.3”取得的模型組小鼠標本，HE染色顯示符合銀屑病皮損改變，具體見圖2。 由以上兩點，說明造模成功，可繼續(xù)進行下一步實驗。

2.2 IHC檢測IRF-4的表達

造模成功后，分析各組以相應(yīng)藥物作用3天及8天后的IRF-4的IOD值并比較發(fā)現(xiàn)：所有組與空白模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；潤膚止癢乳高濃度組、潤膚止癢乳低濃度組及他扎羅汀組中IRF-4的表達高于正常對照組(P<0.05)，而與潤膚止癢乳中濃度組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；潤膚止癢乳中濃度組中IRF-4表達低于潤膚止癢乳高及低濃度組(P<0.05)；潤膚止癢乳高、中及低濃度組與他扎羅汀組中IRF-4的表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。可以得出模型中銀屑病皮損中IRF-4的表達要高于正常皮膚，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院自制劑、潤膚止癢乳治療銀屑病的療效與西藥制劑他扎羅汀療效相當(dāng)，其中潤膚止癢乳在臨床常用濃度0.24 g/mL時療效最優(yōu)，潤膚止癢乳治療銀屑病的機制可能為抑制IRF-4的表達，且0.24 g/mL濃度對IRF-4的抑制作用最為明顯。具體數(shù)值見表1，染色情況見圖3、圖4。

第1天 第3天 第5天 第7天

注：除正常對照組外，其余各組小鼠皮膚隨藥物作用的天數(shù)及次數(shù)的增加，紅斑、丘疹、鱗屑皮損等皮損增多且明顯。

圖1 小鼠皮膚

組別第3天第8天正常對照組3218.34±1.4847E3*2737.95±1.3893E3*空白模型組11215.38±3.9498E311466.73±3.5053E3潤膚止癢乳低濃度組8927.98±7.2712E3*#▲★6706.71±2.2115E3*#▲★潤膚止癢乳中濃度組5023.60±1.9930E3*△★2979.41±1.6610E3*△★潤膚止癢乳高濃度組8289.92±1.7537E3*#▲★5111.60±2.4675E3*#▲★他扎羅汀組6959.22±1.0187E3*#△☆4383.71±1.3547E3*#△☆

注：與空白模型組比較，*P<0.05；與正常對照組比較，#P<0.05，△P>0.05；與潤膚止癢乳中濃度組比較，▲P<0.05，☆P>0.05；與他扎羅汀組比較，★P>0.05。

注：①②③為正常對照組外小鼠藥物作用后3天于光鏡下×40、×100、×200所見，表皮增厚、顆粒層減少，上皮細胞增生，淋巴細胞浸潤；④⑤⑥為正常對照組外小鼠藥物作用后3天于光鏡下×40、×100、×200所見，表皮增厚、顆粒層消失，角化過度，上皮細胞增生，淋巴細胞浸潤。

圖2 HE染色

注：A：正常對照組；B：空白模型組；C：潤膚止癢乳高濃度組；D：潤膚止癢乳中濃度組；E：潤膚止癢乳低濃度組；F：他扎羅汀組

注：A：正常對照組；B：空白模型組；C：潤膚止癢乳高濃度組；D：潤膚止癢乳中濃度組；E：潤膚止癢乳低濃度組；F：他扎羅汀組

3 討論

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病。在國內(nèi)外關(guān)于銀屑病的發(fā)生發(fā)展研究和臨床觀察中，認為輔助性T細胞17(h17)及其相關(guān)細胞因子起著重要作用[1-2]。IRF-4是轉(zhuǎn)錄因子IRF家族中的一員，是由一系列廣泛的有絲分裂刺激所產(chǎn)生的，例如抗原受體參與、脂多糖和CD40信號[3-4]。同時也證實IRF-4是淋巴細胞、髓細胞樹狀細胞分化和成熟過程中幾個步驟的關(guān)鍵調(diào)控因子[5]。研究還表明，在銀屑病皮膚皮損中，尤其是角質(zhì)形成細胞和炎癥細胞中，IRF-4表達明顯升高，故下調(diào)和抑制IRF-4的表達可能是治療銀屑病和其他自身免疫性疾病的一種方式和新的突破口[6-7]。

中醫(yī)認為本病的致病因素多與外感或內(nèi)生風(fēng)、燥、熱、濕、毒等有關(guān)，且認為本病的發(fā)病是在患者本已“血虛”的基礎(chǔ)上，加之外感風(fēng)邪，血虛內(nèi)燥不能濡養(yǎng)皮膚而發(fā)病。中醫(yī)名“玄府”即汗孔，是中醫(yī)學(xué)中特有的一種概念。在臨床中，銀屑病患者常常表現(xiàn)為冬季病情加重。夏季病情減輕，究其根本，中醫(yī)認為人在冬季，因其氣候寒冷，故人肌膚腠理隨之相對致密，玄府郁閉而致肌膚無汗，氣無法向外流行布散，陰津也就無法向外布散濡養(yǎng)肌膚毛孔，肌膚失于濡養(yǎng)則干燥脫屑，故病情加重。而夏季氣候溫暖，人肌膚腠理疏松，玄府通利，肌膚得陰津之濡潤，故病情較輕。正如《靈樞·五癃津液別》所載：“天暑衣厚則腠理開，故汗出……天寒則腠理閉，氣濕不行。”故銀屑病的主要病因病機為“血虛風(fēng)燥，玄府閉密”[8]。而潤膚止癢乳的配方配伍是以中醫(yī)養(yǎng)血潤燥法[9]為主，配以生地、當(dāng)歸補血養(yǎng)血，使其皮毛玄府有所濡養(yǎng)；肺主皮毛，調(diào)控玄府，故以何首烏養(yǎng)陰補血以養(yǎng)肺；以桃仁和紅花活血加行氣以通暢玄府；平肌膚之風(fēng)以止癢，故配以地膚子、苦參、蠶砂加上蛇床子燥濕祛風(fēng)；杏仁和瓜蔞霜清熱清熱潤腸以滋肺陰；薄荷、冰片清涼發(fā)散，宣發(fā)藥物以止癢。

本研究結(jié)果顯示，潤膚止癢乳對銀屑病的治療與抑制銀屑病皮損中IRF-4的表達和調(diào)節(jié)免疫有關(guān)，其效果與他扎羅汀相當(dāng)甚至更優(yōu)，且中醫(yī)中藥因其較小的副作用而可更好地應(yīng)用于臨床。本實驗初步證實了養(yǎng)血潤燥法治療銀屑病的作用及作用機理，但是中醫(yī)中藥治療銀屑病的作用機理還需要更多的臨床及實驗研究來探究。