干馳 曹清 莫茜 陶悅

兒童軟組織、骨關(guān)節(jié)感染較少，但由于其免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟、免疫功能尚不完善，一旦發(fā)生感染，輕則延長療程，增加患兒痛苦，重則引起相關(guān)急性并發(fā)癥[1]。因此，病原菌的快速、準確鑒定對兒童骨科感染診斷及治療具有重要意義。雖然傳統(tǒng)培養(yǎng)法仍然是目前診斷細菌感染的“金標準”，但其陽性檢出率不高、檢測時間過長，無法完全滿足臨床早期、快速診斷以指導治療的需要[2]。16S rRNA 基因是細菌編碼 16S rRNA 的 DNA 序列，廣泛存在于所有細菌基因組中，每個細菌含 5～10 個拷貝。16S rRNA 含有約 1500 個核苷酸，具有“種”間多態(tài)性、高度的特異性和保守性，因此，利用 16S rRNA 基因序列分析能夠鑒定到屬或種的水平[3-4]。聚合酶鏈式反應 ( polymerase chain reaction，PCR ) 具有簡便、快速、高敏感性及特異性等特點，在細菌檢測中得到了廣泛應用[5-6]，可快速檢測生化反應不典型、生長緩慢或難以培養(yǎng)的細菌[7]。本研究通過比較分析 16S rRNA 基因測序與臨床傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果，以探討 16S rRNA 基因測序應用于兒童骨感染性疾病病原菌快速診斷的臨床價值。

材料與方法

一、一般資料

選擇 2015 年 12 月至 2018 年 1 月間于上海兒童醫(yī)學中心骨科住院治療、臨床考慮骨感染的樣本，同時進行 16S rRNA 基因測序和傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)?；純耗挲g＜18 歲，且患兒家屬對本研究知情，并簽署知情同意書。

二、實驗方法

1. 實驗試劑與儀器：基因組 DNA 抽提試劑盒購自德國 Qiagen 公司 ( QIAamp?DNA Mini Kit，Cat No 51306 )；PCR 試劑 ( Ex Taq?Hot Start Version，Code No RR006A ) 和 DL2000 DNA Marker ( Code No 3427A )均購自日本 TAKARA 公司；Veriti?熱循環(huán)儀 ( 美國Applied Biosystems 公司 )；凝膠成像儀 ( 美國 Bio-Rad 公司 )；Vitek 全自動細菌分析儀及 API 鑒定系統(tǒng) ( 法國生物梅里埃公司 )。

2. 引物的選擇：選用細菌 16S rRNA 基因通用引物 ( 27F：5’-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ )，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

3. 基因組 DNA 的提?。翰杉墓强婆R床樣本按Qiagen 公司基因組 DNA 提取試劑盒操作說明書進行處理。

4. 16S rRNA 基因的 PCR 擴增：PCR 反應體系( 25 μL )：27F ( 10 μmol / L ) 及 1492R ( 10 μmol / L )各 1 μL、DNA 模板 2 μL、TaKaRa Ex Taq HS ( 5U /μL ) 0.2 μL、10×Ex Taq Buffer ( 20 mM Mg2+ plus )2.5 μL、dNTP Mixture ( 各 2.5 mM ) 2 μL、加入滅菌去離子水 16.3 μL。PCR 反應條件為：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 變性 20 s，60 ℃ 退火 20 s，72 ℃ 延伸90 s，共 35 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。

5. PCR 產(chǎn)物電泳及測序：取 PCR 產(chǎn)物 5 μL 于 1%瓊脂糖凝膠電泳。Gel-red 染色后通過凝膠成像儀觀察，PCR 陽性產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司純化后測序，使用 27F 和 1492R 引物雙向測序。

6. 測序結(jié)果分析：將測序所得序列與美國國家生物技術(shù)信息中心 ( National center for biotechnology information，NCBI ) 數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，獲得種屬信息。

7. 傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)：進行 16S rRNA 基因測序的樣本同時進行傳統(tǒng)培養(yǎng)，由上海兒童醫(yī)學中心微生物室專業(yè)人員采用 Vitek 全自動細菌分析儀及 API鑒定系統(tǒng)，按照常規(guī)方法對病原菌進行分離培養(yǎng)鑒定，嚴格按照實驗室檢測標準操作。

三、統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料用例數(shù)或百分率 ( % ) 表示，正態(tài)分布計量資料用±s表示。兩組陽性率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、一般情況描述

30 例臨床懷疑骨感染患兒，平均年齡 ( 5.77±4.52 ) 歲。經(jīng)手術(shù)或穿刺無菌采集 41 例病灶處樣本，其中經(jīng)臨床診斷、實驗室檢查或影像學確診為細菌感染樣本 36 例，畸形或其它非細菌感染樣本5 例 ( 表 1 )。

二、16S rRNA 基因測序與同期培養(yǎng)陽性率的比較

41 例樣本中，16S rRNA 基因測序和同期培養(yǎng)陽性率分別為 69.4% 和 38.9%，具體檢出結(jié)果見表 1。對兩組的結(jié)果進行χ2檢驗，兩者陽性率差異有統(tǒng)計學意義 (χ2＝6.769，P＝0.009 )，提示 16S rRNA 基因測序陽性率顯著高于傳統(tǒng)培養(yǎng)。16S rRNA 基因測序檢測不同類型樣本陽性率相當 ( 骨組織 / 滑膜等組織陽性率為 68.4%，膿液 70.6% )；培養(yǎng)法檢測組織類型樣本陽性率則高于膿液樣本 ( 47.4%vs.29.4% )，但兩者陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05 )( 表 2 )。

三、兒童骨感染 16S rRNA 基因測序病原菌分析

通過 16S rRNA 基因測序發(fā)現(xiàn)，兒童骨感染最常見病原菌為金黃色葡萄球菌 ( 48.0% )，其次為化膿鏈球菌 ( 28.0% ) ( 表 3 )。

四、16S rRNA 基因測序與傳統(tǒng)培養(yǎng)的靈敏度和特異度分析

16S rRNA 基因測序的靈敏度為 69.4%，特異度100.0%，培養(yǎng)的靈敏度為 38.9%，特異度為 100.0%，兩者靈敏度比較差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05 )，而特異度比較差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05 ) ( 表 4 )。

表 1 臨床懷疑骨感染患兒一般情況Tab.1 General description of clinically suspected bone infectious samples

五、16S rRNA 基因測序檢測耗時分析

16S rRNA 基因測序包括基因組提取、PCR 擴增、核酸電泳檢測、測序分析等過程，陰性結(jié)果的平均檢測耗時為 7.50 h，陽性結(jié)果平均檢測耗時24.88 h；傳統(tǒng)培養(yǎng)需增菌培養(yǎng)，陰性和陽性結(jié)果檢測耗時分別為 68.19 h 和 67.50 h。因此，16S rRNA基因測序檢測耗時明顯少于傳統(tǒng)培養(yǎng)法 (P＜0.001 )( 表 5 )。

表 2 16S rRNA 基因測序和同期培養(yǎng)陽性率比較Tab.2 Comparison of the positive rate between 16S rRNA gene sequencing and traditional culture

表 3 兒童骨感染 16S rRNA 基因測序病原菌分析Tab.3 Pathogen analysis of 16S rRNA gene sequencing in bone infection of children

表 4 16S rRNA 基因測序與傳統(tǒng)培養(yǎng)的靈敏度和特異度分析Tab.4 Analysis of sensitivity and specificity of 16S rRNA gene sequencing and traditional culture

表 5 16S rRNA 基因測序與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測耗時比較 (±s，h )Tab.5 Time-consuming comparison between 16S rRNA gene sequencing and traditional culture ( x- ± s, h )

表 5 16S rRNA 基因測序與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測耗時比較 (±s，h )Tab.5 Time-consuming comparison between 16S rRNA gene sequencing and traditional culture ( x- ± s, h )

檢測結(jié)果 16S rRNA 基因測序耗時 培養(yǎng)耗時 P 值陰性 7.50±6.43 68.19±32.92 ＜ 0.001陽性 24.88±4.59 67.50±25.49 ＜ 0.001

討 論

關(guān)于骨感染培養(yǎng)的敏感性說法不一，有研究稱其靈敏度可達到 50.0%[8]。本研究培養(yǎng)法靈敏度為38.9%，敏感性不高的可能原因是本研究中所有患兒在術(shù)前均經(jīng)驗性使用抗菌藥物，且 16S rRNA 基因測序在我國并沒有完全普及，臨床科室可能傾向選擇培養(yǎng)陰性樣本進行測序，導致樣本入組選擇存在偏倚，因此，該傳統(tǒng)培養(yǎng)敏感性不能完全代表傳統(tǒng)培養(yǎng)在骨感染的敏感性。

本研究中，16S rRNA 基因測序靈敏度 ( 69.4% )顯著高于傳統(tǒng)培養(yǎng) ( 38.9% )，顯示其在兒童骨感染的診斷方面較好的應用前景。Zhorne 等[1]分析近5 年相關(guān)文獻，骨科感染病原菌譜系主要有金黃色葡萄球菌和鏈球菌。本研究通過 16S rRNA 基因測序發(fā)現(xiàn)，在兒童骨感染中，主要病原菌是革蘭陽性球菌 ( 金黃色葡萄球菌 48% 和化膿鏈球菌 28% )，與其研究結(jié)果一致。16S rRNA 基因測序可檢出所有傳統(tǒng)培養(yǎng)陽性的病原體，并且 16S rRNA 基因測序還可以檢測出傳統(tǒng)培養(yǎng)陰性的病原體，在臨床少見菌、苛養(yǎng)菌以及固體培養(yǎng)基不生長細菌的鑒定中具有獨特優(yōu)勢。本研究通過 16S rRNA 基因測序方法在 6 例膿液樣本和 1 例滑膜樣本中檢出化膿鏈球菌，1 例膿液樣本中檢出無乳鏈球菌，1 例滑膜樣本中檢出流感嗜血桿菌，2 例組織樣本中檢測到腸道沙門菌，而這 11 例樣本經(jīng)培養(yǎng)均無細菌生長，可能在于這些細菌不適于傳統(tǒng)平板培養(yǎng)，或者樣本采集過程中細菌已死亡，導致培養(yǎng)假陰性的結(jié)果。但本研究局限于例數(shù)較少，有待于進一步擴大樣本驗證基因測序法的優(yōu)勢。本研究還發(fā)現(xiàn)膿液樣本培養(yǎng)陽性率低于組織類型樣本，雖然限于樣本例數(shù)而沒有統(tǒng)計學顯著差異，但也提醒兒童骨感染中優(yōu)先采集組織樣本進行培養(yǎng)，而 16S rRNA 基因測序?qū)τ趦煞N類型樣本檢測陽性率相當，說明基因測序法檢測病原菌受樣本類型影響較小。細菌 16S rRNA 基因測序能夠快速準確鑒定細菌及其種類，耗時短 (＜1 天 )、敏感性高、特異性強、受抗生素影響小[9]。

16S rRNA 基因測序也存在明顯的不足，例如昂貴的儀器、嚴苛的無菌實驗條件、對于測序公司的依賴等都限制了其在基層醫(yī)院廣泛推廣使用。并且 16S rRNA 基因測序?qū)τ诓糠钟H緣關(guān)系較近的細菌無法區(qū)分至屬的水平[10]。本研究中，1 例膿液樣本傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果為陰溝腸桿菌，與之對應的 16S rRNA基因測序結(jié)果為腸桿菌屬，原因在于腸桿菌屬 16S rRNA 基因序列同源性較高。

傳統(tǒng)培養(yǎng)法因其方法簡單，且可以進行藥敏試驗，仍然是骨感染病原菌診斷的“金標準”[11]。而16S rRNA 基因測序較傳統(tǒng)培養(yǎng)具有靈敏度高、耗時短等優(yōu)點，還可以檢測出傳統(tǒng)培養(yǎng)陰性的病原體，在臨床少見菌、苛養(yǎng)菌以及固體培養(yǎng)基不生長細菌的鑒定具有獨特優(yōu)勢，對兒童骨感染病原菌的早期診斷具有一定的應用價值，可作為傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的一個有效補充。