劉雁霞，劉思佳，王 慧，黃夢(mèng)倩，王 巖，樊振川

(天津科技大學(xué)大健康生物技術(shù)國(guó)家國(guó)際科技合作基地，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

萊茵衣藻(C.reinhardtii)是當(dāng)今國(guó)內(nèi)外研究纖毛結(jié)構(gòu)和組裝的主要模式生物之一，是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的單細(xì)胞真核藻類[1]．纖毛缺失或信號(hào)傳導(dǎo)功能障礙會(huì)造成一系列的疾病，統(tǒng)稱為纖毛病，其中巴德-畢氏綜合征(Bardet-Biedl syndrome，BBS)是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳纖毛病，其常見(jiàn)的癥狀有視網(wǎng)膜變性、腎囊腫、肝臟纖維化、肥胖、先天性心臟病等．目前已鑒定出的基因有21 種[1]．

BBSome 復(fù)合物蛋白主要存在于纖毛膜與纖毛軸絲之間的區(qū)域，可與纖毛膜上的受體結(jié)合，具有信號(hào)傳導(dǎo)作用．BBS1 最初由Mykytyn 發(fā)現(xiàn)，bbs1 是一種常見(jiàn)的BBS 綜合征突變基因，由它引起的突變約占30%，BBS1 可與BBS3b 直接連接，通過(guò)BBS3b與纖毛內(nèi)運(yùn)輸?shù)鞍?IFT)結(jié)合，運(yùn)送至纖毛頂端，參與完成信號(hào)傳導(dǎo)[1-2]．

為進(jìn)一步研究BBSome 與IFT 蛋白的相互作用關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)室需制備檢測(cè)萊茵衣藻內(nèi)BBS1 的抗體，通過(guò)擴(kuò)增bbs1 基因片段，連接至pET-28a(+)表達(dá)載體，表達(dá)融合蛋白6×His-BBS1，獲得多克隆抗體，為進(jìn)一步研究BBSome 與IFT 蛋白的相互作用，以及BBSome 蛋白是如何完成纖毛的信號(hào)傳導(dǎo)作用奠定分子基礎(chǔ)．這也是首次用萊茵衣藻bbs1 全基因序列制備兔抗萊茵衣藻多克隆抗體．

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒及菌株

萊茵衣藻(C.reinhardtii)CC-125 野生型藻種、萊茵衣藻(C.reinhardtii)bbs1 突變型藻種、大腸桿菌(E.coli)XL1-blue、質(zhì)粒pET-28a(+)、感受態(tài)細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存．

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶、蛋白marker，美國(guó)Thermo 公司；100 bp、1 kbp DNA marker、T4 DNA 連接酶由北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒，天津潤(rùn)泰科技發(fā)展有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，美國(guó)Omega Bio-Tek 公司；Protein A SepharoseTMCL-4B 抗體純化介質(zhì)，美國(guó)GE Healthcare 公司；其他試劑與報(bào)道文獻(xiàn)一致[3]．免疫實(shí)驗(yàn)由華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進(jìn)行．

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體構(gòu)建

萊茵衣藻bbs1 cDNA 長(zhǎng)度為1 731 bp，且序列不含BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物序列為F：5′-CCATGCTGCCATCAGTCAAG-3′、R：5′-GGCTCCACCTCCTCCGGCTC-3′，下劃線部分為限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)，由蘇州金唯智生物有限公司合成．bbs1 cDNA 全基因序列通過(guò)PCR 獲得[3]. PCR 產(chǎn)物純化后，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，同時(shí)雙酶切表達(dá)載體pET-28a(+)，分別回收大小為1 731 bp 的目的基因和5 344 bp 的載體片段．回收后將載體和目的基因按照摩爾質(zhì)量1﹕3 的比例室溫連接1 h，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組；轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli)XL1-blue，抗性平板(100 μg/mL 卡那霉素)37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)14～16 h；挑取轉(zhuǎn)化子至液體LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，提質(zhì)粒后BamHⅠ和HindⅢ雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證，正確則測(cè)序．

1.2.2 誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-bbs1 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)方法參照文獻(xiàn)[4]，誘導(dǎo)16～18 h 后，4 ℃、8 000g 離心2 min，收集菌體．加入裂解液/結(jié)合液(50 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑)將菌體重懸(20 mL 裂解液重懸200 mL 菌體)，超聲破碎細(xì)胞．分別收集部分全蛋白，上清液和沉淀進(jìn)行12% SDS-PAGE 電泳，鑒定表達(dá)融合蛋白存在于上清液或沉淀[5]．

1.2.3 蛋白純化

400 mL 菌體高壓破碎后，4 ℃、12 000g 離心20 min，蛋白以包涵體形式存在于沉淀中，棄上清液，將沉淀用裂解液重懸，清洗2 次．用含2 mol/L 尿素的裂解液清洗沉淀2 次后，最終用含8 mol/L 尿素的裂解液將沉淀完全溶解，4 ℃、12 000g 離心20 min，將上清液過(guò)0.22 μm 濾膜與1 mL Ni SepharoseTM6 Fast Flow 填料4 ℃結(jié)合1 h；棄流穿液，再用5 倍柱體積的裂解液(含8 mol/L 尿素)漂洗填料3 次；待漂洗液流干后加入用3 mL 洗脫緩沖液(50 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，8 mol/L 尿素)混勻，靜置10 min 收集洗脫液，將收集到的洗脫液重新加入混勻，重復(fù)3 次，得到最終洗脫液，測(cè)定濃度和純度．

1.2.4 免疫

首次免疫新西蘭大白兔之前用75%酒精擦拭兔子耳部靜脈[6]，插入靜脈抽取陰性血100～200 μL，全血在室溫靜置30～120 min 后，1 500g 離心10 min，收集血清．首次免疫取免疫原400 μg，采用生理鹽水稀釋至200～500 μL，加入等體積的弗氏完全佐劑[7]混勻，形成油包水狀態(tài)．進(jìn)行背部多點(diǎn)皮下注射免疫，每10 d 加強(qiáng)免疫1 次，共加強(qiáng)免疫2 次．加強(qiáng)免疫取 200 μg 免疫原，用生理鹽水稀釋到 200～500 μL，再加入等體積弗氏不完全佐劑；用混勻儀器將溶液和佐劑混勻，形成油包水狀態(tài)．

1.2.5 多克隆抗體效價(jià)測(cè)定

采用間接ELISA 法測(cè)定抗體效價(jià)[4]，用包被液(碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH 9.6)稀釋抗原，終質(zhì)量濃度為2 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃過(guò)夜；后用PBS 洗滌2 次．封閉液(1% BSA 或脫脂奶粉/PBS)封閉，每孔200 μL，37 ℃孵育2 h；后用洗液洗滌1 次．將多抗血清從200 倍開(kāi)始用PBS 作2 倍梯度稀釋，空白對(duì)照為PBS，陰性對(duì)照為陰性血清200 倍稀釋；每孔100 μL，37 ℃孵育1h；洗液洗滌3次，每 次10 min．以1﹕20 000 稀釋比加入二抗，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，洗液洗滌3 次，每次10 min．加入顯色液(1% A 液+10% B 液，A 液為1%TMB 溶于DMSO，B 液為 0.1% H2O2檸檬酸緩沖液)每孔100 μL，顯色時(shí)間為5～15 min；每孔加入50 μL 終止液終止．雙波長(zhǎng)(450 nm、630 nm)測(cè)定吸光度，記錄保存數(shù)據(jù)并作圖分析．多抗血清效價(jià)為1/2 最大吸光度所對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)．

1.2.6 多克隆抗體純化及檢測(cè)

Protein A SepharoseTMCL-4B 純化血清[5]，稀釋至1 mg/mL 后，留存?zhèn)溆茫?0 μg 經(jīng)過(guò)蛋白定量處理的萊茵衣藻上清液蛋白檢測(cè)抗體特異性，進(jìn)行12% SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后以1﹕1 000 的稀釋比孵育多克隆抗體，二抗采用HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG(1﹕10 000 稀釋)，進(jìn)行ECL 顯色．

1.2.7 免疫熒光定位萊茵衣藻中BBS1 蛋白

免疫熒光對(duì)萊茵衣藻內(nèi)BBS1 蛋白定位，固定制片后，于室溫下利用牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h，用純化后的BBS1 多克隆抗體(1﹕10 稀釋比)室溫孵育4 h，用熒光標(biāo)記羊抗兔/小鼠二抗室溫孵育1 h，封片后在熒光顯微鏡下拍照．

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-bbs1 的構(gòu)建

通過(guò)RT-PCR 擴(kuò)增獲得1 731 bp 的bbs1 目的基因，連接至載體后，轉(zhuǎn)化挑取單克隆提取質(zhì)粒并酶切驗(yàn)證．圖1 為C.reinhardtii CC-125 總RNA 提取結(jié)果；圖2(a)顯示PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，條帶單一且大小正確；圖2(b)顯示重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-bbs1 陽(yáng)性克隆雙酶切驗(yàn)證結(jié)果，雙酶切后兩條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果正確，說(shuō)明表達(dá)載體pET-28a(+)-bbs1 構(gòu)建成功．

圖1 C. reinhardtii CC-125總RNA的提取 Fig. 1 Total RNA extraction of C. reinhardtii CC-125

(a) bbs1 基因PCR 擴(kuò)增(b) pET-28a(+)-bbs1 的雙酶切驗(yàn)證 (a)中M. 100 bp DNA marker；1. bbs1 基因PCR. (b)中M. 1 kbp marker；1. pET-28a(+)-bbs1 的BamHⅠ和HindⅢ雙酶切

2.2 6×His-BBS1誘導(dǎo)表達(dá)及純化

融合蛋白6×His-BBS1 由DNAMan 預(yù)測(cè)大小約6.3×104，添加IPTG 誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE 分析顯示，在5.5×104～7.0×104間條帶，表達(dá)量略低，且融合蛋白大多以包涵體形式存在于沉淀中；約1 L 誘導(dǎo)后菌體經(jīng)親和層析純化后蛋白質(zhì)量濃度可達(dá)到0.5 mg/mL，共2.5 mg，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，TBST 脫色后，利用軟件Image J 對(duì)其進(jìn)行灰度分析，純度可達(dá)90%以上，可作為免疫抗原(圖3)．

M.蛋白marker；1.誘導(dǎo)前對(duì)照；2.誘導(dǎo)后全細(xì)胞；3.誘導(dǎo)后上清液蛋白；4.誘導(dǎo)后沉淀蛋白；5.純化后目的蛋白

2.3 抗體的效價(jià)及特異性檢測(cè)

抗血清檢測(cè)參照纖毛內(nèi)運(yùn)輸?shù)鞍譏FT46 抗體制備方法[5]，采用間接ELISA 法測(cè)定，1/2 最大吸光度所對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)為1﹕102 400，因此多抗血清抗血清滴定度達(dá)到 1﹕102 400(圖 4)．對(duì)抗血清進(jìn)行SDS-PAGE 考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)，在5.5×104和 2.5×104處可見(jiàn)較純的抗體重鏈和輕鏈(圖5)．免疫印跡法(Western blot)驗(yàn)證抗血清特異性結(jié)果如圖6所示．

圖4 間接ELISA法測(cè)定抗血清效價(jià) Fig. 4 Determination of anti-BBS1 polyclonal antiserum with indirect ELISA

圖5 抗血清SDS-PAGE純度檢測(cè) Fig. 5 Determination of anti-BBS1 polyclonal antiserum purity with SDS-PAGE

(a)中1. 免疫前陰性血清檢測(cè)萊茵衣藻CC-125；2. Anti-BBS1 多克隆抗體檢測(cè)萊茵衣藻CC-125．(b)中1. Anti-BBS1 多克隆抗體檢測(cè)萊茵衣藻CC-125；2. Anti-BBS1 多克隆抗體檢測(cè)萊茵衣藻bbs1 突變體

經(jīng)免疫印跡實(shí)驗(yàn)分析顯示，純化后的抗血清在 1﹕1 000 的稀釋比下，在6.3×104處可見(jiàn)特異性結(jié)合條帶，而在bbs1 突變體藻株中，無(wú)特異性結(jié)合條帶，由此可知抗血清可與萊茵衣藻BBS1 蛋白發(fā)生特異性結(jié)合(圖6)，表明所制備的多克隆抗體特異性好，靈敏度高．

2.4 BBS1蛋白在萊茵衣藻中的定位

通過(guò)免疫熒光技術(shù)對(duì)萊茵衣藻BBS1 蛋白進(jìn)行定位分析，可通過(guò)熒光信號(hào)看出多克隆抗體可以與萊茵衣藻內(nèi)的BBS1 蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合，且該蛋白可以進(jìn)入萊茵衣藻纖毛內(nèi)，該蛋白在細(xì)胞和纖毛中的分布可通過(guò)野生型藻種中紅色熒光判斷(圖7)．由圖7可知萊茵衣藻中BBS1 蛋白分布于基體部位以及在鞭毛中呈點(diǎn)狀分布．

圖7 免疫熒光檢測(cè)BBS1蛋白在萊茵衣藻纖毛中的定位Fig. 7 Immunofluorescence detection of BBS1 protein localization in C. reinhardtii

3 結(jié) 語(yǔ)

BBSome 復(fù)合物蛋白主要存在于纖毛膜與纖毛軸絲之間的區(qū)域，與纖毛膜上分布的受體存在一定的關(guān)系，對(duì)纖毛的信號(hào)傳導(dǎo)具有極其重要的作用，這也是大部分的BBSome 復(fù)合物蛋白在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)時(shí)，大多以包涵體的形式存在的原因．本文中與His 標(biāo)簽共表達(dá)的BBS1 蛋白也是以包涵體的形式存在，但GST 蛋白促溶與BBS1 融合表達(dá)時(shí)可以以上清液的形式存在．考慮到GST 標(biāo)簽過(guò)大，不易表達(dá)，且標(biāo)簽產(chǎn)生的抗體可能會(huì)影響后續(xù)抗血清的質(zhì)量，因此選用His 標(biāo)簽蛋白與BBS1 融合表達(dá)作為免疫抗原．包涵體蛋白變性純化后可直接免疫，整個(gè)標(biāo)簽大小約為4.3×103，一般不會(huì)影響蛋白的結(jié)構(gòu)和功能；另外，通過(guò)組氨酸與金屬離子(Ni2+)的螯合作用，對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行親和層析純化，方法體系很成熟．

免疫抗原的純度越高所產(chǎn)生的抗血清質(zhì)量越好，由于本次實(shí)驗(yàn)免疫抗原純度達(dá)到90%以上，抗血清在經(jīng)過(guò)一步純化后就能夠特異性地識(shí)別萊茵衣藻內(nèi)的內(nèi)源性BBS1 蛋白，為在萊茵衣藻中深入研究BBSome 復(fù)合物蛋白提供技術(shù)支持，為后續(xù)闡明其作用機(jī)理、纖毛病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)．