張 震，趙 龍，付 穎，馮玉蓮，尤 興，郭 娜

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

E-選擇素屬于細(xì)胞黏附分子，在炎癥等因子刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)[1]．E-選擇素已經(jīng)被證明在多種癌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附過(guò)程中起重要作用，并介導(dǎo)后續(xù)的腫瘤轉(zhuǎn)移[2]．腫瘤細(xì)胞表面的某些特定結(jié)構(gòu)會(huì)識(shí)別腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的E-選擇素并使腫瘤細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，這是啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞隨血液遷移的第一步，因此E-選擇素可以作為靶標(biāo)，其配體[3-6]則可以發(fā)揮靶向炎癥或靶向腫瘤的作用，同時(shí)有可能阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移．唾液酸化的路易斯x(SLex)是目前公認(rèn)的E-選擇素的天然配體結(jié)構(gòu)，但該寡聚四糖結(jié)構(gòu)與E-選擇素的結(jié)合能力較低，而合成難度卻相當(dāng)大．因此，設(shè)計(jì)合成新型的高效E-選擇素配體十分必要．

除了寡糖結(jié)構(gòu)，文獻(xiàn)中另一類E-選擇素配體為多肽分子，如已報(bào)道的七肽IELLQAR[7]和十二肽DITWDQLWDLMK[8]作為E-選擇素的配體，與糖類配體相比具有結(jié)合力強(qiáng)、合成成本低、易于合成等優(yōu)點(diǎn)．本文以結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的已報(bào)道的E-選擇素肽配體IELLQAR 為出發(fā)點(diǎn)，通過(guò)反轉(zhuǎn)氨基酸序列、在多肽的氨基端或羧基端上載一個(gè)半胱氨酸作為連接橋、D型非天然氨基酸代替這3 種方式來(lái)設(shè)計(jì)多肽序列，并分別測(cè)試其抑制HL60 細(xì)胞與HUVEC 細(xì)胞的黏附活性，以考察不同結(jié)構(gòu)對(duì)多肽活性的影響并尋找更優(yōu)良的多肽分子．同時(shí)，擬將該類配體與抗腫瘤藥物偶聯(lián)，考察其應(yīng)用于藥物的腫瘤靶向和抗腫瘤轉(zhuǎn)移的效果．

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

羥基喜樹堿，化學(xué)純，上海龍翔醫(yī)藥科技有限公司；對(duì)硝基氯甲酸苯酯，化學(xué)純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；9-芴甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)的各種所需氨基酸原料，如Fmoc-異亮氨酸、Fmoc-亮氨酸等，分析純，吉爾生化(上海)有限公司；1，2-乙二硫醇、甲基苯基硫醚、N，N-二異丙基乙胺(DIEA)，分析純，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氘代氯仿，分析純，北京百靈威化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水甲醇(MeOH)，分析純，天津市盛迪達(dá)貿(mào)易有限公司；多聚賴氨酸(MW4000)，分析純，湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司；2-氯三苯基甲基氯樹脂，天津南開和成科技有限公司．

MALDI-Tof 型核磁共振儀，美國(guó)布魯克公司；三用紫外分析儀，上海嘉鵬科技有限公司；冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康儀器有限公司；循環(huán)水式真空泵、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司．

1.2 多肽的合成

多肽的合成采用經(jīng)典的Fmoc 固相合成策略，合成路線如圖1 所示．

具體操作步驟如下：

上載第1 個(gè)氨基酸：稱取1 g(0.35 mmol)2-氯三苯基甲基氯樹脂至于25 mL 反應(yīng)瓶，真空干燥3 h，加入10 mL 無(wú)水DCM，32 ℃攪拌0.5 h，抽濾，將1.4 mmol 的Fmoc-氨基酸和樹脂溶于10 mL 無(wú)水DCM 中，滴加3.15 mmol(520 μL)的DIEA，32 ℃攪拌3 h，滴加0.14 mL 甲醇繼續(xù)攪拌0.5 h，抽濾，10 mL DCM、DMF、MeOH 依次洗滌樹脂各5 min，抽濾，真空干燥．

圖1 多肽的合成路線 Fig. 1 Synthesis of peptides

順序上載剩余氨基酸：上述樹脂用10 mL 30%哌啶的DMF 溶液32 ℃攪拌0.5 h，脫除Fmoc，茚三酮法監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，待反應(yīng)完成后抽濾，用 10 mL DMF、異丙醇、DMF 依次洗滌樹脂各5 min，抽濾，10 mL DMF 加入樹脂中，加入1.05 mmol 的Fmoc-氨基酸、142 mg 1-羥基苯并三唑(HOBT)、398 mg O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，滴加2.1 mmol(347 μL)的DIEA，32 ℃搖床反應(yīng)2.5 h．茚三酮法監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程，反應(yīng)完成后抽濾，用10mL DMF、異丙醇、DMF 依次洗滌樹脂各5 min，抽干，重復(fù)以上過(guò)程，上載不同氨基酸，直至合成目標(biāo)多肽序列．

裂解：配制10 mL 裂解液(苯酚、乙二硫醇、苯甲硫醚、水、三氟乙酸的體積比為 5﹕5﹕2.5﹕5﹕82.5)，將樹脂和裂解液至于反應(yīng)瓶，34 ℃攪拌3 h，將反應(yīng)液濾入100 mL 冷乙醚中，4 000 r/min 離心5 min，收集沉淀物，乙醚洗滌3 次，離心收集沉淀物，氬氣吹干，HPLC 檢測(cè)純度，MALDI-Tof 確定相對(duì)分子質(zhì)量．

1.3 體外抗黏附實(shí)驗(yàn)

多聚賴氨酸(20 μg/mL)包被黑色96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃孵育12 h．內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC 以1×105個(gè)/孔接種于黑色96 孔板，37 ℃孵育36 h 后移去培養(yǎng)基．實(shí)驗(yàn)組加入含有20 ng/mL TNF-α的F-12 培養(yǎng)基，陰性對(duì)照組加入未添加TNF-α的F-12 培養(yǎng)基，37 ℃孵育6 h 使其表達(dá)E-選擇素．收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人急性早幼粒白血病細(xì)胞HL-60(1×105個(gè)/孔)，1 000 r/min 離心 5 min；加入 5 mL PBS 清洗，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液；加入100 μL 1640培養(yǎng)基吹懸，加入20 μmol/L 鈣黃綠素，避光，37 ℃孵育45 min；1 000 r/min 離心5 min，棄上清液；加入1 mL PBS 清洗，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液；加入1640 培養(yǎng)基將沉淀吹懸到所需體積．以1×107個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于加有HUVEC 細(xì)胞的96 孔板中立即加入一定濃度的待測(cè)物，陽(yáng)性對(duì)照組只加入緩沖液，37 ℃避光孵育30 min 后加入PBS 清洗3次，去除未與HUVEC 細(xì)胞結(jié)合的HL-60 細(xì)胞．每孔加入 100 μL 透膜液，檢測(cè)熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)528 nm)．黏附抑制作用與熒光強(qiáng)度成反比例關(guān)系，熒光值越低，說(shuō)明化合物的黏附抑制效果越強(qiáng)．?dāng)?shù)據(jù)用GraphPad Prism 5.0 軟件處理作圖．?dāng)?shù)據(jù)采用SPSS 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行差異性分析，每個(gè)試樣測(cè)3 次，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用post-hocTukey 檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析，*、***分別表示與空白組相比有顯著差異P＜0.05、P＜0.001，###表示對(duì)照組與空白組相比有顯著差異P＜0.001．

1.4 體外細(xì)胞毒活性測(cè)試

MTT 法檢測(cè)化合物13、14、15 和多肽配體1 對(duì)人白血病細(xì)胞K562 和人肝癌細(xì)胞HepG2 的生長(zhǎng)抑制活性．細(xì)胞存活率按照式(1)計(jì)算[9-10]．

2 結(jié)果與分析

2.1 合成的多肽序列及結(jié)構(gòu)確認(rèn)

通過(guò)設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)序列、兩端添加用于連接其他結(jié)構(gòu)的半胱氨酸、使用非天然構(gòu)型的D 型氨基酸這3 種策略，共獲得了12 個(gè)多肽分子(表1)，各個(gè)肽分子經(jīng)HPLC 分析，純度均達(dá)到95%以上，MALDI-Tof 質(zhì)譜顯示其相對(duì)分子質(zhì)量均正確．以進(jìn)一步應(yīng)用的多肽分子1 為例，其HPLC 及MALDI-Tof 圖譜如圖2 和圖3 所示．

表1 多肽的氨基酸序列與構(gòu)型 Tab. 1 Amino acid sequence and structure of peptides

圖2 化合物1的HPLC圖譜 Fig. 2 HPLC of compoud 1

圖3 化合物1的MALDI-TOF圖譜 Fig. 3 MALDI-TOF spectrum of compound 1

2.2 多肽的體外抗黏附活性

E-選擇素多肽配體可以競(jìng)爭(zhēng)性地抑制腫瘤細(xì)胞表面的天然配體與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)的E-選擇素的黏附，從而抑制該黏附作用所導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞遷移．因此，在體外利用表達(dá)E-選擇素配體的腫瘤細(xì)胞HL60 和血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC 建立了抗黏附活性測(cè)試體系，分別測(cè)試了L 型的6 條多肽(1—6)和D 型的6 條多肽(7—12)在體外抑制HL60 細(xì)胞與HUVEC 細(xì)胞黏附作用，其中空白組為未加入TNF-α，對(duì)照組為用TNF-α 刺激但沒有加入任何待測(cè)化合物．多肽終濃度為1μmol/L，實(shí)驗(yàn)(圖4)表明：L 型多肽中在氨基端增加了作為連接橋使用的半胱氨酸后，即CIELLQAR(1)，具有顯著的抗黏附效果；而該濃度下，已報(bào)道的七肽IELLQAR(2)[7]則沒有明顯作用．這也與文獻(xiàn)[7]報(bào)道是相符合的，因?yàn)槠唠? 被報(bào)道其作用強(qiáng)度較弱，IC50為0.2 mmol/L. 而D 型序列多肽(圖5)中發(fā)現(xiàn)了更多的具有明顯抗黏附活性的多肽分子(7、8、10、11 和12)．

圖4 L 型多肽(1—6)抗黏附活性 Fig. 4 Anti-adhesion activities of L-peptides(1-6)

圖5 D 型多肽(7—12)抗黏附活性 Fig. 5 Anti-adhesion activities of D-peptides(7-12)

2.3 多肽與化療藥物HCPT偶聯(lián)物的抗腫瘤活性

由于E-選擇素特異性地在腫瘤部位血管內(nèi)皮高表達(dá)，因此其配體可用作靶標(biāo)分子，將藥物遞送到腫瘤部位的靶點(diǎn)，同時(shí)鑒于E-選擇素在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要作用，其配體還理論上還可阻斷或抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移．為了探索合成的肽配體在抗腫瘤方面的應(yīng)用，選擇原料價(jià)廉且活性較好的L 型多肽CIELLQAR(1)為靶標(biāo)分子，將其通過(guò)3 種連接橋與抗腫瘤藥物羥基喜樹堿相連，得到了偶聯(lián)物13—15 用于評(píng)價(jià)，結(jié)構(gòu)如圖6 所示．

對(duì)上述偶聯(lián)物(13—15)及多肽分子CIELLQAR (1)進(jìn)行體外細(xì)胞毒活性測(cè)試，結(jié)果見表2，偶聯(lián)物13—15 均基本保持了與HCPT 相當(dāng)?shù)幕钚?，而多肽分子本身不具有明顯的細(xì)胞毒活性，一方面說(shuō)明多肽分子的安全性，另一方面也說(shuō)明偶聯(lián)物在培養(yǎng)體系中可以釋放出原藥羥基喜樹堿從而發(fā)揮抗腫瘤作用．

圖6 肽-羥基喜樹堿偶聯(lián)物(13—15)的結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 6 Structures of peptide-HCPT conjugates(13-15)

表2 化合物13—15對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制活性結(jié)果 Tab. 2 Inhibition activity of compounds 13-15 on tumor cells

以活性最好的化合物15 為例，其MALDI-Tof 如圖7 所示，1H NMR 數(shù)據(jù)如下．

圖7 化合物15的MALDI-Tof圖譜 Fig. 7 MALDI-Tof spectrum of compound 15

1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ 8.70(s，1H)，8.23(d，J＝8.8 Hz，2H)，8.12(d，J＝7.6 Hz，1H)，8.00(d，J＝7.2 Hz，2H)，7.93(m，3H)，7.68(d，J＝6.8 Hz，1H)，7.61(s，1H)，7.35 ～6.56(m，7H)，5.56(s，2H)，5.44(s，2H)，4.37 ～4.13(m，8H)，3.50 ～2.95(m，11H)，2.27 ～2.05(m，4H)，1.92 ～1.39(m，16H)，1.20(d，J＝7.2 Hz，3H)，1.08(m，1H)，0.85(m，22H)．

進(jìn)一步的體外抗黏附活性表明，HCPT 本身并不具有抗黏附作用，而多肽分子偶聯(lián)了藥物羥基喜樹堿后(偶聯(lián)物13—15)在1μmol/L 濃度時(shí)仍保留了多肽分子的抗黏附活性(數(shù)據(jù)未列出)．更令人興奮的是，在更低的濃度下(0.3μmol/L)，化合物13 和14 也顯示出了明顯的抗黏附效果(圖8)，說(shuō)明在發(fā)揮藥物抗腫瘤作用的濃度下，偶聯(lián)物同樣具有較好的抑制腫瘤細(xì)胞黏附的作用．

圖8 偶聯(lián)物(13—15)抗黏附活性 Fig. 8 Anti-adhesion activities of conjugates(13-15)

3 結(jié) 語(yǔ)

本文采用固相合成法成功制備了12 個(gè)不同序列的E-選擇素肽配體，并發(fā)現(xiàn)了一系列活性增強(qiáng)的肽分子．在L 型多肽NH2-CIELLQAR-COOH 的基礎(chǔ)上以不同的連接方式與HCPT 進(jìn)行偶聯(lián)，以研究該類配體在抗腫瘤方面的應(yīng)用．其細(xì)胞毒活性和抗黏附活性測(cè)試結(jié)果表明，這些化合物同時(shí)具有較好的黏附抑制活性和對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性．該研究為發(fā)現(xiàn)高效低毒的抗腫瘤靶向藥物和抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物提供了新的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和研究思路．