尚金召，王雪芹，熊聿力，路福平，劉夫鋒

(食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，工業(yè)酶國家工程實驗室， 天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

淀粉樣蛋白聚集成不溶性的淀粉纖維可導致各種疾病，例如淀粉樣β-蛋白質(Aβ)在大腦細胞外聚集形成淀粉樣斑塊是阿爾茨海默癥的病理特征[1-2]、α-突觸核蛋白(alpha-synuclein)聚集形成的路易小體是帕金森病理特征[3]和人胰島淀粉樣多肽(hIAPP)的聚集體導致胰島內β 細胞功能障礙和凋亡進而引起2 型糖尿病[4-5]．2017 年全世界約有4.25 億糖尿病患者，預計到2035 年，糖尿病患病人數(shù)將增長55%，遠超6 億[6]．因此，探索該疾病的致病機理和尋找治療2 型糖尿病的藥物成為研究熱點．

2 型糖尿病患者胰島組織內含有大量的人胰島淀粉樣多肽(hIAPP)的聚集體[7]．hIAPP 含37 個氨基酸[8]，相對分子質量約為3.9×103．hIAPP 是由人胰島β 細胞合成并分泌的[9]．生理狀態(tài)下的hIAPP 可以協(xié)同胰島素等血糖調節(jié)激素對人體血糖進行更精準的調節(jié)[10]．由于hIAPP 氨基酸殘基極易發(fā)生構象轉換形成分子β-折疊結構，并進一步聚集形成各種有毒的聚集體[11]；研究結果[12-13]表明，hIAPP 的聚集是引起2 型糖尿病的主要原因，因此開發(fā)hIAPP 的聚集抑制劑就成為攻克2 型糖尿病的研究熱點．盡管目前對hIAPP 纖維化過程取得了一些研究成果，但很多關于這些聚集體的大小、結構、形態(tài)以及與細胞毒性之間的關系等方面目前仍存在很多未知的問題.

實驗過程中所用的hIAPP 主要通過固相化學合成法制備[14-16]．雖然該方法高效、快速、價格低廉，但固相合成過程中殘留的氨基酸或多肽片段會嚴重影響hIAPP 的聚集和毒理特性[17]．由于hIAPP 存在高疏水性和易于聚集的特性且活體組織中含量極低，很難從胰島B 細胞組織中大量提取和純化．雖已有一些研究組利用融合表達純化獲得重組hIAPP[18]，但存在表達量低和分離純化困難等缺點．利用分子生物學和基因工程等技術表達生產hIAPP，可能成為獲取該蛋白質的主要手段．利用幾丁質結合域蛋白與hIAPP 融合在大腸桿菌中表達[19]，其缺陷是很難保證hIAPP 氨基酸序列N 端的完整性．

為了克服以上缺陷，本研究采用麥芽糖結合蛋白(maltose binding protein，MBP)與hIAPP 融合表達獲得高純度具有原始氨基酸序列的hIAPP．MBP 作為常用的蛋白融合標簽具有能夠提高目標蛋白高效可溶性表達的功能，因此利用具有該標簽的表達載體pMAL-c2x 可實現(xiàn)疏水性蛋白的大量可溶性表達．MBP 標簽已用于一些疏水性蛋白質的重組表達．例如，本研究室將淀粉樣β-蛋白質(Aβ)與MBP融合表達，獲得高純度的Aβ42[20]．采用直鏈淀粉樹脂可特異性親和層析純化以MBP 為融合標簽的目標蛋白，一步純化的純度可達到70%～90%[21]．融合標簽MBP 的相對分子質量約為4.2×104，由大腸桿菌(E.coli)K12 的malE 基因編碼．一般將MBP 融合表達在蛋白的N 端或C 端，可大大增加融合蛋白的溶解性．為了提高酶切效率，在融合蛋白與目標蛋白之間添加一些連接片段和蛋白酶切位點，如凝血酶、凝血因子Xa、腸激酶和煙草蝕紋病毒蛋白酶(rTEV)[22]等．最后用位點專一的蛋白酶切割MBP 標簽，從而獲得目標蛋白．本研究采用MBP 為融合蛋白標簽，MBP 與hIAPP 之間添加剛性且可溶性較強的蛋白片段[23]，并用改進的rTEV 切除MBP 標簽，最后利用Genshare CFAS any KD PAGE 蛋白膠電泳和MALDI TOF 鑒定獲得的hIAPP．本研究旨在能為以研究hIAPP 的體外聚集來開發(fā)2 型糖尿病藥物提供原料，以及為其他疏水性或有毒性蛋白及多肽在大腸桿菌中的表達提供思路．

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌(E.coli)JM109、大腸桿菌(E.coli) BL21(DE3)和原核表達載體pMAL-c2x 保存于本實驗室．該原核表達載體上含有MBP 蛋白質的基因malE．

高保真Pyrobest DNA 聚合酶、Solution 連接酶和限制性內切酶EcoRⅠ、HindⅢ，寶生物工程(大連)有限公司；質粒提取試劑盒和rTEV 蛋白酶(重組型)，北京索來寶科技有限公司；蛋白純化重力柱、直鏈淀粉樹脂，英國 New England Biolabs 公司；Genshare CFAS any KD PAGE 蛋白電泳凝膠制備試劑盒，西安晶彩生物科技有限公司；其他常見化學試劑均為分析純，北京奧博星生物技術有限責任公司．

1.2 方法

1.2.1 引物合成以及融合表達載體和工程菌的構建

根據(jù)NCBI 中hIAPP(GenBank：ADD13605.1)多肽氨基酸序列，密碼子優(yōu)化[24]為偏好大腸桿菌表達的DNA 序列．為了獲得具有原始氨基酸序列的hIAPP，基因合成過程中在hIAPP 基因的上游添加了蛋白片段(NANP)3和TEV 蛋白酶識別位點的基因序列即(NANP)3-TEV-hIAPP．(NANP)3-TEV-hIAPP基因合成及測序由蘇州金唯智公司合成．引物由深圳華大基因合成．

hIAPP 的DNA 序列以pUC57-hIAPP 形式合成，用EcoRⅠ和HindⅢ將目的片段從該質粒上切下，凝膠回收酶切產物 hIAPP，與具有相同黏性末端的pMAL-c2x 載體16 ℃連接4 h；轉化JM109 大腸桿菌感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)12 h；挑取陽性轉化子進行菌落PCR 驗證，并提取質粒送至基因公司進行測序鑒定．將鑒定正確的質粒命名為pMAL-hIAPP．

測序正確的質粒轉化到表達宿主E.coli BL21 (DE3)中，菌落通過PCR 驗證．將驗證正確的菌株命名為BL21-pMAL-hIAPP．

1.2.2 MBP-hIAPP 融合表達純化和表達條件優(yōu)化

將構建好的工程菌BL21-pMAL-hIAPP 挑取單菌落接種于5 mL LB 試管(氨芐青霉素抗性終質量濃度為50μg/mL)；培養(yǎng)12 h 后取1 mL(2%的接種量)轉接到50 mL LB 培養(yǎng)基中(氨芐青霉素抗性終質量濃度為50μg/mL)，37 ℃培養(yǎng)至菌體濃度達到A600＝0.4～0.8，加誘導劑IPTG至終濃度為0.5mmol/L[25-26]．誘導發(fā)酵后離心收集菌體，用20 mL MBP 結合緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT)重懸菌體，加入1%蛋白酶抑制劑PMSF，冰浴30 min；250 W 超聲破碎20 min，12 000 r/min 離心30 min 后收集上清液．上清液過0.22μm 除菌膜后加入到直鏈淀粉樹脂，結合30 min 后層析柱上樣，用15 倍柱體積的洗滌緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT)洗滌柱子，最后用10 倍柱體積的洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，20 mmol/L 麥芽糖)洗脫，洗脫液4 ℃保存．

接種工程菌BL21-pMAL-MBP-hIAPP 于5 mL LB 試管，并培養(yǎng)過夜．轉接種子液后，37 ℃培養(yǎng)菌體濃度 A600＝0.4 ～0.8，加入終濃度 0.5 mmol/L IPTG，分別于13 ℃和16 ℃誘導培養(yǎng)32 h 和16 h 后收集菌體，通過直鏈淀粉樹脂純化融合蛋白MBPhIAPP，用20 mmol/L 麥芽糖溶出目的蛋白．取不同誘導條件下純化后的融合蛋白，加 5μL 蛋白loading，煮沸10 min，通過SDS-PAGE 電泳分析誘導結果．

1.2.3 MBP-hIAPP 融合蛋白的酶切

根據(jù)rTEV 蛋白酶使用說明書，取1 mg 上述純化的融合蛋白，加入4 μL 250×buffer，2.4 μL TEV酶，用緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，150 mmol/L NaCl，pH 8.0)補足至1 mL，置于16 ℃酶切反應，取6、12 h 酶切產物分別進行12% SDS-PAGE 分析．

1.2.4 尺寸排阻色譜(SEC)純化酶切產物

MBP-hIAPP 融合蛋白經rTEV 酶切反應6 h 后，將反應產物濃縮至500 μL，過0.22 μm 濾膜后進樣．采用GE 公司的凝膠過濾層析柱Superdex 200，柱體積 30 mL，流動相為 20 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl 和1 mmol/L DTT．根據(jù)出峰位置收集相應的產物，凍干純化產物，-80 ℃保存[27]．

1.2.5 Genshare CFAS any KD PAGE 蛋白膠電泳分析與MALDI-TOF 質譜鑒定

根據(jù)Genshare CFAS any KD PAGE 蛋白電泳凝膠制備試劑盒的使用說明書制備蛋白電泳凝膠．取20μL hIAPP 樣品，加5μL 非變性PAGE 蛋白上樣緩沖液．使用超低相對分子質量蛋白marker，相對分子質量范圍為3.3×103～2.01×104，使用前煮沸5～10 min．SDS-PAGE 電泳時采用120 V 電壓，制備的樣品和超低相對分子質量蛋白marker 上樣量均為10μL，電泳至蛋白loading 到凝膠板底部結束．

通過凝膠過濾層析得到的高純度多肽hIAPP 溶液作為樣品，將樣品hIAPP 溶液與多肽基質(HCCA)按照體積 1﹕1 的比例混合，采用 H+模式通過MALDI-TOF 質譜進行相對分子質量鑒定．

2 結果與分析

2.1 MBP-hIAPP融合蛋白表達載體及工程菌的構建

基于hIAPP 的氨基酸序列和TEV 酶切機理設計并構建了MBP-hIAPP 融合蛋白表達載體，如圖1(a)所示．

M.1 kbp marker；1—2.pMAL-hIAPP 轉化大腸桿菌BL21 陽性轉化子為模板的PCR 驗證

為了提高酶切效率，在hIAPP 序列前加入既有剛性且可溶的蛋白片段(NANP)3．根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進行密碼子優(yōu)化，獲得目的DNA 序列 (NANP)3-TEV-hIAPP 為 AATGCCAATCCGAACG CCAACCCGAATGCCAACCCGATTGAAGGCCGCA AATGCAACACCGCAACCTGTGCCACCCAGCGTC TGGCCAACTTTCTGGTGCACAGCAGCAACAACT TTGGCGCCATTCTGAGCAGCACCAATGTGGGCA GCAATACCTAT，優(yōu)化后的基因由蘇州金維智公司合成．

用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切含目的片段的質粒pUC57-hIAPP，并將其克隆到含有相同黏性末端的表達載體pMAL-c2x 連接，并轉化到大腸桿菌JM109. 轉化后過夜培養(yǎng)，挑取單菌落培養(yǎng)后進行雙酶切驗證，驗證正確的質粒送金維智公司測序，測序正確的表達載體命名為pMAL-hIAPP．

將表達載體pMAL-hIAPP 轉化到大腸桿菌表達宿主E.coli BL21(DE3)中，經菌落PCR 驗證(上游引物(EcoRⅠ)NANP-hIAPP-F：CGGAATTCAATGC CAATCCGAATGCCA；下游引物(HindⅢ)hIAPP-R： CCAAGCTTTTAGGCAATCACCACGCC)，PCR 產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1(b)所示，PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳目的條帶大小約為120 bp，與hIAPP基因大小一致，驗證正確的菌株命名為BL21-pMALhIAPP．

2.2 MBP-hIAPP融合蛋白純化及表達條件優(yōu)化

構建好的工程菌BL21-pMAL-hIAPP 經IPTG 誘導發(fā)酵后收集細胞，超聲破碎分別取上清液和沉淀進行SDS-PAGE 凝膠電泳，結果如圖2 所示．

M.蛋白marker. (a)中，1.破碎后沉淀；2.破碎后上清液．(b)中，1.流出液；2.洗滌緩沖液；3.洗脫緩沖液

圖2(a)泳道2 顯示融合蛋白MBP-hIAPP(紅色箭頭)位于細胞破碎液上清液中，證明MBP-hIAPP融合蛋白可溶性表達．融合蛋白先利用直鏈淀粉親和層析純化，將與直鏈淀粉樹脂結合的融合蛋白用20 mmol/L 麥芽糖進行洗脫，最終純化獲得MBPhIAPP(紅色箭頭)融合蛋白，通過SDS-PAGE 電泳分析結果如圖2(b)所示．圖2(b)中第3 泳道有2 個條帶，相對分子質量較大的條帶是融合蛋白 MBPhIAPP，相對分子質量較小的條帶是MBP 蛋白．

為了提高融合蛋白MBP-hIAPP 的表達量，系統(tǒng)研究了溫度和誘導時間對目標融合蛋白質表達的影響．取不同誘導條件下純化后的洗脫液進行SDSPAGE 電泳和灰度分析，結果如圖3 所示．當誘導溫度為13 ℃且A600＝0.4 時，總蛋白表達量與灰度分析中MBP-hIAPP 所占比例的乘積達到最大，即目標蛋白MBP-hIAPP 表達量達到最大．經BCA 試劑盒測定洗脫液蛋白濃度，結合灰度分析數(shù)據(jù)，最終結果得發(fā)酵1 L 菌液可獲得約80 mg MBP-hIAPP 融合蛋白.

M.蛋白marker；1—6 代表不同的誘導條件. 1.13 ℃，A600＝0.3；2.13 ℃，A600＝0.4；3.16 ℃，A600＝0.5；4.16 ℃，A600＝0.4；5.16 ℃， A600＝0.7；6.16 ℃，A600＝0.6

2.3 MBP-hIAPP融合蛋白的rTEV蛋白酶切效果

在16 ℃下利用rTEV 酶對MBP-hIAPP 融合蛋白進行酶切，酶切6 h 時取樣的SDS-PAGE 電泳分析如圖4 所示．從圖4 的泳道2 看出，酶切6 h 時融合蛋白MBP-hIAPP 條帶幾乎完全消失．與之相反，MBP 的含量增加，即MBP-hIAPP 被切成MBP 和hIAPP，并且酶切反應在6 h 以后達到最大酶切比例，與rTEV 說明書上的最大酶切比例時間保持一致．

2.4 SEC凝膠過濾層析純化酶切產物

酶切產物過除菌膜后通過Superdex 200 分子篩凝膠柱進一步純化，最終獲得高純度hIAPP 多肽 (圖5)．

M.蛋白marker；1.0 h；2.6 h

圖5 融合蛋白MBP-hIAPP酶切后的凝膠層析過濾純化Fig. 5 Purification of the fusion protein MBP-hIAPP after gel filtration

根據(jù)凝膠過濾層析原理，相對分子質量大的蛋白先從層析柱里面出來，最后面的峰是hIAPP，收集此處出峰時的樣品，利用Nanodrop 測定hIAPP 濃度并計算出hIAPP 產量為4～6 mg/L．收集的樣品進一步用于Genshare CFAS any KD PAGE 蛋白膠電泳分析和MALDI-TOF 二級質譜鑒定．

2.5 利用蛋白膠電泳和 MALDI-TOF 質譜鑒定hIAPP

凝膠過濾層析得到hIAPP 樣品的SDS-PAGE 電泳結果如圖6 所示．

圖6 凝膠過濾層析得到hIAPP樣品的SDS-PAGE電泳結果 Fig. 6 Results of SDS-PAGE analysis of hIAPP samples obtained with gel filtration chromatography

圖6 中紅色虛線框內的條帶在3.3×103～5.8×103之間，與hIAPP 的相對分子質量一致．SEC 純化分離后的hIAPP 二級質譜鑒定結果如圖7 所示，質核比為3 932.57 處有信號．又因采用H+模式，可計算出此處的蛋白相對分子質量大小是3 931.57，與文獻[19]報道hIAPP 與幾丁質結合域蛋白融合表達的質譜鑒定結果一致．同時，對多肽序列進行了對比，序列一致性為100%．

圖7 純化后hIAPP二級質譜 Fig. 7 Identification of hIAPP secondary mass spectrometry after SEC purification

3 結 語

本研究獲得了一株高產hIAPP 的重組大腸桿菌菌株，以及可溶性表達純化、高產hIAPP 多肽的方法．該方法采用麥芽糖結合蛋白為融合蛋白，實驗證明融合蛋白是可溶性，與文獻[19]采用幾丁質結合域蛋白作為融合標簽相比hIAPP 多肽的產率提高了約2 倍．添加可溶性蛋白片段(NANP)3，并用改進的煙草蝕紋病毒蛋白酶(rTEV)切除MBP 標簽，優(yōu)化酶切條件，最后得到不含任何多余殘基的hIAPP 多肽，經低相對分子質量蛋白膠電泳分析和質譜鑒定確定為hIAPP．此研究可以為以研究hIAPP 的體外聚集用以開發(fā)2 型糖尿病藥物和研究hIAPP 的細胞毒性提供基礎數(shù)據(jù)．另外，本研究也為其他疏水性或有毒性蛋白及多肽在大腸桿菌中的表達提供了思路．